Злитий антикоагулювальний білок тромбомодуліну, який забезпечує спрямоване перенесення до тканинного фактора
Формула / Реферат
1. Злитий антикоагулювальний білок, який включає білок, який забезпечує спрямоване перенесення і взаємодіє із тканинним фактором (TF) або комплексом фактора VIIa/TF, а саме зв'язує TF або комплекс VIIa/TF, і який функціонально зв'язаний із тромбомодуліновим (ТМ) доменом EGF456 або його аналогами та з доменом ТМ, який включає міждоменну петлю між EGF3 й EGF4, причому вказаний злитий білок включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3.
2. Злитий білок за п. 1, де згаданий домен EGF456 містить точкові мутації, які роблять згаданий злитий білок більш стійким до окисного пошкодження або протеазної активності або збільшують каталітичну ефективність згаданого злитого білка.
3. Злитий білок за п. 2, де згаданий домен EGF456 містить принаймні одну точкову мутацію, вибрану із групи, яка складається з H381G, M388L, R456G й H457Q.
4. Злитий білок за п. 3, де згаданий домен EGF456 складається із точкових мутацій H381G, M388L, R456G й H457Q.
5. Злитий білок за п. 1, де згаданий білок, який забезпечує спрямоване перенесення, означає антитіло, яке зв'язує TF.
6. Злитий білок за п. 5, де згадане антитіло означає моноклональне антитіло.
7. Злитий білок за п. 6, де згадане моноклональне антитіло зв'язується з комплексом FVIIa/TF з більш високою спорідненістю, ніж з одним TF.
8. Злитий білок за п. 7, де згадане моноклональне антитіло означає одноланцюгове антитіло, димерне антитіло Fab або IgG антитіло.
9. Злитий білок за п. 8, де згадане моноклональне антитіло означає одноланцюгове антитіло.
10. Злитий білок за п. 6, де згадане моноклональне антитіло функціонально зв'язане більш ніж з одним доменом ТМ.
11. Злитий білок за п. 6, де згадане моноклональне антитіло нейтралізує TF.
12. Злитий білок за п. 1, де згаданий злитий білок глікозильований.
13. Злитий білок за п. 1, де згаданий злитий білок модифікований додаванням поліетиленгліколю.
14. Злитий білок за п. 1, де згаданий злитий білок біотинільований для зв'язування стрептавідину.
15. Фармацевтична композиція, яка включає злитий білок за п. 1 та яка містить фармацевтично прийнятний наповнювач у терапевтично ефективній кількості згаданого злитого білка.
16. Спосіб захисту проти тромбоутворення, який включає введення терапевтично ефективної кількості злитого білка за п. 1, де згаданий злитий білок пригнічує генерацію тромбіну без прямого впливу на інші параметри коагуляції, такі як активація й агрегація тромбоцитів.
17. Спосіб за п. 16, де згаданий спосіб полягає в тому, щоб захистити від тромбоутворення при ішемічному ударі, тромбозних ускладненнях після ангіопластики або операційного втручання на капілярних судинах.
18. Спосіб запобігання й лікування тромбозу глибоких вен (DVT), коагулопатії споживання (DIC), гострого коронарного синдрому або злоякісної пухлини із проявом коагулопатії в пацієнта, який включає введення згаданому пацієнтові терапевтично ефективної кількості злитого білка за п. 1.
19. Набір, який має антикоагулювальну активність та включає злитий білок за п. 1 та придатні допоміжні компоненти.
20. Набір, який має антикоагулювальну активність та включає послідовності ДНК, які кодують компоненти злитого білка за п. 1, та придатні допоміжні компоненти.
21. Композиція для генної терапії, яка включає ДНК, яка кодує злитий білок, який складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3, у комбінації з терапевтично ефективною кількістю вектора для генної терапії.
22. Злитий антикоагулювальний білок, який включає білок, який забезпечує спрямоване перенесення, і взаємодіє з TF або комплексом FVIIa/TF, де згаданий білок забезпечує спрямоване перенесення, означає одноланцюгове антитіло, яке зв'язує TF, який функціонально зв'язаний із тромбомодуліновим (ТМ) доменом EGF456 і міждоменною петлею між EGF3 й EGF4, де згаданий домен EGF456 складається із точкових мутацій при H381G, M388L, R456G і H457Q.
23. Злитий білок за п. 22, де згаданий злитий білок включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3.
Текст
1. Злитий антикоагулювальний білок, який включає білок, який забезпечує спрямоване перенесення і взаємодіє із тканинним фактором (TF) або комплексом фактора VIIa/TF, а саме зв'язує TF або комплекс VIIa/TF, і який функціонально зв'язаний із тромбомодуліновим (ТМ) доменом EGF456 або його аналогами та з доменом ТМ, який включає міждоменну петлю між EGF3 й EGF4, причому вказаний злитий білок включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3. 2. Злитий білок за п. 1, де згаданий домен EGF456 містить точкові мутації, які роблять згаданий злитий білок більш стійким до окисного пошкодження або протеазної активності або збільшують каталітичну ефективність згаданого злитого білка. 3. Злитий білок за п. 2, де згаданий домен EGF456 містить принаймні одну точкову мутацію, вибрану із групи, яка складається з H381G, M388L, R456G й H457Q. 4. Злитий білок за п. 3, де згаданий домен EGF456 складається із точкових мутацій H381G, M388L, R456G й H457Q. 2 (19) 1 3 85996 4 17. Спосіб за п. 16, де згаданий спосіб полягає в тому, щоб захистити від тромбоутворення при ішемічному ударі, тромбозних ускладненнях після ангіопластики або операційного втручання на капілярних судинах. 18. Спосіб запобігання й лікування тромбозу глибоких вен (DVT), коагулопатії споживання (DIC), гострого коронарного синдрому або злоякісної пухлини із проявом коагулопатії в пацієнта, який включає введення згаданому пацієнтові терапевтично ефективної кількості злитого білка за п. 1. 19. Набір, який має антикоагулювальну активність та включає злитий білок за п. 1 та придатні допоміжні компоненти. 20. Набір, який має антикоагулювальну активність та включає послідовності ДНК, які кодують компоненти злитого білка за п. 1, та придатні допоміжні компоненти. 21. Композиція для генної терапії, яка включає ДНК, яка кодує злитий білок, який складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3, у комбінації з терапевтично ефективною кількістю вектора для генної терапії. 22. Злитий антикоагулювальний білок, який включає білок, який забезпечує спрямоване перенесення, і взаємодіє з TF або комплексом FVIIa/TF, де згаданий білок забезпечує спрямоване перенесення, означає одноланцюгове антитіло, яке зв'язує TF, який функціонально зв'язаний із тромбомодуліновим (ТМ) доменом EGF456 і міждоменною петлею між EGF3 й EGF4, де згаданий домен EGF456 складається із точкових мутацій при H381G, M388L, R456G і H457Q. 23. Злитий білок за п. 22, де згаданий злитий білок включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3. Збереження належного балансу між прокоагулювальною й антикоагулювальною активністю у кровоносних судинах істотно для нормального гемостазу (Е. W. Davie й ін., Biochemistry, 30(43), 1991, стор.10363-10370). Порушення балансу в напрямку коагуляції приводить до тромбозів, які можуть викликати серцевий приступ, інсульт, легеневу емболію й венозний тромбоз. Існує необхідність у створенні більш ефективних і безпечних антикоагулянтів для лікування специфічних тромбозних порушень. Тканинний фактор (TF) - це трансмембранний глікопротеїн, який є основним ініціатором каскаду коагуляції (Y. Nemerson, Thromb. Haemost. 74(1), 1995, стор. 180-184). При нормальних фізіологічних умовах TF не контактує із кров'ю. При судинному пошкодженні вплив на кров субендотеліального TF і колагену приводить до активації факторів коагуляції й тромбоцитів і згодом до утворення гемостатичної пробки. Недоречна індукція експресії TF у різних клінічних ситуаціях може привести до тромбозу, який загрожує життю, та/або сприяє патологічним ускладненням. Вплив TF на наступне руйнування тромбоцита вважається відповідальним за тромбозну оклюзію, яка приводить до гострого інфаркту міокарда або інсульту. У цих ситуаціях протизапальні сигнальні шляхи, активовані факторами коагуляції, сприяють також утворенню набряку й збільшенню об'єму інфаркту. Судинне пошкодження, асоційоване з ангіопластикою, приводить до активації TF на клітинах гладенького м'яза (SMC), яка, як вважається, індукує шляхи передачі клітинних сигналів, зв'язані з рестенозом. Понадекспресія TF при раку й грамнегативному сепсисі приводить до тромбозу, який загрожує життю, й активації запальних шляхів. Комплекс факторів Vlla (FVIIa)/TF включається в патогенетичний механізм при різних тромбозних захворюваннях, і циркулюючий рівень TF є чинником ризику для деяких пацієнтів. Фактори Vlla й TF відіграють унікальні ролі при судинному пошкодженні в збереженні гемостазу й ініціації тромбозу. Експресується TF звичайно в адвентиціальній оболонці, але при судинному захворюванні невід повідно активується й експресується в середині й неоінтимі судини. Експресія TF в атеросклеротичних бляшках підвищена й екранована від крові товстим волокнистим шаром, який може руйнуватися, вивільняючи TF. Хірургічні втручання, такі, як балонна ангіопластика, встановлення стента або ендартеректомія, пошкоджують судинну стінку й вивільняють TF, який знаходиться під нею. В атеросклеротичній товстостінній бляшці з високим вмістом ліпідів спонтанне руйнування або ерозія ендотелію приводить до впливу TF і тромбозу, що закінчується нестабільною стенокардією й інфарктом міокарда. TF може циркулювати в мікрочастинках, які походять від клітин, і рівні циркулюючого TF при нестабільній стенокардії є підвищеними, допускаючи припущення про те, що цей циркулюючий TF може сприяти утворенню тромбу (Н. Soejima й ін., Circulation, 99(22), 1999, стор.29082913). Часто злоякісна пухлина асоціюється зі станом гіперкоагуляції, який пояснюють понадекспресією TF на пухлинних клітинах. Це викликає схильність пацієнта до тромбозу глибоких вен, легеневої емболії й низького ступеня коагулопатії споживання (DIC). Коагулопатія споживання приводить до відкладень фібрину в капілярних судинах, сприяючи пошкодженню багатьох органів. Результати, отримані на моделях тромбозу від гострого артеріального порушення, вказують, що засновані на білках інгібітори FVIIa/TF, такі, як інгібітор активного центра фактора Vlla (FVIIai) і інгібітор метаболічних шляхів тканинного фактора (TFPI), є ефективними антитромбозними засобами з меншою крововтратою, у порівнянні з інгібіторами тромбіну й фактора Ха (FXa). Крім того, інгібітори FVIIa/TF перевершують інші антикоагулянти (наприклад, гепарин, інгібітори FXa) у запобіганні утворення потовщення неоінтими й судинного стенозу після порушення, викликаного балонною ангіопластикою (Y. Jang й ін., Circulation, 92(10), 1995, стор.3041-3050). Тромбомодулін (ТМ) - це трансмембранний глікопротеїн, який має антикоагулювальні властивості й переважно експресується на порожнинній поверхні ендотеліально-клітинної вистілки крово 5 носних судин (N.L. Esmon й ін., J. Вiol. Chem. 257(2), 1982, стор.859-864; H.H. Salem й ін., J. Вiol. Chem. 259(19), 1983, стор.12246-12251). Зрілий з повною послідовністю ТМ є модульним білком з 557 амінокислотних залишків, який складається з 5 структурних доменів: N-кінцевої гідрофобної ділянки (залишки 1-226); багатої цистеїном ділянки (залишки 226-462); О-глікозильованної Ser/Thrбагатої ділянки (залишки 463-497); гідрофобної трансмембранної ділянки (залишки 498-521); і Скінцевого цитоплазматичного хвоста (залишки 522-557). Багата цистеїном ділянка включає шість повторюваних структур, гомологічних до попередника епідермального фактора росту (EGF), названого EGF-подібний, EGF-гомологічний або EGFдомени. Багата цистеїном ділянка далі може бути розділена на 3 домени: EGF-подібні повтори 1, 2 й 3 (EGF123, залишки 226-344), міждоменна петля між EGF3 й EGF4 (залишки 345-349) і EGF-подібні домени 4, 5 й 6 (EGF456, залишки 350-462). Функція EGF456 полягає в тому, щоб опосередковувати зв'язування й активацію білка С. Одне дослідження припускає, що п'ятий й шостий EGF-подібні повтори (EGF5, залишки 390-407 й EGF6, залишки 427-462, відповідно) мають здатність зв'язувати тромбін (S. Kurosawa й ін., J. Вiol. Chem. 263(13), 1988, стор.5993-5996); інше припускає, що домену EG456 досить, щоб діяти як кофактор опосередкованої тромбіном активності, яка активує білок С, (М. Zushi й ін., J. Вiol. Chem. 264(18), 1989, стор.10351-10353). Ser/Thr-багатий домен підсилює опосередковане EGF456 зв'язування тромбіну. Третій EGF-подібний повтор (EGF3, залишки 311-344) потрібен для активації інгібітора фібринолізу, який активує тромбін (TAFI). Описано декілька точкових мутантів, які перешкоджають активації TAFI (W. Wang й ін., J. Вiol. Chem. 275(30), 2000, стор.22942-22947). Комплекс тромбін/ТМ перетворює білок С у активований білок С (АРС), який, у свою чергу, руйнує фактори Va й Villa, перешкоджаючи тим самим генерації тромбіну. Отже, ТМ функціонує як молекулярний перемикач, перетворюючи тромбін із прокоагулянту в антикоагулянт. Значення Кm білка із для комплексу тромбін/ТМ знижується 10-кратно, коли ТМ локалізований на поверхні мембрани (C.N. Esmon, ESEB J. 9(10), 1995, стор.946-955). Концентрація білка С у крові (0,065мкМ) значно нижче повідомленого значення Кm (5мкМ) для розчинного комплексу ТМ/тромбін, звідси твердження, що ТМ на прокоагулювальній мембранній поверхні приведе до помітного локального підвищення швидкості генерації білка С. ТМ інгібує тромбоз за механізмом, відмінним від гепарину або його похідних. Гепарин є кофактором антитромбіну III й інгібує як FXa, так і тромбін за антитромбін lll-залежним механізмом. Зв'язаний із тромбом тромбін захищений від дії антитромбіну III, який обмежує антитромбозну ефективність гепарину або гепарину з низькою молекулярною масою (LMWH) на існуючих раніше згустках. Це пояснює відсутність у гепарину або LMWH здатності інгібувати ріст тромбу, що запус 85996 6 кається зв'язаним зі згустком тромбіном або протромбіназою у дослідженнях на приматах, крім людини. На відміну від цього рекомбінантний ТМ ослабляє індуковану згустком генерацію тромбіну й утворення фібрину дозозалежним способом (М. Mohri й ін. Thromb. Haemost. 80(6), 1998, стор.925929). Інгібувальний ефект ТМ анулюється антитілом до білка С. Пригнічення зв'язаної зі згустком прокоагулянтної активності є клінічно актуальним, тому що зв'язана зі згустком прокоагулювальна активність приводить до більш швидкого росту тромбу й в остаточному підсумку до судинної оклюзії або тромбоемболічних ускладнень. Інгібування росту тромбу дозволяє ендогенній фібринолітичній системі видаляти згустки швидше й повністю. Крім того, очікується також, що ТМ більш ефективно, ніж гепарин, при патологічних станах, при яких антитромбін у плазмі знижений, таких, як коагулопатія споживання (DIC). Незважаючи на те, що як ТМ, так і гепарин інгібують поглинання тромбоцитів і фібриногену при експериментальної DIC, тільки ТМ був ефективний, коли рівні антитромбіну III знижувалися. Короткий зміст винаходу Даний винахід забезпечує нові злиті білки, які діють як антикоагулянти й включають білок, який взаємодіє або із тканинним фактором (TF), або з комплексом фактора VIIa/тканинний фактор (FVIIa/TF), і функціонально зв'язаний із тромбомодуліновим (ТМ) доменом EGF456, одним або в комбінації з іншим доменом ТМ, вибраним із групи, яка складається з домену N-кінцевої гідрофобної ділянки, домену EGF123, міждоменної петлі між EGF3 і EGF4 й О-глікозильованого Ser/Thrбагатого домену або їх аналогів, фрагментів, похідних або варіантів. Злитий антикоагулювальний білок за даним винаходом спрямований на й зв'язує TF або комплекс FVIIa/TF у ділянці ушкодження, локалізуючи ТМ у ділянці ушкодження й таким чином, запобігаючи утворенню тромбу й у зв'язку із цим діючи більш ефективно як антикоагулянт, у порівнянні або з розчинним антитілом до TF, або розчинним ТМ, або фрагментами ТМ. Злитий білок більш ефективний, ніж гепарин з низькою молекулярною масою (LMWH) при лікуванні деяких захворювань, включаючи, але без обмеження, сепсис, коагулопатію споживання, ішемічний удар, тромбоз глибоких вен, гострі коронарні синдроми, тромбозні ускладнення після ангіопластики й коагулопатію при прогресуючій злоякісній пухлині. Крім того, злитий білок застосовується в хірургічних операціях на капілярних судинах, у трансплантатах шкіри й вен і при пересадці органів. В іншому аспекті винахід забезпечує фармацевтичні композиції, які включають як об'єкт злиті білки. В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб захисту пацієнта від утворення тромбу, який включає введення згаданому пацієнтові терапевтично ефективної кількості злитого білка, і у зв'язку із цим пригнічення генерації тромбіну без безпосереднього впливу на інші параметри коагуляції, такі, як активація й агрегація тромбоцитів. 7 В іншому аспекті винахід стосується способу запобігання й лікування тромбозу глибоких вен (DVT) або коагулопатії споживання (DIC), або гострого коронарного синдрому, або злоякісної пухлини із проявом коагулопатії в пацієнта, який включає введення згаданому пацієнтові терапевтично ефективної кількості злитого білка. В іншому аспекті винахід стосується способу регулювання запальної відповіді в пацієнта, який включає введення згаданому пацієнтові терапевтично ефективної кількості злитого білка. Ще в одному аспекті злитий білок за винаходом може бути використаний для утворення покриття, яке не є тромбогенним, медичних інструментів, що контактують із кров'ю. В іншому аспекті винахід стосується набору, який містить злитий білок, що включає білок, який забезпечує спрямоване перенесення і зв'язує TF або комплекс FVIIa/TF і домени ТМ. Альтернативно набір може включати послідовності ДНК, які кодують компоненти злитого білка. Розкриваються також способи одержання злитих білків за винаходом як рекомбінантні, так і синтетичні. Опис графіків Фіг.1. Зв'язування антитіла scFv(TF)3e10 з розчинним TF (sTF) збільшує уявну спорідненість sTF до FVIIa. Активаційний аналіз sTF/FVIIa здійснювали, як описано в прикладі 5, під заголовком «Аналіз активації sTF/FVIIa», використовуючи 2нМ FVIIa у присутності й за відсутності 800нМ scFv(TF)3e10. Титрували sTF у пробі, і визначали швидкість розщеплення хромогенного субстрату (S-2266). Значення уявної KD для sTF розраховували, використовуючи стандартну 4-параметричну апроксимацію. Фіг.2. Вимірювання спорідненості зв'язування scFv(TF)3e10 до sTF. Аналіз sTF/FVIIa здійснювали, як описано в прикладі 5, під заголовком «Аналіз активації sTF/FVIIa», використовуючи 3нМ sTF й 2нМ FVIIa. Використана концентрація sTF була нижче значення KD для зв'язування з FVIIa. Зв'язування антитіла scFv(TF)3e10 знижувало значення KD sTF для зв'язування з FVIIa, приводячи до підвищення утворення комплексу sTF/FVIIa й, отже, швидкості розщеплення хромогенного субстрату S2266. Додавали scFv(TF)3e10 при зростаючих концентраціях і підвищену швидкість реакції використали, щоб визначити уявну KD антитіла для sTF, використовуючи стандартну 4-параметричну апроксимацію. Фіг.3. Мікрокалориметричний аналіз показує, що scFv(TF)3e10 має 20-кратну більш високу спорідненість до комплексу sTF/FVIIa, ніж до одного sTF. Комплекс sTF/FVIIa був попередньо отриманий додаванням 2,3-кратного молярного надлишку FVIIai відносно sTF. Гранулометричну ексклюзійну хроматографію використали, щоб підтвердити, що sTF повністю комплексований. Для визначення спорідненості антитіла до комплексу додавали 1,2мкМ комплексу sTF/FVIIa у комірку мікрокалориметра, і 65мкМ антитіла scFv(TF)3e10 додавали в шприц. Для визначення спорідненості антитіла до одного sTF додавали 10мкМ sTF у комірку, і 141мкМ scFv(TF)3e10 додавали в шприц. Аналіз 85996 8 даних проводили, використовуючи програму MicroCal Origin. Дані були апроксимовані до одного сайту зв'язування. Фіг.4. Антитіло scFv(TF)3e10 дозозалежно інгібує аналіз активації фактора X (FX). Деталі аналізу описані в прикладі 5, під заголовком «Аналіз активації фактора X». ІС50 означає дозу, необхідну для досягнення 50% інгібування. Фіг.5. Злитий білок сильніше пригнічує коагуляцію, ніж антитіло TF або один ТМі456. Аналіз протромбінового часу (ПЧ) проводили, щоб порівняти злитий білок з антитілом TF або одним ТМі456. Відповідний об'єм концентрованого інгібітора або антитіла TF (scFv(TF)3e10), ТМі456, або злитого білка (scFv(TF)3e10-TMi456) додавали до 100мкл рекомбінантного людського тромбопластину (Ortho Recombiplastin). Приблизно через 2хв додавали 100мкл відновленої людської плазми. Час коагуляції визначали на коагулометрі Haemoliance. Криві відповіді на дозу одержували для кожного інгібітора й потім використали регресійний аналіз, щоб розрахувати концентрацію (у нМ), необхідну для двократного збільшення часу згортання крові. Фіг.6. Злитий білок зберігає повну кофакторну активність для активації білка С. Аналіз, описаний у прикладі 5, під заголовком «Аналіз (хромогенний) активації білка С», включав 20мкл зразка ТМ або ТМі456, що містив домени EGF4-6 і міждоменну петлю між EGF3 й EGF4, або злитий білок (scFv(TF)3e10-TMi456), 20мкл 1,5мкМ білок С і 20мкл 3нМ a-тромбін. Активації давали можливість проходити протягом 1год. Фазу активації зупиняли шляхом додавання 20мкл 0,16од/мл гірудину. Потім додавали 100мкл 1мМ хромогену S2266, і А405 визначали кожні 10сек протягом 30хв. Швидкість реакції залежить від кількості генерованого активованого білка С. Дані виражені в мп/хв. Фіг.7: Швидкість активації білка С злитим білком підвищується на фосфоліпідних поверхнях, які містять TF. На швидкість активації білка С не впливає додавання везикул TF. Зразок для аналізу, описаного в прикладі 5, під заголовком «Аналіз активації білка С (на TF-багатій поверхні)», містив 20мкл зразка ТМ, або ТМі456, або злитий білок (scFv(TF)3e10-TMi456), 20мкл 1,5мкМ білка С, 20мкл 3нМ a-тромбіну й 20мкл буфера або везикул TF (іновін, людський рекомбінантний TF, 4х нормальна концентрація для ПЧ). Активації давали проходити протягом 1год. Фазу активації зупиняли додаванням 20мкл 0,16од/мл гірудину. Потім додавали 100мкл 1мМ хромогену S2266, і А405 визначали кожні 10сек протягом 30хв. Швидкість реакції залежала від кількості генерованого активованого білка С. Дані виражені в мОГ/хв. Фіг.8: Злитий білок показує більш високу специфічність до індукованої TF коагуляції, ніж ТМі456. Аналіз часткового активованого тромбопластинового часу (ЧАТЧ) чутливий до інгібіторів внутрішнього й центрального метаболічних шляхів коагуляції. Коагуляція, яка відбувається в даному аналізі, незалежна від TF. Інгібітори - або антитіло TF (scFv(TF)3e10), ТМі456, або злитий білок (scFv(TF)3e10-TMi456) - розбавляли в 50мкл від 9 новленої людської плазми до кінцевої концентрації, яка давала двократне збільшення в аналізі протромбінового часу (ПЧ). У коагулометр потім додавали 50мкл реагенту АРТТ (кефалін із кролячого мозку в 0,1мМ елагової кислоти, з буфером, стабілізаторами й консервантами; Alexin HS) і 50мкл розчину СаСl2 (0,02моль/л) і визначали час згортання крові в сек. Фіг.9: Злитий білок сильніше пригнічує індуковану TF коагуляцію цільної крові, ніж будь-який з його компонентів окремо. Коагуляцію цільної крові аналізували, використовуючи аналізатор тромбоеластограф (TEG) Haemoscope. До цільної крові в цитратному буфері додавали 120нМ антитіла TF (scFv(TF)3e10), ТМі456 або злитий білок (scFv(TF)3e10-TMi456) разом з 10мкл тромбопластинового реагенту (розведення 1:64) і 20мкл 0,2Μ СаСl2. Значення R (час до початкового утворення фібрину) одержували для кожного зразка. Дане значення потім перетворювали в % не інгібованого контрольного значення R. Фіг.10. Злитий білок проявляє більш передбачувану дозову відповідь, ніж LMWH, в аналізі коагуляції цільної крові (TEG). До цільної крові в цитратному буфері додавали зростаючі концентрації (15нМ початкова й збільшені за допомогою інкрементів 2х) злиті білки (scFv(TF)3e10-TMi456) або зростаючі концентрації (0,15од/мл початкова й збільшені 2х) еноксапарину (LMWH) поряд з 10мкл тромбопластинового реагенту (розведення 1:64) і 20мкл 0,2Μ СаСl2. Значення R (час до початку утворення фібрину) одержували для кожного зразка й будували графік залежності від відносної концентрації (приймали найнижчу концентрацію за 1 для кожного (подібного значення R), потім наступні концентрації збільшували 2х). Фіг.11. Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 ефективний in vivo на моделі коагулопатії споживання (DIC). Антитіло TF (scFv(TF)3e10) і злитий білок (scFv(TF)3e10-TMi456) оцінювали на щурячій моделі тромбоемболії, описаній в прикладі 8, за (А) відсотком смертності й (Б) кількісним показником поширеність захворювання-смертності. (А) В обробленій наповнювачем групі використана доза TF привела до 60% летальності (LD60). Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 при 0,7нмоль/кг повністю запобігав загибелі. На відміну від цього, scFv(TF)3e10 при 0,7нмоль/кг не впливало на загибель. Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 був більш ефективним, ніж 10-кратна більш висока доза scFv(TF)3e10. (Б) В обробленій наповнювачем групі застосовувана in vivo доза TF приводила до середньої кількісної оцінки поширеності захворювання-смертності в 2,6 бали, заснованій на наступній оцінці в балах: 0 - немає впливу; 1 - слабка дихальна недостатність (відновлення протягом 30хв); 2 - гостра дихальна недостатність (агонуючий стан, відновлення вимагає більш ніж 60хв); і 3 - загибель. Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 дозозалежним чином запобігав індукованій TF загибелі й дихальній недостатності при значенні 50% ефективної дози ED50 0,46нмоль/кг (0,019мг/кг). У дозі 7,0нмоль/кг scFv(TF)3e10-TMi456 повністю запобігав як загибелі, так і дихальній недостатності, а в дозі 0,7нмоль/кг повністю запобігав загибелі 85996 10 й значно зменшував дихальну недостатність. На відміну від цього, scFv(TF)3e10 при 0,7нмоль/кг не впливав на загибель і слабко або зовсім не діяв на дихальну недостатність. Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 був більш ефективний, ніж 10-кратна більш висока доза scFv(TF)3e10. Докладний опис винаходу Злитий антикоагулювальний білок за даним винаходом включає білок, який забезпечує спрямоване перенесення і взаємодіє або із тканинним фактором (TF), або з комплексом фактор VIIa/тканинної фактор (FVIIa/TF), який функціонально зв'язаний з доменом EGF456 тромбомодуліну (ТМ), одним або в комбінації принаймні з іншим доменом ТМ, вибраним із групи, яка складається з N-кінцевого домену гідрофобної ділянки, домену EGF123, міждоменної петлі між EGF3 й EGF4, Оглікозильованого Ser/Thr-багатого домену або їх аналогів, фрагментів, похідних або варіантів. Визначення В описі за даним винаходом визначені наступні терміни, як вказано нижче. Термін «рекомбінантні білки або пептиди» стосується білків або пептидів, отриманих з використанням методик рекомбінантної ДНК, тобто отриманих з мікробних клітин і клітин ссавців, трансформованих за допомогою конструкції екзогенної ДНК, яка кодує необхідний поліпептид. Білки або поліпептиди, експресовані в більшості бактеріальних культур, будуть вільні від глікану. Білки й поліпептиди, експресовані в дріжджових клітинах, мають глікозильовану структуру, відмінну від такої, яка експресується у клітинах ссавців. Термін «нативні» білки або поліпептиди стосується білків або поліпептидів, виділених із природних джерел. Термін «нативний ТМ» буде включати існуючий у природі ТМ і його фрагменти. Термін «кодувальна послідовність» ДНК означає послідовність ДНК, яка транскрибується в мРНК і транслюється в поліпетид у клітині-хазяїні при знаходженні під контролем відповідних регуляторних послідовностей. Межі кодувальної послідовності визначають за допомогою ініціюючого кодону на 5'-N-кінці й трансляційного термінуючого кодону на 3'-С-кінці. Кодувальна послідовність може включати прокаріотичні послідовності, кДНК із еукаріотичною мРНК, геномні послідовності ДНК і синтетичні послідовності ДНК. Послідовність термінації транскрипції звичайно буде розташовуватися в положенні 3' по відношенню до кодувальної послідовності. Термін «злитий білок» означає білок, який виникає в результаті експресії принаймні двох функціонально зв'язаних гетерологічних кодувальних послідовностей. Злитий білок за винаходом складається з білка, який забезпечує спрямоване перенесення і взаємодіє або з TF, або з комплексом FVIIa/TF, який функціонально зв'язаний тільки з доменом EGF456 тромбомодуліну (ТМ) або знаходиться в комбінації принаймні з іншим доменом ТМ, вибраним із групи, яка складається з Nкінцевого домену гідрофобної ділянки, домену EGF123, міждоменної петлі між EGF3 й EGF4, Оглікозильованого Ser/Thr-багатого домену або їх аналогів, фрагментів, похідних або варіантів. 11 Термін «білок, який забезпечує спрямоване перенесення» означає білок, який зв'язується або взаємодіє з іншим білком або білковим комплексом. Білок, який забезпечує спрямоване перенесення, за даним винаходом означає білок, який зв'язується або взаємодіє з TF або комплексом FVIIa/TF. Наприклад, антитіло до TF або до комплексу FVIIa/TF є білком, що забезпечує спрямоване перенесення, за даним винаходом. Двома іншими прикладами білків, які забезпечують спрямоване перенесення, є інгібований за активним центром фактор Vila (FVIIai), який може зв'язувати TF, утворювати неактивний комплекс FVIIai/TF, і інгібітор метаболізму тканинного фактора (TFPI), який може зв'язувати й інактивовувати комплекс FVIIa/TF. Термін «нуклеотидна послідовність» означає гетерополімер з дезоксирибонуклеотидів (основи аденін, гуанін, тимін або цитозин). Послідовності ДНК, які кодують злиті білки за даним винаходом, можуть бути складені із синтетичних фрагментів ДНК, які походять від кДНК, і коротких олігонуклеотидних лінкерів, щоб забезпечити одержання синтетичного гена, який здатний експресуватися за допомогою рекомбінантного вектор експресії. Під час обговорення структури окремих дволанцюгових молекул ДНК послідовності можуть бути описані в контексті відповідно до звичайного правила наведення послідовності тільки в напрямку від 5'кінця до 3'-кінця вздовж не транскрибованого ланцюга кДНК. Термін «рекомбінантний вектор експресії» означає конструкцію реплікованої ДНК, використану для того, щоб або ампліфікувати, або експресувати ДНК, яка кодує злиті білки за даним винаходом. Вектор експресії містить контролюючі послідовності ДНК і кодувальну послідовність. Контролюючі послідовності ДНК включають промоторні послідовності, сайти зв'язування рибосом, сигнали поліаденілування, послідовності термінації транскрипції, розташовані проти ходу транскрипції домени й енхансери. Рекомбінантні системи експресії, як визначено в контексті, будуть експресувати злиті білки при індукції регуляторних елементів. Термін «трансформовані клітини-хазяї» стосується клітин, які були трансформовані й трансфіковані екзогенною ДНК. Екзогенна ДНК може бути або може не бути інтегрована (ковалентно зв'язана) із хромосомною ДНК, що становить геном клітини. Наприклад, у прокаріотах і дріжджах екзогенна ДНК може зберігатися в епісомальному елементі, такому, як плазміда, або стійко інтегрувати в хромосомну ДНК. Що стосується еукаріотичних клітин, то стійко трансформована клітина означає клітину, у якій екзогенна ДНК стала інтегрованою в реплікацію хромосом. Ця стабільність демонструється здатністю ліній або клонів еукаріотичних клітин продукувати популяцію дочірніх клітин, що містять екзогенну ДНК. Термін «тромбомодулін (ТМ)» стосується глікопротеїну поверхні клітин ендотелію, який утворює із високою спорідненістю до комплексу із тромбіном. Гени, які кодують нативний ТМ (як його геномну форму, так й у формі кДНК), були виділені 85996 12 з бичачого й людського джерел і секвеновані (R.W. Jackman й ін., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83(23), 1986, стор. 8834-8838 й R.W. Jackman й ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(18), 1987, стор.6425-6429, обидві посилання включені в контекст шляхом цитування). Послідовності ТМ для бика, людини й миші мають високий ступінь гомології один з одним. У випадку людського ТМ кДНК кодує білок 60,3 кДа з 575 амінокислот, що включає сигнальну послідовність приблизно з 18 амінокислот, див., наприклад, патент US 5827824. Коли тромбін зв'язується із ТМ, може бути тисячекратне або більше збільшення швидкості активації білка С, яка утворює активований антикоагулюючим ферментом білок С. Крім того, коли тромбін зв'язується із ТМ, тромбін більше не працює як прокоагулювальний фермент. А саме, каталізовані тромбіном утворення фібрину, активація фактора V й активація тромбоцитів, - всі інгібуються в присутності ТМ. Таким чином, ТМ перетворює тромбін у фізіологічний антикоагулянт. Термін «тромбомодуліновий (ТМ) домен» стосується дискретної амінокислотної послідовності, яка може бути асоційована з особливою функцією або особливістю ТМ, такою, як структура, характерна для третинної структури. Ген ТМ повної довжини кодує попередник або прополіпептид, який містить наступні домени: амінокислоти 18-1 - сигнальна послідовність; амінокислоти 1-226 - Nкінцева гідрофобна ділянка; амінокислоти 227-462 -багата цистеїном ділянка; складається з 6 тандемних EGF-подібних повторів, з'єднаних невеликими міждоменними пептидами або петлями; амінокислоти 463-497 - О-глікозильована Ser/Thr-багата ділянка; амінокислоти 498-521 -гідрофобна трансмембранна ділянка; і амінокислоти 522-557 - Скінцевий цитоплазматичний хвіст. Багата цистеїном ділянка може бути далі розділена на 3 домени: амінокислоти 226-344 - EGF123, що складається з EGF-подібних повторів 1, 2 й 3 (залишки 226344); амінокислоти 345-349 - міждоменна петля між EGF3 й EGF4; і амінокислоти 350-462 EGF456, що складається з EGF-подібних доменів 4, 5 й 6 (див., наприклад, C.S. Yost й ін., Cell, 34(3): 1983, стор.759-766; D.Z. Wen й ін., Biochemistry, 26(14), 1987, стор.4350-4357, і W. Wang й ін., 2000, див. вище, при цьому всі публікації включені в даний опис як посилання). Терміни «аналог», «фрагмент», «похідне» й «варіант», коли стосуються злитих білків за даним винаходом, а також білків, що забезпечують спрямоване перенесення і доменів ТМ, означають аналоги, фрагменти, похідні й варіанти злитих білків, білків, які забезпечують спрямоване перенесення, і доменів ТМ, які фактично зберігають таку ж біологічну функцію або активність, як описані нижче. Термін «аналог» включає прополіпептид, який містить всередині себе амінокислотну послідовність злитого білка за даним винаходом. Активний злитий білок за даним винаходом може бути відщеплений від додаткових амінокислот, які замикають молекулу попередника злитого білка, за допомогою природних перетворень in vivo або за 13 допомогою методик, добре відомих фахівцям, таких, як ензиматичне або хімічне розщеплення. Наприклад, нативний ТМ природно експресується як поліпептид з 575 амінокислот, який потім піддається процесингу in vivo, вивільняючи активний зрілий поліпептид з 557 амінокислот. Термін «фрагмент» означає частину злитого білка, білка, яка забезпечує спрямоване перенесення, або доменів ТМ, які фактично зберігають однакову функціональну активність, як показано в аналізах in vivo, розкритих у контексті, як описано далі. Термін «похідне» включає всі модифікації злитого білка, які фактично зберігають функції, розкриті в контексті, і включають додаткову структуру із супутньою функцією, наприклад, злиті білки, модифіковані поліетиленгліколем (PEG), які мають більший час напіввиведення, О-глікозильовані злиті білки, модифіковані додаванням сульфату хондроїтину, і біотинільовані злиті білки, як описано далі. Терміни «по суті подібна функціональна активність» й «по суті та ж сама біологічна функція або активність» означають кожний, що інтенсивність біологічної активності знаходиться в інтервалі 30100% або більше від біологічної активності продемонстрованої поліпептидом, з яким проводиться порівняння, коли біологічна активність кожного поліпептиду визначена з використанням тієї ж методики або того ж аналізу. Наприклад, злитий білок або домен ТМ, який має по суті подібну функціональну активність, що й злитий білок прикладу 2 (послідовність із ідентифікаційним номером 2 (SEQ ID No:2)), означає, що білок при тестуванні в аналізі (хромогенному) активації білка С, описаному в прикладі 5, демонструє нагромадження активованого білка С. Білок, який забезпечує спрямоване перенесення і має по суті подібну функціональну активність, що й антитіло до TF прикладу 1 (SEQ ID No:1), означає, що білок при тестуванні в аналізі sTF/FVIIa або в аналізах активації FX, описаних у прикладі 5, демонструє здатність зв'язувати або нейтралізувати TF або комплекс FVIIa/TF. Термін «подібність» між двома поліпептидами визначається шляхом порівняння амінокислотної послідовності і її консервативних амінокислотних замісників одного поліпептиду з послідовністю другого поліпептиду. Такі консервативні замісники включають такі, описані вище в The Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Dayhoff й Argos (1989) EMBO J. 8, 1987, стор.779-785. Наприклад, амінокислоти, які належать до однієї з наступних груп, представляють консервативні зміни: -Ala, Pro, Gly, GLN, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, ILe, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; і -Asp, Glu. Всі інші технічні терміни, використані в контексті, мають таке ж значення, яке використовують фахівці в галузі, до якої належить даний винахід. Білок, який забезпечує спрямоване перенесення 85996 14 Білок, який забезпечує спрямоване перенесення, за винаходом означає білок, який має здатність специфічно зв'язуватися з конкретною попередньо вибраною молекулою-мішенню, наприклад, TF або комплексом FVIIa/TF, і потім служить для направлення злитого білка в клітину або тканину, що містить попередньо вибрану молекулу-мішень. В одному варіанті втілення за даним винаходом білок, який забезпечує спрямоване перенесення, означає антитіло, яке може зв'язуватися й нейтралізувати TF або комплекс FVIIa/TF. Термін «антитіло», як він використаний у контексті, включає інтактні молекули імуноглобуліну (Ig), а також їх фрагменти, такі, як Fab, F(ab’)2 й Fv, які здатні зв'язувати епітоп TF або комплексу FVIIa/TF. Звичайно потрібно принаймні 6, 8, 10 або 12 суміжних амінокислот, щоб утворити епітоп. Однак для епітопів, які включають амінокислоти, які не є суміжними, може знадобитися більше амінокислот, наприклад, принаймні 15, 25 або 50. Звичайне антитіло, яке специфічно зв'язується з TF або комплексом FVIIa/TF зумовлює детектувальний сигнал принаймні 5-, 10- або 20-кратно більш сильний, ніж детектектувальний сигнал, зумовлений іншими білками при використанні в імунохімічному аналізі. Переважно антитіла, які зв'язуються специфічно з TF або комплексом FVIIa/TF не детектують інші білки в імунохімічних аналізах і можуть утворювати імунопреципитат TF або комплексу FVIIa/TF з розчину. TF або комплекс FVIIa/TF можуть бути використані для імунізації ссавця, такого, як миша, щур, кролик, морська свинка, мавпа або людина, щоб продукувати поліклональні антитіла. Якщо потрібно, TF або комплекс FVIIa/TF можуть бути кон'юговані з носієм-білком-носієм, таким, як бичачий сироватковий альбумін, тироглобулін і гемоціанін з Megathura crenulata. Залежно від виду хазяїна можуть застосовуватися різні ад'юванти, щоб підсилити імунологічну відповідь. Такі ад'юванти включають, але без обмеження, ад'ювант Фрейнда, мінеральні гелі (наприклад, гідроксид алюмінію) і поверхнево-активні речовини (наприклад, лізолецитин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, масляні емульсії, гемоціанін з Megathura crenulata і динітрофенол). Серед ад'ювантів, які застосовують у людини, особливо корисними є BCG (bacilli Calmette-Guerin) і Cornybacteriu parvum. Моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з TF або комплексом FVIIa/TF, можуть бути отримані з використанням будь-якої методики, яка забезпечує продукцію молекул антитіл стабільними клітинними лініями в культурі. Ці методики включають, але без обмеження, гібридомну техніку, техніку людської B-клітинної гібридоми й техніку гібридоми вірусу Епштейна-Барра (EBV) (Kohler й ін., Nature 256, 1987, стор.495-497; Kozbor й ін. J. Immunol. Methods 81, 1985, стор. 3142; Cote й ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, стор.2026-2030; і Cote й ін., Mol. Cell Вiol. 62, 1984, стор.109-120). Крім того, можуть бути використані методики, створені для продукції «химерних антитіл», сплайсинг генів мишиного й людського антитіл, щоб 15 одержати молекулу з відповідною антигенною специфічністю й біологічною активністю (Morrison й ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, стор.68516855; Neuberger й ін., Nature 312, 1984, стор.604608; Takeda й ін., Nature 314, 1985, стор.452-454). Моноклональні й інші антитіла можуть бути також «гуманізовані», щоб запобігти в пацієнта формуванню імунної відповіді до антитіл, коли воно застосовується в терапевтичних цілях. Такі антитіла мають достатню подібність із послідовністю людського антитіла, щоб безпосередньо використовуватися в злитому білку, або можуть потребувати зміни декількох ключових залишків. Відмінності в послідовностях між антитілами гризунів і людських послідовностей можуть бути зведені до мінімуму шляхом заміни залишків, які відрізняються від таких у людських послідовностях за допомогою сайтспрямованого мутагенезу окремих залишків або за допомогою трансплантації повністю комплементарних детермінуючих ділянок. Альтернативно гуманізовані антитіла можуть бути продуковані з використанням рекомбінантних способів, як описано в патенті GB 2188638В. Антитіла, які зв'язуються специфічно з TF або комплексом FVIIa/TF, можуть містити антиген-зв'язувальні сайти, які або частково, або повністю гуманізовані, як розкривається в патенті US 5565332. Альтернативно методики, описані для продукування одноланцюгових антитіл, можуть бути адаптовані, використовуючи способи, відомі фахівцям, для продукування одноланцюгових антитіл, які специфічно зв'язуються з TF або комплексом FVIIa/TF. Антитіла з спорідненою специфічністю, але які відрізняються ідіотипічним складом, можуть бути отримані шляхом перестановки ланцюга з випадкових комбінаторних бібліотек Ig (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, стор.1112011123). Одноланцюгові антитіла можуть бути також сконструйовані із застосуванням способу ампліфікації ДНК, такого, як полімеразна ланцюгова реакція, використовуючи гібридомну кДНК як матрицю (Thirion й ін., Eur. J. Cancer Prev. 5, 1996, стор.507511). Одноланцюгові антитіла можуть бути моноабо біспецифічними й можуть бути бівалентними або тетравалентними. Конструкція тетравалентних біспецифічних одноланцюгових антитіл повідомлена, наприклад, Coloma й Morrison Natl. Biotechnol. 15, 1997, стор.159-163. Конструкція бівалентних біспецифічних одноланцюгових антитіл повідомлена Mallendar й Voss J. Вiol. Chem. 269, 1994, стор.199-216. Нуклеотидна послідовність, яка кодує одноланцюгове антитіло, може бути побудована із застосуванням ручного або автоматизованого синтезу нуклеотидів, клонована в конструкцію експресії з використанням стандартних способів рекомбінантної ДНК й введена в клітину, щоб експресувати кодувальну послідовність. Альтернативно одноланцюгові антитіла можуть бути продуковані безпосередньо з використанням, наприклад, техніки відображення ниткоподібного фага (Verhaar й ін., Int. J. Cancer, 61, 1996, стор.497-501; і Nicholls й ін., J. Immunol. Meth. 165, 1993, стор.81-91). 85996 16 Антитіла, які зв'язуються специфічно з TF або комплексом FVIIa/TF, можуть бути також отримані шляхом індукування in vivo продукції в популяції лімфоцитів або шляхом скринінгу бібліотек Ig або панелів реагентів з високою специфічністю зв'язування, як розкривається в літературі (Orlandi й ін., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 86:3, 1989, стор.8333837; Winter й ін, Nature 349,1991, стор.293-299). В іншому варіанті втілення за даним винаходом білок, який забезпечує спрямоване перенесення, є частиною, що забезпечує спрямоване перенесення, іншого, ніж антитіло, білка, який може зв'язувати й нейтралізувати TF. Двома такими прикладами є інгібований за активним центром фактор FVIIa (FVIIai) і інгібітор метаболізму тканинного фактора (TFPI). Як FVIIa, так й FVIIai з високою спорідненістю утворюють комплекс із TF (B.B. Sorenson, B.B й L.V. Rao, Blood Coagul. Fibrinolysis 9 (доп. 1), 1998, стор.67-71). Фактор FVIIai є нейтралізуючим TF антикоагулянтом, який діє, конкуруючи з ендогенним FVIIa за зв'язування з експонованим TF. Фактор FVIIai пригнічує здатність протеолітично активного FVIIa утворювати компетентний комплекс FVIIa-TF і таким способом пригнічує ініціацію коагуляції. Шляхом генетичного злиття доменів ТМ в FVIIai тромбомодулін міг бути націлений на багаті TF протромбозні поверхні. кДНК, яка кодує людський FVII, була виділена й секвенована (H.S. Hagen й ін., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 83(8), 1986, стор.2412-2416, посилання включене в контекст шляхом цитування). Людський FVIIa, який кодується кДНК, може бути отриманий за стандартними методиками рекомбінантної ДНК, виходячи із мРНК, виділеної з печінки людини. Фактор FVIIai може бути отриманий за допомогою зміни серину в активному центрі за стандартними методиками рекомбінантної ДНК або хімічною обробкою каталітично активного FVIIa пептидилхлорметилкетоном, який необоротно модифікує й інгібує активний центр. TFPI націлений на комплекс FVIIa/TF й інгібує його FXa-залежним чином (І. Salemink й ін., J. Biol. Chem. 274(40), 1999, стор.28225-28232). TFPI спочатку зв'язується з FXa, і потім комплекс TFPI-FXa зв'язується з комплексом FVIIa/TF й інгібує його. При генетичному злитті доменів ТМ в TFPI тромбомодулін (ТМ) міг бути націлений на TF-багаті протромбозні поверхні. кДНК, яка кодує людський TFPI, була виділена й секвенована (Т. С Wum й ін., J. Biol. Chem. 263(13), 1988, стор.6001-6004, посилання включене в контекст цитуванням). Людський TFPI, який кодується кДНК, може бути отриманий за допомогою стандартних методик рекомбінантної ДНК, виходячи із мРНК, виділеної з печінки людини. Білок, який забезпечує спрямоване перенесення, за даним винаходом (тобто антитіло або інші відповідні білки) може бути експресований й очищений способами, добре відомими фахівцям. Наприклад, антитіла й білки можуть бути очищені афінним способом шляхом пропускання через колонку, у якій TF знаходиться у зв'язаному стані. Зв'язані антитіла або білки можуть потім елююва 17 тися із колонки з використанням буфера з високою концентрацією солі. В одному переважному варіанті втілення за даним винаходом білком, який забезпечує спрямоване перенесення, є TF-зв'язувальне антитіло scFv, яке пригнічує активацію FX за допомогою комплексу FVIIa/TF і не конкурує зі зв'язуванням FVIIa. Для того щоб одержати TF-зв'язувальне антитіло scFv, бібліотека людських антитіл HuPhaBL3 на ниткоподібній фазі, була відібрана за допомогою іммобілізованого розчинного TF. Антитіла TF-презентуючого фага були понадекспресовані в Е. соlі й афінно очищені з використанням колонки з послідовністю e-tag. Очищені антитіла були далі охарактеризовані, використовуючи ВІАсоrе, аналіз sTF-залежного фактора Vila (аналіз sTF/FVIIa), аналіз активації FX й аналіз протромбінового часу (ПЧ). Послідовність TF-зв'язувального антитіла scFv, позначеного scFv(TF)3e10, показана в прикладі 1 і відповідає SEQ ID NO:1. Виділення, продукція й характеристика TF-зв'язувального антитіла scFv описані більш докладно нижче. Тромбомодулін Тромбомодулінова (ТМ) доменна частина злитого білка діє як кофактор каталізованої тромбіном активації білка С, який, у свою чергу, піддає деградації фактори Va й Vlla, запобігаючи тим самим подальшому тромбоутворенню. Домени ТМ включають, наприклад, домен N-кінцевої гідрофобної ділянки, домен EGF123, міждоменну петлю між EGF3 й EGF4, домен EGF456 і домен Оглікозильованої Ser/Thr-багатої ділянки. Домен EGF456, зокрема, опосередковує зв'язування тромбіну й активацію білка С (S. Kurosawa й ін. (1988), вище; і М. Zushi й ін. (1989), вище). У переважних втіленнях за даним винаходом тромбомодулінова доменна частина злитого білка включає домен EGF456, один або в комбінації з одним доменом або декількома іншими доменами ТМ. У ще більш переважних варіантах втілення за даним винаходом домен EGF456 містить точкові мутації, які роблять білок більше стійким до окисного пошкодження й дії протеаз та/або збільшують каталітичну ефективність. Повна довжина послідовності ДНК, яка кодує людський ТМ, сприяє одержанню генів і використовується як вихідна точка для створення послідовностей ДНК, які кодують пептиди ТМ і злиті білки, які містять ТМ і фрагменти/пептиди ТМ. Ген повної довжини ТМ може бути отриманий декількома способами. Людські геномні бібліотеки комерційно доступні. Олігонуклеотидні зонди, специфічні для цих генів, можуть бути синтезовані з використанням опублікованої генної послідовності. Відомі способи скринінгу геномних бібліотек з олігонуклеотидними зондами. Опубліковані генні послідовності ТМ демонструють, що всередині кодувальної ділянки немає інтронів. Таким чином, геномний клон забезпечує необхідний вихідний матеріал, щоб сконструювати плазміду експресії для ТМ, використовуючи відомі способи. Фрагмент ДНК, який кодує ТМ, може бути повернутий у попередній стан шляхом використання сайтів ендонуклеаз рестрикції, які були ідентифіковані в ділянках, розташованих збоку або які є 85996 18 внутрішніми по відношенню до гена (R.W. Jackman й ін. (1987), вище). Альтернативно гени повної довжини можуть також бути отримані з банку кДНК. Наприклад, матрична РНК, отримана із клітин ендотелію, забезпечує відповідний вихідний матеріал для одержання кДНК. Способи створення банків кДНК добре відомі (дивися, наприклад, J.F. Sambrook й ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), посилання включене в контекст шляхом цитування). Злитий білок Злитий антикоагулювальний білок за даним винаходом включає білок, який забезпечує спрямоване перенесення і зв'язується або з TF, або з комплексом FVIIa/TF і функціонально зв'язаний з доменом EGF456 тромбомодуліну (ТМ), одним або в комбінації принаймні з іншим доменом ТМ, вибраним із групи, яка складається з домену Nкінцевої гідрофобної ділянки, домену EGF123, міждоменної петлі між EGF3 й EGF4 й Оглікозильованого Ser/Thr-багатого домену або їх аналогів, фрагментів, похідних або варіантів. Злитий білок може включати білок, який забезпечує спрямоване перенесення, пов'язаний з доменами ТМ у будь-якій комбінації. В одному особливо переважному варіанті втілення злитий білок включає антитіло, яке зв'язує TF, функціонально зв'язаний із тромбомодуліновим доменом EGF456 і міждоменною петлею між EGF3 й EGF4 (ТМІ456) або їх аналогами, фрагментами, похідними або варіантами. Злитий білок за даним винаходом включає, але без обмеження, конструкції, у яких С-кінцева частина одноланцюгового антитіла з'єднується з N-кінцевою частиною аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, С-кінцева частина антитіла IgG з'єднується з N-кінцевою частиною аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, С-кінцева частина антитіла Fab з'єднується з N-кінцевою частиною аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, N-кінцева частина одноланцюгового антитіла з'єднується із Скінцевою частиною аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену TM, N-кінцева частина антитіла IgG з'єднується із С-кінцевою частиною аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, N-кінцева частина антитіла Fab з'єднується із С-кінцевою частиною аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, більш ніж одне одноланцюгове антитіло з'єднується як з N-кінцевою, так і з С-кінцевою частинами аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, більш ніж одне антитіло IgG з'єднується як з N-кінцевою, так й з Скінцевою частинами аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, більш ніж одне антитіло Fab з'єднується як з N-кінцевою, так і з Скінцевою частинами аналога, фрагмента, похідного або варіанта домену ТМ, більш ніж один аналог, фрагмент, похідне або варіант домену ТМ з'єднується як з N-кінцевою, так і із С-кінцевою частинами одноланцюгового антитіла, більш ніж один аналог, фрагмент, похідне або варіант домену ТМ з'єднується як з N-кінцевою, так і із С-кінцевою частинами антитіла IgG, більш ніж один аналог, фрагмент, похідне або варіант домену ТМ з'єдну 19 ється як з N-кінцевою, так і із С-кінцевою частинами антитіла Fab, один або більше ніж один аналог, фрагмент, похідне або варіант домену ТМ з'єднується як з N-кінцевою, так і із С-кінцевою частинами димерного одноланцюгового антитіла. Злиті білки за даним винаходом включають злиті білки прикладу 2 (SEQ ID NO:2) і 3 (SEQ ID NO:3), а також ті злиті білки, які мають несуттєві відхилення в послідовності від них. Термін «несуттєве відхилення» включає будь-яку послідовність, заміщення або делеційний варіант, які зберігають у значній мірі принаймні одну біологічну функцію поліпептидів за даним винаходом, переважно кофакторну активність для опосередкованої тромбіном активації білка С. Ці функціональні еквіваленти можуть переважно включати злиті білки, які мають принаймні приблизно 90% ідентичність зі злитими білками SEQ ID Nos:2 або 3, і більш переважно - принаймні 95% ідентичність із злитими білками SEQ ID Nos:2 або 3 і ще більш переважно - принаймні 97% ідентичність зі злитими білками SEQ ID Nos:2 або 3, і також включають частини таких злитих білків, які мають значною мірою таку ж біологічну активність. Однак будь-який злитий білок, який має несуттєве відхилення в амінокислотній послідовності від злитих білків SEQ ID Nos:2 або 3, який проявляє функціональну еквівалентність, як описано далі в контексті, включений в опис за даним винаходом. В іншому варіанті втілення винаходу злитий білок включає антитіло, яке зв'язує TF, функціонально зв'язаний із тромбомодуліновим (ТМ) доменом EGF3, який потрібен для активації інгібітора активованого тромбіном фібринолізу (TAFI). Аналоги, фрагменти, похідні й варіанти Аналог, фрагмент, похідне або варіант злитих білків, а також білки, які забезпечують спрямоване перенесення, і домени ТМ за даним винаходом можуть бути: (і) одним, у якому один або декілька амінокислотних залишків заміщені консервативним або неконсервативним амінокислотним залишком (переважно консервативним амінокислотним залишком), і такий заміщений амінокислотний залишок може або не може бути залишком, кодованим за допомогою генетичного коду; або (іі) одним, у якому один або декілька амінокислотних залишків включають замісник; або (ііі) одним, у якому зрілий злитий білок з'єднується з іншою сполукою, такою, як сполука для збільшення часу напіввиведення злитого білка (наприклад, поліетиленгліколь); або (iv) один, у якому додаткові амінокислоти з'єднані зі зрілим злитим білком, таким, як лідерна або секреторна послідовність, або послідовність, яка використовується для очищення зрілого злитого білка; або (ν) одним, в якому поліпептидна послідовність з'єднана з більше довгим поліпептидом, тобто людським альбуміном, антитілом або білком Fc, для збільшення тривалості ефекту. Вважається, що такі аналоги, фрагменти, похідні й варіанти доступні фахівцеві в даній галузі з повідомлень у контексті. Переважно похідні за даним винаходом будуть містити консервативні амінокислотні заміщення (визначені нижче), зроблені в одному або декількох прогнозованих залишках, переважно в залиш 85996 20 ках замінних амінокислот. Термін «замінний» амінокислотний залишок означає залишок, який може змінюватися в білковій послідовності дикого типу без зміни біологічної активності, тоді як «незамінний» амінокислотний залишок необхідний для біологічної активності. Термін «консервативне амінокислотне заміщення» означає заміщення, при якому амінокислотний залишок заміняється амінокислотним залишком, який має подібний боковий ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, які мають подібні бокові ланцюги, визначені в даній галузі. Ці сімейства включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними боковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), b-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Неконсервативні заміщення не проводяться для консервативних амінокислотних залишків або амінокислотних залишків, які розташовуються всередині консервативного білкового домену, якщо неконсервативні заміщення не проводяться, щоб зробити злитий білок, що утворюється, більш стійким до окисного пошкодження й дії протеаз та/або підвищити його каталітичну ефективність. Фрагменти біологічно активних частин включають поліпептидні фрагменти, які придатні для застосування як лікарський засіб, як реагент для досліджень і тому подібного. Фрагменти включають пептиди, які містять амінокислотні послідовності, подібні до амінокислотних послідовностей або які походять від амінокислотних послідовностей злитого білка за даним винаходом й принаймні мають активність того поліпептиду, але які включають менше амінокислот, ніж поліпептид повної довжини, розкритий у контексті. Звичайно біологічно активні частини включають домен або мотив принаймні з активністю поліпептиду. Біологічно активна частина поліпептиду може бути пептидом, тобто, наприклад, довжиною в 5 або більше амінокислот. Такі біологічно активні частини можуть бути отримані синтетично або за допомогою рекомбінантних методик і можуть бути оцінені на одну або декілька функціональних активностей поліпептиду за даним винаходом способами, розкритими в контексті та/або добре відомими фахівцям. Більш того, переважні похідні за даним винаходом включають зрілі злиті білки, які з'єднані з іншою сполукою, такою, як сполука для збільшення часу напіввиведення поліпептиду та/або для зниження потенціалу імуногенності поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь, PEG). Поліетиленгліколь може застосовуватися, щоб надати злитому білку розчинність у воді, габарити, малу швидкість ниркового кліренсу й знижену імуногенність. Дивися, наприклад, патент US 6214966. У випадку модифікації поліетиленгліколем з'єднання злитого 21 білка з PEG може бути виконано будь-якими способами, відомими фахівцям у цій галузі. Наприклад, модифікація поліетиленгліколем може бути здійснена спочатку введенням цистеїнової мутації в злитий білок з наступним одержанням похідного з PEG-малеімідом. Цистеїн може бути доданий до С-кінця пептидів. Дивися, наприклад, Tsutsumi й ін., Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 97(15), 2000, стор.8548-8553. Інша модифікація, яка може бути проведена зі злитим білком, включає біотинілювання. У деяких випадках може бути корисним мати біотинільований злитий білок, щоб він міг легко реагувати зі стрептавідином. Способи біотинілювання білків добре відомі фахівцям. Крім того, зі злитим білком може бути зв'язаний сульфат хондроетину. Варіанти злитих білків, білків, які забезпечують спрямоване перенесення, і доменів ТМ за винаходом включають поліпептиди, які мають амінокислотну послідовність, значною мірою подібну до амінокислотної послідовності вихідних злитих білків, білків, що забезпечують спрямоване перенесення, і доменів ТМ. Термін «подібні» означає першу амінокислотну послідовність, яка містить достатнє або мінімальне число ідентичних або еквівалентних амінокислотних залишків відносно другої амінокислотної послідовності, так що перша й друга амінокислотної послідовності мають загальний структурний домен та/або загальну функціональну активність. Наприклад, амінокислотні послідовності, які містять загальний структурний домен, що ідентичний принаймні приблизно на 45%, переважно приблизно на 75-98%, визначаються в контексті як ідентичні. Переважно варіанти будуть подібні до амінокислотної послідовності переважних злитих білків за даним винаходом. Варіанти включають варіанти злитих білків, які кодовані полінуклеотидом, що гібридизується з полінуклеотидом за даним винаходом або комплементарний до нього в жорстких умовах. Такі варіанти, як правило, зберігають функціональну активність злитих білків за даним винаходом. Бібліотеки фрагментів полінуклеотидів можуть бути використані, щоб одержувати різноманітну популяцію фрагментів для скринінгу й наступної селекції. Наприклад, бібліотека фрагментів може бути отримана обробкою з нуклеазою отриманого ПЛР дволанцюгового фрагмента полінуклеотиду в умовах, де одноланцюговий розрив відбувається тільки приблизно один раз на молекулу, денатурацією дволанцюгової ДНК, ренатурацією ДНК, щоб утворити дволанцюгову ДНК, яка може включати смислові/антисмислові пари від різних продуктів з одноланцюговим розривом, видаленням одноланцюгових частин від реформованихдуплексів шляхом обробки з нуклеазою S1 і літуванням утвореної бібліотеки фрагментів у вектор експресії. Цим способом можна одержати бібліотеку експресії, яка кодує N-кінцевий і внутрішній фрагменти злитих білків різної величини за даним винаходом. Варіанти включають злиті білки, а також білки, які забезпечують спрямоване перенесення, і домен ТМ, які відрізняються за амінокислотною послідовністю через мутагенез. Варіанти, які мають 85996 22 кофакторну активність для опосередкованої тромбіном активації білка С, можуть бути ідентифіковані за допомогою скринінгових комбінаторних бібліотек мутантів, наприклад, відсікання або точкові мутанти злитих білків або доменів ТМ за даним винаходом й використанням аналізу активації білка С, описаного в прикладі 5. Варіанти, які мають активність зв'язування TF або комплексу FVIIa/TF, можуть бути ідентифіковані за допомогою скринінгових комбінаторних бібліотек мутантів, наприклад, розщеплення або точкові мутанти злитих білків або білків, які забезпечують спрямоване перенесення, за даним винаходом з використанням аналізу sTF/FVIIa або аналізи за активації FX прикладу 5, описані в прикладі 5. Крім того, біоеквівалентні аналоги злитих білків можуть також бути утворені шляхом проведення різних заміщень за залишками або послідовностями у доменній частині ТМ злитого білка, які можуть зробити злитий білок більш стійким до окисного пошкодження або дії протеази, дивися, наприклад, патент US 5827824, або збільшити каталітичну ефективність злитого білка, дивися, наприклад, М. Adler й ін., J. Biol. Chem. 270(40), 1995, стор.23366-23372 і заявку WO 01/98352, опубліковану 27.12.2001, усе повністю включено в контекст шляхом цитування. В одному варіанті втілення винаходу різноманітна бібліотека варіантів генерується шляхом комбінаторного мутагенезу на рівні нуклеїнових кислот і кодується різноманітною генною бібліотекою. Різноманітна бібліотека варіантів може бути отримана, наприклад, ензиматичним літуванням суміші синтетичних олігонуклеотидів у генні послідовності таким чином, що вироджений набір потенційних варіантних амінокислотних послідовностей експресується у вигляді індивідуальних поліпептидів, або альтернативно у вигляді набору злитих білків більшої довжини (наприклад, для розгортання фага), що містять набір їх послідовностей. Існує багато способів, які можуть застосовуватися для одержання бібліотек потенційних варіантів їх виродженої олігонуклеотидної послідовності. Хімічний синтез виродженої генної послідовності може бути здійснений в автоматичному синтезаторі ДНК, і потім синтетичний ген вбудовують у відповідний вектор експресії. Застосування виродженого набору генів допускає забезпечення в одній суміші всіх послідовностей, які кодують необхідний набір потенційних варіантних послідовностей. Способи синтезу вироджених олігонуклеотидів відомі фахівцям (дивися, наприклад, Narang, Tetrahedron 39, 1983, с. 3; Itakura й ін., Annu. Rev. Biochem. 53, 1984a, с.323; Itakura й ін., Science 198, 1984b, с.1056; Ike й ін., Nucleic Acid Res. 11, 1983 с.47). Фахівцям відомі декілька методик скринінгу генних продуктів комбінаторних бібліотек, отриманих за допомогою точкових мутацій або розщеплення, і скринінгу бібліотек кДНК для генних продуктів, які мають вибрану властивість. Такі методики адаптуються для швидкого скринінгу генних бібліотек, отриманих шляхом комбінаторного мутагенезу злитих білків, а також білків, що забезпечують спрямоване перенесення, і доменів ТМ, на кофакторну активність опосередкованої 23 тромбіном активації білка С або активності зв'язування TF або комплексу FVIIa/TF. Найбільш широко застосовувані методики, які підлягають аналізу з високою пропускною здатністю для скринінгу більших генних бібліотек, звичайно включають клонування генної бібліотеки в репліковані вектори експресії, трансформацію відповідних клітин з утворюваною бібліотекою векторів й експресію комбінаторних генів в умовах, при яких детектування необхідної активності сприяє виділенню вектора, який кодує ген, чий продукт був детектований. Рекурентний груповий мутагенез (REM), методика, яка підвищує частоту функціональних мутантів у бібліотеках, може бути застосований у комбінації зі скринінговими аналізами, щоб ідентифікувати необхідні варіанти. Одержання злитих білків Злитий білок за винаходом одержують з'єднанням білка, що забезпечує спрямоване перенесення, або інакше - зв'язуванням його з доменами ТМ або їх аналогами, фрагментами, похідними або варіантами будь-яким способом, відомим фахівцям у цій галузі. Два компоненти можуть бути хімічно зв'язані разом за допомогоюбагатьох добре відомих хімічних методик. Наприклад, зв'язок може бути утворений за допомогою гетеробіфункціональних місточкових лінкерів, наприклад, Nсукциніміділ-3-(2-піридилдитіо)пропіонату (SPDP), карбодііміду, глутарового альдегіду й тому подібного. У більш переважному варіанті втілення білок, який забезпечує спрямоване перенесення, за даним винаходом може бути з'єднаний з доменами ТМ рекомбінантними способами, такими, як використання методик рекомбінантної ДНК для одержання нуклеїнової кислоти, яка кодує як білок, який забезпечує спрямоване перенесення, так і поліпептид, який кодує домени ТМ, і експресія послідовності ДНК у клітині-хазяїні, такій, як Е. соlі або клітині ссавця. ДНК, яка кодує злитий білок, може бути клонована в кДНК або в геномній формі за допомогою будь-якої методики клонування, відомої фахівцям у цій галузі. Дивися, наприклад, J.F. Sambrook й ін. (1989), вище. У випадку, коли білок, який забезпечує спрямоване перенесення, є антитілом, якщо була ідентифікована послідовність ДНК, яка кодує ділянку Fv, що при експресії проявляє специфічну зв'язувальну активність, злиті білки, які включають цю ділянку Fv, можуть бути отримані способами, відомими фахівцеві. Так, наприклад, V.K. Chaudhary й ін., Nature 339(6223), 1989, стор.394-397; J.K. Batra й ін., J. Biol. Chem. 265(25), 1990, стор.1519815202; J.K. Batra й ін. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(21), 1989, стор.8545-8549; V.K. Chaudhary й ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(3) 1990, стор.10661070, всі публікації, включені шляхом цитування, описують одержання злитих білків на основі різних одноланцюгових антитіл. Ділянка Fv може бути з'єднана безпосередньо з доменами ТМ або може бути зв'язана за допомогою лінкерної послідовності. Лінкерна послідовність може бути присутня просто для того, щоб забезпечити простір між частиною, яка забезпечує спрямоване перенесення, і доменами ТМ або сприяти мобільності між цими 85996 24 ділянками, щоб дати можливість кожному з них досягти своєї оптимальної конформації. Послідовність ДНК, яка включає з'єднувальний фрагмент, може також забезпечити послідовності (такі, як праймерні або рестрикційні сайти) для сприяння клонуванню або може зберігати рамку зчитування між послідовністю, яка кодує частину, що забезпечує спрямоване перенесення, і послідовністю, яка кодує домени ТМ. Створення таких сполучних пептидів добре відомо фахівцям у даній галузі. За даним винаходом лінкерні послідовності можуть застосовуватися для зв'язування білка, який забезпечує спрямоване перенесення, з доменами ТМ. В одному переважному варіанті втілення за даним винаходом дві лінкерні послідовності застосовуються в створенні конструкції злитого білка, який складається з одноланцюгового антитіла й тромбомодулінового (ТМ) домену EGF456 і міждоменної петлі між EGF3 й EGF4 (ТМі456). Перша зв'язує важкий і легкий домени одноланцюгового антитіла. Перша лінкерна послідовність має довжину з 5 амінокислот. Буде очевидним, що можуть застосовуватися й інші короткі лінкерні послідовності, від 0 до 10 амінокислот. Другий лінкер за даним винаходом є лінкером з 15 амінокислот, що зв'язує антитіло з доменами ТМ. Буде очевидним для фахівців у даній галузі, що багато різних лінкерних послідовностей можуть використовуватися й так само приводити до злитого білка, який зберігає антикоагулювальну активність і здатність до активації білка С Модифікації існуючого лінкера будуть ставити своєю метою найбільше посилення активації білка С на фосфоліпідних поверхнях, які містять TF. У переважному підході одноланцюгове антитіло одержували, використовуючи фагову дисплейну бібліотеку. На першому етапі конструювання фагової дисплейної бібліотеки гени (VH (з IgM), VK й VL) були за допомогою ПЛР клоновані від об'єднаної мРНК із людського кісткового мозку, лімфатичного вузла й селезінки, використовуючи набір сімейства специфічних праймерів. Утворені бібліотеки pCITE-VH (3.8´109 членів), pZ604-VK (1.6´107) і pZ604-VL (3.2´107) представляють перманентну й велику розмаїтість генів V. Гени VH були ампліфіковані за допомогою бібліотеки pCITE-VH. Гени VK й VL були ампліфіковані за допомогою ПЛР від бібліотеки pZ604-VK й pZ604-VL із зворотною JH і лінкерною послідовністю на 5'-кінці. Очищені в гелі VH, VK й VL, які містять продукти ПЛР, були потім піддані спільному сплайсингу, щоб одержати набір генів scFv. Набір генів scFv клонували у фагмідний вектор р603, і продукт лігування електропорували в компетентні клітини Е. соlі TG1, щоб одержувати фагову дисплейну бібліотеку scFV, HuPabL3, з 5,2´109 індивідуальних трансформантів (В.К. Kay й ін., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; J.D. Marks й ін, J. Mol. Вiol. 222(3), 1991, стор.581-597; M.D. Sheets й ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11), 1998, стор.6157-6162). В переважному варіанті втілення за даним винаходом одержували одноланцюгове антитіло (scFv(TF)3e10), яке мало один зв'язувальний сайт VH/VL для TF. Амінокислотна послідовність 25 scFv(TF)3e1O (SEQ ID NO:1) зображена в прикладі 1. У переважному варіанті втілення за даним винаходом фрагмент ПЛР, який містить послідовність ТМi456 (з мутаціями M388L й H381G), фланковану за допомогою сайтів Notl, субклонували в сайт Notl вектора р612/3е10 (бактеріальний вектор експресії для scFv(TF)3e10, заснований на pCANTAB5 від Pharmacia). У контексті точкові мутації в частинах ТМ злитих білків за винаходом позначаються однобуквеним символом амінокислотного залишку нативного ТМ, що супроводжується номером положення амінокислотного залишку в зрілому ТМ й однобуквеним символом амінокислотної мутації. Наприклад, M388L вказує на те, що метіонін у положенні 3888 амінокислоти зрілого ТМ замінений лейцином. Сайт Notl розташований між послідовністю антитіла й послідовністю e-tag. Це дозволяє одержати бактеріальну конструкцію експресії (рКМ101) для злитого білка, що складається з scFv(TF)3e10 - лінкера з 15 амінокислот ТМі456 і послідовність e-tag. Щоб одержати вектор експресії для ссавця, фрагмент ПЛР спочатку одержували на матриці рКМ101. Цей фрагмент був створений для вбудовування в сайти Stu1/Msc1 тромбомодулінового вектора експресії pTHR525. Це дозволило одержати вектор (рКМ113), який мав сигнальну послідовність Solulin, послідовність зрілого злитого білка, послідовність e-tag. Вектор містить ген стійкості до ампіциліну й селектовані маркери гігроміцину й дигідрофолатредуктази (DHFR). Експресія запускається промотором MPSV LTR. Сайт-специфічний мутагенез здійснювали на даному векторі, щоб включити мутації R456G й H457Q, які надають частині ТМ стійкість до протеази. Утворений вектор позначали як рКМ115. Вектор рКМ115 містив лінкер з 15 амінокислот, який розділяє домени VH й VL, і інший лінкер з 15 амінокислот, який відокремлює домен VL від ТМі456. Лінкер, який розділяє VH й VL, був зменшений до 5 амінокислот, щоб провести утворення димера більше високої авідности, позначеного як рНМ115,5. Злитий білок, кодований рНМ115,5, scFv(TF)3e10-TMi456 (SEQ ID NO:2), зображений у прикладі 2. Додатковий вектор рКМ125 генерували, використовуючи стандартні методики рекомбінантної ДНК, шляхом видалення 3 амінокислот (GAP) між лінкером з 5 амінокислот, які розділяють домени VH й VL, і видалення e-tag на С-кінці злитого білка. Утворений злитий білок, scFv(TF)3e10TMi456A (SEQйID NO:3), зображений у прикладі 3. Експресія очищення злитих білків Існує декілька шляхів, щоб експресувати рекомбінантні злиті білки in vitro, включаючи Ε. coli, бакуловіруси, клітини дріжджів і ссавців або інші системи експресії. Способи експресії клонованих генів у бактеріях добре відомі. Щоб одержати високий рівень експресії клонованого гена в прокаріотичній системі, необхідно створити вектори експресії, які містять як мінімум сильний промотор, щоб направляти терминацію транскрипції мРНК. Прикладами регуляторних ділянок, які підходять для цієї мети, є промоторна й операторна ділянка гена b-глюкозидази Е. coli, біосинтетичний шлях триптофану Е. coli або лівий промотор фага l. 85996 26 Корисним є включення селектованих маркерів у вектори ДНК, які трансформують в Е. coli. Приклади таких маркерів включають гени, які визначають стійкість до ампіциліну, тетрацикліну або хлорамфеніколу. Існує багато клітинних систем, які можуть бути використані для відбору еукаріотичних клітинних систем, найбільш придатних для експресії злитих білків й їх аналогів. Ілюстративні приклади ліній клітин ссавців включають, але без обмеження, клітини RPMI 7932, VERO й HeLa, лінії клітин яєчника китайського хом'яка (СНО), лінії клітин W138, ВНК, COS-7, C127 або MDCK. Переважною лінією клітин ссавців є CHL-1. При використанні клітин CHL-1 гігроміцин включають як еукаріотичний селектований маркер. Клітини CHL-1 походять від клітин меланоми RPMI 7032, легко доступної лінії людських клітин. Лінія клітин CHL-1 була закладена на зберігання Американською колекцією тканинних культур (АТСС) відповідно до будапештського договору й була позначена #CRL 9446, депонована 18.06.1987. Клітини, які підходять для застосування за даним винаходом, комерційно доступні від АТСС. Ілюстративні лінії клітин включають Spodoptera frugiperda й Bombix mori. Прокаріотична система Ε. coli не здатна здійснювати посттрансляційну модифікацію, таку, як глікозилювання. Крім того, часто порушується укладання білків зі складними дисульфідними структурами при експресії в Е. соlі. Для злитого білка, описаного в контексті, спостерігалося помітне зниження тромбомодулінової кофакторної активності при експресії в Е. соlі, хоча обидві активності ще були присутні. У випадку прокаріотичної системи експресований білок або присутній у цитоплазмі клітини в нерозчинній формі, у вигляді так званих, тілець включення, знайдених у розчинній фракції після лізису клітини, або направляється в периплазму при додаванні відповідної секреторної сигнальної послідовності. Якщо експресований білок знаходиться у вигляді тілець включення, звичайно потрібні розчинення й наступне повторне укладання тілець включення. Фахівцям відомо багато прокаріотичних векторів експресії, таких, як рКК223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) і pGEMl (Promega Biotech, Madison, WI, USA), які комерційно доступні. Промотори, які звичайно застосовують в рекомбінантних мікробних системах експресії, включають b-лактамазу (пеніциліназу) і систему лактозного промотору (F.C. Chang й ін., Nature 275(5681), 1978, стор.617-624; D.V. Goeddel й ін., Nature 281(5732), 1979, стор.544-548), промоторну систему триптофану (trp) (D.V. Goeddel й ін., Nucl. Acids Res. 8(18), 1980, стор.4057-4074) і промотор tac (Т. Maniatis й ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Інша підходяща бактеріальна система експресії використовує промотор pL фага l і термоіндукований репресор clts857 (H.U. Bernard й ін., Gene 5(1), 1979, стор.59-76; CA. Love й ін., Gene 176(1-2), 1996, стор.49-53). Рекомбінантні злиті білки можуть бути також експресовані в дріжджах-хазяїнах, таких, як Saccharomyces cerevisiae. Звичайно це 27 дає можливість проводити різні посттрансляційні модифікації. Експресований злитий білок може бути секретований у культуральний супернатант, де залишається небагато інших білків, що полегшує очищення. Дріжджові вектори для експресії злитих білків за даним винаходом зберігають деякі необхідні властивості. Елементи вектора звичайно одержують із дріжджів і бактерій, щоб уможливити відтворення плазміди в обох системах. Бактеріальні елементи включають джерело реплікації й селектований маркер. Дріжджові елементи включають джерело реплікаційної послідовності (ARS), селектований маркер, промотор і термінатор транскрипції. Відповідні промотори в дріжджових векторах для експресії включають промотори гена TRP1, ADH1 або гена ADHII, ген кислої фосфатази (РН03 або РН05), ген ізоцитохрому або промотори, включені в гліколітичний шлях обміну, такі, як промотор єнолази, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GADPH), 3-фосфогліцераткінази (PGK), гексокінази, піруваткінази, триозафосфатізомерази й фосфоглюкозаізомерази (R.A. Hitzeman й ін., J. Вiol. Chem. 255(24), 1980, 12073-12080; В. Hess й ін., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 1968, стор.149-167; і M.J. Holland й J. P. Holland., Biochemistry, 17(23), 1978, стор.4900-4907). Комерційно доступні дріжджові вектори включають pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, WA), pBC102-K22 (ATCC # 67255) і YpGX265GAL4 (ATCC # 67233). Лінії клітин ссавців, які включають, але без обмеження, COS-7, клітини L, С127, ЗТЗ, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), HeLa, BHK, CHL-1, NSO й НЕК293, можуть бути використані для експресії рекомбінантних злитих білків за даним винаходом. Рекомбінантні білки, які продукуються в клітинах ссавців, звичайно розчинні, глікозильовані й мають автентичні N-кінці. Вектори експресії ссавців можуть містити нетранскрибовані елементи, такі, як джерело реплікації, промотор й енхансер, і нетрансльовані 5'- або 3'-послідовності, такі, як сайти зв'язування рибосом, сайти поліаденілування, акцепторний сайт і сплайсинг-донор, і послідовності термінації транскрипції. Промотори, придатні для використання у векторах експресії ссавців, звичайно є, наприклад, промоторами вірусів, таких, як вірус поліоми, аденовірус, вірус людського Т-клітинного лейкозу (HTLV), вірус мавпи 40 (SV 40) і людський цитомегаловірус (CMV). Залежно від системи експресії й вибраного хазяїна гомогенний рекомбінантний злитий білок може бути отриманий з використанням різних комбінацій загальновідомої хроматографії, застосовуваної для очищення білка. Це включає імуноафінну хроматографію, хроматографію з оберненою фазою, катіонообмінну хроматографію, аніонообмінну хроматографію, хроматографію гідрофобної взаємодії, гель-фільтраційну хроматографію й ВЕРХ. Якщо система експресії секретує злитий білок у ростове середовище, білок може бути очищений безпосередньо із середовища. Якщо злитий білок не секретується, він виділяється із клітинних лізатів. Руйнування клітин може бути 85996 28 здійснено будь-яким загальновідомим способом, включаючи чергування заморожуваннявідтавання, опромінення ультразвуком, механічне руйнування або застосування агентів, що лізують клітини. У переважному варіанті втілення за даним винаходом конструкції експресії ссавців були трансфіковані в клітини СНО DXB11. Стійкі популяції були відібрані з використанням 400мкг/мл гігроміцину В середовищі HAMS/F12. Рівні експресії склали приблизно 500мкг/л. Щоб підвищити рівні експресії, була відібрана популяція з використанням 100нМ метотрексату в середовищі a-MEM. Приблизний рівень експресії даної популяції склав 5мкг/л. Ця конструкція містила послідовність e-tag на С-кінці білка. Колонки зі спорідненістю до e-tag були придбані в American/Pharmacia Biotech. Середовище клітинної культури фільтрували через фільтр 0,22мкм і завантажували в колонку на 5мл з послідовністю e-tag зі швидкістю 2мл/хв. Колонкові промивали 0,2Μ фосфатним буфером з 0,05% Na3N, pH 7,0 і потім елюат збирали в пробірки, який містять 0,1 об'єму 1Μ трис-буфера, pH 8,2, щоб нейтралізувати буфер елюції. Альтернативно фільтроване культуральне середовище завантажували в колонку з білком А. У цьому випадку колонку промивали 50мМ лимонною кислотою, 300мМ NaCl, pH 6,5 й елюювали тим же самим буфером при pH 3,0. В обох випадках очищені зразки потім завантажували в колонку із сефадексом 200, щоб відокремити мономер від димерної форми злитого білка. Фармацевтичні композиції Винахід забезпечує також фармацевтичні композиції, які можуть бути введені пацієнтові для досягнення терапевтичного ефекту. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть бути отримані для введення шляхом комбінування злитого білка, який має необхідний ступінь чистоти й фармацевтично ефективною кількістю, з фізіологічно прийнятними носіями. Злиті білки за даним винаходом можуть застосовуватися у фармацевтичних композиціях для внутрішньовенного введення або підшкірного введення, або подоболонкового введення. Так, описані вище злиті білки переважно будуть комбінуватися із прийнятним стерильним фармацевтичним носієм, таким, як 5% декстроза, модифікований лактатом розчин Рінгера, нормальний фізіологічний розчин, стерильна вода або будь-який інший приготовлений для продажу фізіологічний буферний розчин, створений для внутрішньовенної інфузії. Буде зрозуміло, що вибір розчину-носія й дози й способу введення композиції будуть змінюватися залежно від суб'єкта й конкретної клінічної ситуації й будуть обумовлені стандартними медичними процедурами. Відповідно до способів за даним винаходом ці фармацевтичні композиції можуть бути введені в кількостях, ефективних для пригнічення патологічних наслідків, асоційованих з надлишковою генерацією тромбіну в суб'єкта. Введення злитого білка може бути болюсною внутрішньовенною ін'єкцією, безперервною внут 29 рішньовенною інфузією або комбінацією обох шляхів. Альтернативно або додатково злитий білок, змішаний з відповідними наповнювачами, може потрапити в систему кровообігу із внутрішньом'язової ділянки. Систематичну обробку злитим білком можна контролювати визначенням активованого неповного тромбопластинового часу (ПЧ) на серійних зразках крові, взятих у пацієнта. Час коагуляції, який спостерігається в цьому аналізі, є тривалим, коли в системі кровообігу досягається достатній рівень злитого білка. Рекомбінантні злиті білки й фармацевтичні композиції за даним винаходом застосовні для парентерального, місцевого, внутрішньовенного, перорального або локального введення. Фармацевтичні композиції можуть бути введені в різноманітних стандартних дозованих формах залежно від способу введення. Наприклад, стандартні дозовані форми можуть бути введені в лікарській формі, яка включає, але без обмеження, таблетки, капсули, порошки, розчини й емульсії. Рекомбінантні злиті білки й фармацевтичні композиції за даним винаходом застосовні для внутрішньовенного введення. Композиції для введення звичайно будуть містити розчин одноланцюгового антитіла або злитого білка, що включає одноланцюгове антитіло, розчинене у фармацевтично прийнятному носії, переважно у водному носії. Можуть застосовуватися різноманітні водні носії, наприклад, забуферений фізіологічний розчин тощо. Ці розчини стерильні й, як правило, вільні від небажаного матеріалу. Композиції можуть стерилізуватися звичайними, добре відомими способами. Типова фармацевтична композиція для внутрішньовенного вливання може бути легко визначена фахівцем у даній галузі. Кількості, які вводять, зовсім очевидно є специфічним білком і залежать від його ефективності й фармакокінетичного профілю. Сучасні способи одержання композицій, які вводять парентерально, будуть відомі або очевидні фахівцям й описані більш докладно в таких публікаціях, як Remington's Pharmaceutical Science, 15е вид., Mack Publishing Company, Easton, Pa (1980). Композиції, які містять дані злиті білки або коктейль на їх основі (тобто з іншими білками), можуть вводитися у вигляді терапевтичних курсів лікування. При терапевтичному застосуванні композиції вводять пацієнтові, який страждає від кровотечі в результаті порушення або захворювання, у кількості, достатній, щоб лікувати або принаймні зупинити кровотечу. Кількість, достатня для того, щоб це здійснити, визначена як «терапевтично ефективна кількість». Кількості, ефективні для даного застосування, будуть залежати від тяжкості захворювання й загального стану здоров'я пацієнта. Одне або множинне введення композицій може проводитися залежно від дози й частоти, які потрібні й переносимі пацієнтом. У кожному разі композиція повинна забезпечити достатню кількість білків за даним винаходом для ефективного лікування пацієнта. 85996 30 Злиті білки за винаходом або їх фармацевтично прийнятні композиції вводять у терапевтично ефективній кількості, яка буде змінюватися залежно від багатьох факторів, включаючи активність застосовуваного специфічного злитого білка; метаболічну стабільність і тривалість дії злитого білка; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать й дієту пацієнта; спосіб дії й час введення, швидкість екскреції; комбінацію препаратів; тяжкість конкретного захворювання-стану; і реципієнта, що піддається терапії. Як правило, щоденна терапевтично ефективна кількість становить від приблизно 0,14мг до приблизно 14,3мг/кг маси тіла/день злитого білка за винаходом або його фармацевтично прийнятної композиції; переважно від приблизно 0,7мг до 10мг/кг маси тіла/день; і найбільш переважно від приблизно 1,4мг до приблизно 7,2мг/кг маси тіла/день. Наприклад, для введення людині з масою 70кг дозовий діапазон був би від приблизно 10мг до приблизно 1,0г/день злитого білка за винаходом або його фармацевтично прийнятної композиції, переважно від приблизно 50 мг до приблизно 700мг/день і найбільш переважно від приблизно 100мг до приблизно 500мг/день. Генна терапія Злитий білок за винаходом може бути також використаний згідно із даним винаходом шляхом експресії такого злитого білка in vivo, яку часто відносять до «генної терапії». Так, наприклад, клітини можуть бути сконструйовані з полінуклеотидом (ДНК або РНК), який кодує злитий білок ех vivo, потім створені клітини вводять пацієнтові, який повинен бути підданий терапії злитим білком. Такі способи добре відомі фахівцям. Наприклад, клітини можуть бути сконструйовані за допомогою методик, відомих фахівцям, з використанням ретровірусних частинок, які містять РНК, яка кодує злитий білок за даним винаходом. Локальна доставка злитих антикоагулювальних білків за даним винаходом, що використовує генну терапію, може забезпечити терапевтичний агент у галузі-мішені, ендотеліальній клітинній вистілці кровоносних судин. Розглядаються методології генної терапії як in vitro, так й in vivo. Відомо декілька способів перенесення потенційно терапевтичних генів, щоб визначати клітинну популяцію. Дивися, наприклад, Mulligan, Science 260, 1993, стор.936-931. Ці способи включають: (1) пряме перенесення гена. Дивися, наприклад, Wolff й ін. (1990) Science 247: 1465-1468; (2) опосередковане ліпосомою перенесення ДНК. Дивися, наприклад, Caplen й ін., Nature Med. 3, 1995, стор.39-46; Crystal, Nature Med. 1, 1995, стор.15-17; Gao й Huang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 1991, стор.280-285; (3) опосередковане ретровірусом перенесення ДНК. Дивися, наприклад, Kay й ін., Science 262, 1993, стор.117-119; Anderson, Science 256, 1992, стор.808-813; (4) опосередковане ДНК-вмісним вірусом перенесення ДНК. Такі ДНК-вмісні віруси включають аденовіруси (переважно вектори на основі Ad2 або Ad5), віруси герпесу (переважно вектори на основі вірусу простого герпесу) і парвовіруси (переважно 31 вектори на основі «дефектних» або неавтономних парвовірусів, більш переважно вектори на основі адено-асоційованих вірусів, найбільш переважно вектори на основі AAV-2). Дивися, наприклад, Ali й ін., Gene Therapy, 1, 1994, стор.367-384; патент US 4797368, включений у контекст шляхом цитування, і патент US 5139941, включений у контекст шляхом цитування. Вибір конкретної векторної системи для перенесення гена, який представляє інтерес, буде залежати від багатьох факторів. Одним важливим фактором є клітинна популяція-мішень. Хоча ретровірусні вектори широко вивчені й використовувалися в багатьох випадках застосування генної терапії, ці вектори, як правило, не підходять для зараження клітин, які не діляться. Крім того, ретровіруси мають потенціал онкогенності. Однак недавні розробки в галузі лентивірусних векторів можуть обійти деякі із цих обмежень. Дивися Naldini й ін., Science 272, 1996, стор.263-267. Ретровіруси, на основі яких можуть бути отримані ретровірусні плазмідні вектори, згадані вище, включають, але без обмеження, вірус мишиного лейкозу Молоні, вірус некрозу селезінки, ретровіруси, такі, як вірус саркоми Рауса, вірус саркоми Харві, вірус лейкозу птахів, вірус лейкозу гібонів, вірус імунодефіциту людини, аденовірус, вірус мієлопроліферативної саркоми й вірус пухлини молочної залози. В одному варіанті втілення винаходу ретровірусний плазмідний вектор створюється на основі вірусу мишиного лейкозу Молоні. Аденовіруси мають ту перевагу, що вони мають широкий діапазон хазяїв, можуть заражати спочиваючі або повністю диференційовані клітини, такі, як нейрони або гепатоцити, і, очевидно, в істотній мірі не є онкогенними. Дивися, наприклад, Ali й ін. (1994), вище, стор.367. Аденовіруси, очевидно, не інтегрують у геном хазяїна. Через те, що вони існують екстрахромосомально, небезпека інсерційного мутагенезу сильно знижена. Ali й ін. (1994), вище, стр.373. Адено-асоційовані віруси мають подібні переваги, що й вектори на основі аденовірусів. Однак AAVs мають властивість сайт-специфічної інтеграції в людську хромосому 19 (Ali й ін., 1994, с.377). У переважному варіанті втілення винаходу ДНК, які кодують злиті білки за даним винаходом, застосовується в генній терапії порушень, включаючи, але без обмеження, тромбоз глибоких вен, коагулопатію споживання, гострий коронарний синдром або злоякісну пухлину з ознаками коагулопатії. Відповідно до даного варіанта втілення генна терапія із ДНК, яка кодує злиті білки за даним винаходом, проводиться пацієнтові, який цього потребує, паралельно або негайно після постановки діагнозу. Кваліфікований фахівець визнає, що будьякий відповідний вектор для генної терапії, який містить ДНК, яка кодує злитий білок за винаходом, або ДНК, яка кодує аналоги, фрагменти, похідні або варіанти злитого білка за винаходом, може бути застосований відповідно до даного варіанта втілення. Методики створення такого вектора відомі. Дивися, наприклад, W.F. Anderson, Nature 85996 32 392,1998, стор.25-30; І.М. Verma й N. Somia, Nature 389,1998, стор.239-242. Введення ДНК-вмісного вектора злитого білка в сайт-мішень може бути виконане з використанням відомих методик. Вектор для генної терапії включає один або декілька промоторів. Відповідні промотори, які можуть використовуватися, включають, але без обмеження, ретровірусний довгий кінцевий повтор (LTR); промотор вірусу SV40 і промотор людського цитомегаловірусу (CMV), описаний Miller й ін., Biotechniques 7(9), 1989, стор.980-990, або будьякий інший промотор (наприклад, клітинні промотори, такі, як еукаріотичні клітинні промотори, що включають, але без обмеження, гістоновий, роl III й b-актиновий промотори). Інші вірусні промотори, які можуть використовуватися, включають, але без обмеження, аденовірусні промотори, тимідинкіназні (ТК) промотори й промотори парвовірусу В19. Вибір відповідного промотору із вказівок, які містяться в контексті, буде очевидним для фахівця в даній галузі. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок за даним винаходом, знаходиться під контролем відповідного промотору. Відповідні промотори, які можуть використовуватися, включають, але без обмеження, аденовірусні промотори, такі, як аденовірусний основний пізній промотор; або гетерологічні промотори, такі, як промотор цитомегаловірусу (CMV); промотор респіраторного синтиціального вірусу (RSV); індуковані промотори, такі, як промотор мишиної пухлини молочної залози (ММТ), промотор металотіонеїну; промотори теплового шоку; альбуміновий промотор; промотор аполіпопротеїну AI (ApoAI); промотори людського глобіну; промотори вірусної тимідинкінази, такі, як промотор тимідинкінази вірусу простого герпесу; ретровірусні LTRs (включаючи модифіковані ретровірусні LTRs, описані вище); промотор b-актину; і промотор людського гормону росту. Ретровірусний плазмідний вектор використовується, щоб трансдукувати упаковані клітинні лінії з метою утворення продукуючих ліній клітин. Прикладами упакованих клітин, які можуть бути трансфіковані, включають, але без обмеження, лінії клітин РЕ501, РАЗ 17, ψ-2, ψ-ΑΜ, РА12, Т1914Х; VT-19-17-Н2, ψCRE, ψCRIP, GP+#-86, GP+envAm12 й DAN, як описано в публікації Miller, Human Gene Therapy, 1990, стор.15-14, яка включена в контекст повністю шляхом цитування. Вектор може трансдукувати упаковані клітин за допомогою будь-яких способів, відомих фахівцям. Такі способи включають, але без обмеження, електропорацію, застосування ліпосом й осадження фосфатом кальцію. За однєю з альтернативних можливостей ретровірусний плазмідний вектор може бути інкапсульований у ліпосому або з'єднаний з ліпідом і потім введений хазяїнові. Продукуюча лінія клітин генерує інфекційні частинки ретровірусного вектора, які включають нуклеїнові послідовності, які кодують поліпептиди. Такі частинки ретровірусного вектора потім можуть використовуватися для трансдукції еукаріотичних клітин або in vitro, або in vivo. Трансдуковані еукаріотичні клітини будуть експресувати нуклеїнові 33 послідовності, які кодують поліпептид. Еукаріотичні клітини, які можуть бути трансдуковані, включають, але без обмеження, ембріональні стовбурові клітини, ембріональні клітини карциноми, а також гемопоетичні стовбурові клітини, гепатоцити, фібробласти, міобласти, кератиноцити, ендотеліальні клітини й бронхіальні епітеліальні клітини. Іншим підходом до генної терапії є «транскаріотична терапія», де клітини пацієнтів обробляють ex vivo для індукції в спочиваючих хромосомних генів здатність продукувати білок, який представляє інтерес, після зворотного введення пацієнтові. Транскаріотична терапія передбачає, що реципієнт має нормальний комплект генів, необхідних для активації. Транскаріотична терапія включає введення промотору або іншої екзогенної регуляторної послідовності, здатної активувати гени, які знаходяться на стадії виникнення, у хромосомну ДНК клітин пацієнта ex vivo, культивування й відбір клітин, які продукують активний білок, і потім повторне введення активованих клітин пацієнтові з наміром, що вони там повністю відновлюються. Клітини, «активовані геном», потім виробляють білок, що представляє інтерес, протягом деякого значного періоду часу, можливо, такої тривалості, як життя пацієнта. Патенти US 5641670 й 5733761 розкривають деталі цієї концепції, і тим самим включені у всій повноті шляхом цитування. Набори Крім того, даний винахід стосується наборів для дослідницьких або діагностичних цілей. Звичайно набір включає один або декілька контейнерів, які містять одноланцюгові антитіла за даним винаходом. У переважному варіанті втілення винаходу набори включають контейнери, які містять одноланцюгові антитіла у формі, яка підходить для одержання похідного із другою молекулою, наприклад, доменом ТМ або його фрагментами. У більш переважному варіанті втілення набори включають контейнери, які містять злиті білки з послідовностями SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3. В іншому варіанті втілення винаходу набори можуть містити послідовності ДНК, які кодують злиті білки. Переважно послідовності ДНК, які кодують ці злиті білки, забезпечуються в плазміді, яка підходить для трансфекції в клітину-хазяїн й експресії в хазяйській клітині. Плазміда може містити промотор (часто індукований промотор) для регуляції експресії ДНК у клітині-хазяїні. Плазміда може також містити відповідні сайти рестрикції для сприяння вставки в плазміду іншої послідовності ДНК, щоб продукувати різні злиті білки. Плазміди можуть також містити численні інші елементи, щоб сприяти клонуванню й експресії кодованих білків. Такі елементи добре відомі фахівцям і включають, наприклад, селектовані маркери, кодони ініціації, кодони термінації тощо. Терапевтичні показання Захворювання, при яких утворення тромбу відіграє важливу етіологічну роль, включають інфаркт міокарда, коагулопатію споживання, тромбоз глибоких вен, легеневу емболію, ішемічний удар, септичний шок, гострий респіраторний дистрес-синдром, нестабільну стенокардію й інші артеріальні й венозні закупорювальні стани. Злиті 85996 34 білки за даним винаходом корисні при всіх цих, а також інших захворюваннях, при яких тромбоутворення є патологічним. Інші патологічні стани, при яких злитий білок за даним винаходом може бути корисний, включають злоякісну пухлину з коагулопатією і запалення. Сполуки можуть також знайти застосування при пересадженнях шкіри й вен і трансплантації органів. Термін «корисний» означає, що сполуки корисні для терапії або для запобігання захворюванню, або для його прогресування в більш важкий стан. Сполуки за даним винаходом забезпечують також безпечний й ефективний антикоагулянт, наприклад, у пацієнтів, які одержують біопротези, такі, як серцеві клапани. Ці сполуки можуть замінити гепарин і варфарин при лікуванні, наприклад, легеневої емболії або гострого інфаркту міокарда. Злиті білки за даним винаходом можуть також знайти застосування в нанесенні покриття на медичні пристосування, де коагуляція є предметом стурбованості. Аналізи Багато лабораторних аналізів для вимірювання активності ТМ у злитому білку за винаходом є доступними. Активність білка С може бути виміряна в аналізі, описаному H.H. Salem й ін., 1984 вище, і J.B. Galvin й ін., J. Вiol Chem. 262(5), 1987, стор.2199-2205. Коротко аналіз складається із двох етапів. Першим етапом є інкубація тестованого злитого білка із тромбіном і білком С за певних умов. На другому етапі тромбін інактивують гірудином або антитромбіном III і гепарином, і активність знову активованого білка С визначають із застосуванням хромогенного субстрату, за допомогою чого хромофор вивільняється за допомогою протеолітичної активності активованого білка С. Цей аналіз проводять із очищеними реагентами. Альтернативно ефект злитого білка може бути виміряний з використанням аналізів часу згортання плазми, такого, як час частково активованого тромбопластину (ЧАТЧ), час згортання тромбіну (ЧЗГ) і/або протромбіновий час (ПЧ). Ці аналізи проводять відмінність між різними механізмами пригнічення коагуляції й включають активацію білка С Подовження часу згортання в будь-якому із цих аналізів показує, що молекула може пригнітити коагуляцію в плазмі. Наведені вище аналізи застосовуються для ідентифікації злитих білків з активністю ТМ, які здатні зв'язувати тромбін як в очищених системах, так й у навколишньому середовищі плазми. Додаткові аналізи потім використовують, щоб оцінити інші види активності нативного ТМ, такі, як пригнічення каталізованого тромбіном утворення фібрину з фібриногену (H.V. Jakubowski й ін., J. Biol. Chem. 261(8), 1986, стор.3876-3882), пригнічення активації тромбіном фактора V (CT. Esmon й ін., J. Biol. Chem. 257 (14), 1982, 7944-7947), прискорене пригнічення тромбіну антитромбіном III і гепариновим кофактором II (N.L. Esmon й ін., J. Biol. Chem. 258(20), 1983, стор.12238-12242), пригнічення тромбіном фактора XIII (J. Polgar й ін., Thromb. Haemost. 58(1), 1987, с. 140), пригнічення опосередкованої тромбіном інактивації білка S (Е.А. Thompson й H.H. Salem., J. Clin. Inv. 78(1), 1986, стор.13-17) і пригнічення опосередкованої тромбі 35 ном активації й агрегації тромбоцитів (N.L. Esmon, і ін., 1983, див. вище). Наступні аналізи, описані в деталях нижче в прикладі 5, використали для вимірювання ефективності in vitro злитих білків за винаходом: (1) аналіз (хромогенний) активації білка С; (2) аналіз активації sTF/FVIIa; (3) аналіз активації фактора X; і (4) аналіз активації білка С (на багатій TF поверхні). Мається на увазі, що при здійсненні методик за даним винаходом, безумовно, слід розуміти, що посилання на конкретні буфери, середовища, реагенти, умови культивування тощо, не є обмежуючими, але повинні сприйматися так, начебто включають всі споріднені матеріали, які фахівець у даній галузі визнав би такими, що представляють інтерес або цінність в особливому контексті, у якому це обговорення представлене. Наприклад, часто можна замінити одну буферну систему або культуральне середовище іншим і все-таки досягти подібних, якщо не ідентичних, результатів. У таких фахівців буде достатньо інформації про такі системи й методології, щоб зуміти без неналежного експериментування зробити такі заміни, які будуть оптимально служити своїм цілям при застосуванні способів і методик, розкритих у контексті. Даний винахід тепер буде, крім того, описуватися за допомогою наступних прикладів, які його не обмежують. При використанні розкриття прикладу слід чітко пам'ятати, що інші й різні варіанти втілення способів, розкритих за даним винаходом, будуть, без сумніву, пропонуватися фахівцям в галузі, що має відношення до справи. Без подальшого уточнення вважається, що будь-який фахівець у цій галузі, використовуючи попередній опис, застосує даний винахід у його найбільш повному обсязі. У зв'язку із цим наступні переважні специфічні варіанти втілення винаходи повинні розглядатися як просто ілюстративні, а не як такі, що якимось чином обмежують розкриття, що залишилося. У згаданих й у наступних прикладах всі температури не виправлені й дані в градусах Цельсію, всі частини й відсотки є масовими, якщо не вказано інакше. Повні розкриття заявок, патентів і публікацій, цитованих вище, тим самим включені шляхом цитування. Наступні приклади передбачені як посібник, щоб сприяти застосуванню винаходу на практиці. Приклад 1 Конструкція одноланцюгового анти-TF антитіла scFv(TF)3e10 Одноланцюгове анти-TF антитіло scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO:1) складається із сигнального пептиду (-18 до -1), домену VH (1-126), лін 85996 36 кера VH-VL (127-131), домену VL (132-246) і послідовності e-tag (247-264). Приклад 2 Конструкція 1 злитого білка scFv(TF)3e10TMi456 Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 (SEQ ID NO:2) складається із сигнального пептиду (від положення -18 до положення -1), VH-ділянки (1-126), VH-VL-лінкера (127-131), VL-ділянки (132-246), VLТМ-лінкера (247-264), ТМі-домену (265-382) і послідовності e-tag (383-400). Мутації H381G, M388L, R456G й H457Q в ТМі456 підкреслені. Приклад 3 Конструкція 2 злитого білка scFv(TF)3e10TMi456 Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 (SEQ ID NO:3) складається із сигнального пептиду (від положення -18 до положення -1), Vн-ділянки (1-126), VН-VL-лінкера (127-131), VL-ділянки (132-246), VLТМ-лінкера (244-261), ТМі-домену (262-379). Мутації H381G, M388L, R456G й H457Q в ТМі456 підкреслені. У змінах, внесених у письмову й комп'ютерну версію опису й переліку послідовностей, виключені помилки. До цих змін ніяких доповнень не зроблено. Приклад 4 Експресія злитого білка в бактеріальних клітинах/клітинах ссавців Експресія в бактеріальних клітинах можлива, але вона дає білок, який має сильно знижену ко 37 факторну активність ТМ. Злитий білок експресували в клітинах СНО. Плазміда експресії містила як гігроміцин В, так і селектовані маркери DHFR. Первинна селекція була проведена при 400мкг/мл гігроміцину, щоб відібрати популяцію. Утворену популяцію потім піддавали селекції з 100нМ метотрексатом. У ході даної селекції клітини, які мають ампліфіковані копії ділянки ДНК, що містите селектований маркер, і ген-мішень, відбирають серед популяції. У результаті даної селекції рівні експресії були підвищеними від приблизно 0,3мг/л до приблизно 6мг/л. Приклад 5 Аналізи in vitro 1. Аналіз (хромогенний) активації білка С Даний аналіз проводили змішуванням 20мкл кожного з наступних білків у планшеті для мікротитрування: зразок ТМ (невідомий або стандартний), тромбін (3нМ) і білок С (1,5мкМ). Розріджувачем в аналізі для кожного білка був 20мМ трис-НСІ, 0,1Μ NaCl, 2,5мМ СаСl2, 2,5мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (BSA), pH 7,4. Лунки інкубували протягом 2год при 37°С, після чого активацію білка С переривали додаванням 20мкл гірудину (0,16од/мкл, 370нМ) у розріджувачі для аналізу й інкубували протягом додаткових 10хв. Утворену кількість активованого білка С визначали додаванням 100мкл 1мМ субстрату S2266 (у розріджувачі для аналізу) і продовжували інкубувати планшет при 37°С. Поглинання при 405нМ у кожній лунці зчитували кожні 10сек протягом 30хв, використовуючи зчитувальний пристрій для планшетів Molecular Devices. Дані поглинання зберігали, і зміну поглинання за секунду (кутовий коефіцієнт) розраховували для кожної лунки. Зміна поглинання на секунду було пропорційно до пмолів/мл активованого білка С. Співвідношення визначали емпірично, використовуючи змінювані концентрації активованого білка С. Зразки, які містять 100% активованого білка С, генерували змішуванням білка С при 01,5мкМ із 60нМ кролячим ТМ й 30нМ тромбіном, інкубацією протягом 0-4год, додаванням гірудину й виміром активності S2266, як описано вище. Умови, при яких активувалося 100% білка С, визначали, як ті, при яких активність S2266 (поглинання А405/сек) досягала плато. Одиницю активності визначали як 1пмоль активованого білка С, генерованого за мл/хв із реагентами в умовах, визначених вище. Альтернативно значення активності наведені в порівнянні з нативним кролячим ТМ, розчиненим за допомогою детергенту. 2. Аналіз активації sTF/FVIIa Принцип даного аналізу описаний нижче. Амідний зв'язок субстрату n-нітроаніліду трипептиду гідролізували за допомогою комплексу sTF/FVIIa. Виділений хромофорний продукт n-нітроанілід контролювали при 405нМ і концентрацію продукту, утвореного за одиницю часу розраховували, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 9920М1 см-1. Значення ІС50 (С) визначали шляхом апрок 85996 38 симації початкових швидкостей в 4параметричному рівнянні: Υ = (A-D)/(l+ (x/C)^B)+ D H-D-Val-Leu-Arg-p-NA®H-D-Val-Leu-Arg + p-NA Субстрат S2266 Трипептид Хромофор Реагенти й розчини 1. Буфер для аналізу: 50мМ трис-НСІ, 150мМ NaCl, 5мМ СаСl2, 0,1% BSA, pH 7,5 2. Людський FVIIa (HCVIIA-0060, Haematologic Technologies Inc.): 10x робочий розчин - приготувати 20нМ розчин у буфері для аналізу перед використанням. 3. Розчинний TF (Berlex): 10х робочий розчин приготувати 30нМ розчин у буфері для аналізу перед використанням. 4. Хромогенний субстрат S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): вихідний розчин: 10мМ у Н2О, який зберігають при 4°С; 2,5х робочий розчин -приготувати 2,5мМ розчин у буфері для аналізу перед використанням. 5. Антитіло: приготувати 2,5 ´ розведення в буфері для аналізу перед використанням. Умови аналізу Аналізи проводили в 96-лунковому планшеті для титрування при кімнатній температурі. Кінцеві концентрації компонентів були наступними: STF 3нМ Антитіло Змінюється від 1000 до 0,625нМ FVIIa 2нМ S2266 1мМ Методика аналізу 1. Піпетку на 0,1мл з 2,5 ´ буфера для аналізу (або буферного контролю) у кожну лунку. 2. Додати 0,025мл 10 ´ sTF й інкубувати 10хв при кімнатній температурі при легкому струшуванні. 3. Додати 0,025мл 10 ´ FVIIa, інкубувати 10хв при кімнатній температурі при легкому струшуванні. 4. Додати 0,1мл 2,5 ´ субстрату S2266, негайно перенести планшет у пристосування для зчитування планшетів і вимірювати ферментну кінетику при 405нМ із інтервалом в 10сек протягом 15хв. 3. Аналіз активації фактора X Принцип даного аналізу описаний нижче. Інкубували FVIIa з везикулами рекомбінантного людського TF, щоб утворити протеазний комплекс, здатний активувати субстрат FX. Даний комплекс утворюється в присутності (або за відсутності) різних концентрацій антитіла, потім вводили субстрат FX і давали відбутися реакції з утворенням продукту - активної протеази Fxa, яка здатна гідролізовати амідний зв'язок n-нітроаніліду хромогенного субстрату S2222. Виділений хромофорний продукт, n-нітроанілід, контролювали при 405нМ і концентрацію продукту, утвореного за одиницю часу, розраховували, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 9920М-1см-1. Величини ІС50 (С) визначали шляхом апроксимації початкових швидкостей в 4-параметричному рівнянні: Υ=(A-D)/(l+ (x/C)^B)+ D Реагенти й розчини 1. Буфер для аналізу: 50мМ трис-НСІ, 150мМ NaCl, 5мМ СаСl2, 0,1% BSA, pH 7,5 2. Людський FVIIa (HCVIIA-0031, Haematologic Technologies Inc.): 4x робочий розчин - приготувати 100пМ розчин у буфері для аналізу перед використанням. 3. Рекомбінантний людський TF (відновлений у лабораторії заявника з Innovin, Dade): робочий розчин - приготувати розведення 1:480 у буфері для аналізу перед використанням. 4. Фактор X (НСХ-0060, Haematologic Technologies Inc.): 4 (робочий розчин - приготувати 1000нМ розчин у буфері для аналізу перед використанням. 5. Хромогенний субстрат S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.): вихідний розчин: 6мМ у Н2О, який зберігають при 4°С. Робочий розчин приготувати 0,78мМ розчин в 3,57мМ етилендіамінтетраоцтовій кислоті (EDTA) (щоб зупинити реакцію), 150мМ NaCl, 50мМ трис-НСІ, pH 7,5 перед використанням. 6. Антитіло: приготувати 4 ´ розведення в буфері для аналізу перед використанням. Умови аналізу Аналізи проводили в 96-лунковому планшеті для мікротитрування при кімнатній температурі. Кінцеві концентрації компонентів були наступними. Везикули rTF 1/4 від розведення 1:480 Антитіло Змінюється від 1000 до 0,625нМ FVIIa 25пМ FX 250нМ S2222 0,546мМ Методика аналізу 1. Піпетку на 0,015мл з 4 ´ буфера для аналізу (або буферного контролю) у кожну лунку. 2. Додати 0,015мл 4 ´ пухирців TF. 3. Додати 0,015мл 4 ´ FVIIa, інкубувати 10хв при кімнатній температурі при легкому струшуванні. 4. Додати 0,015мл 4 ´ FX, інкубувати 5 хв при кімнатній температурі при легкому струшуванні. 5. Додати 0,14мл субстрату S2222, негайно перенести планшет у пристосування для зчитування планшетів і вимірювати ферментну кінетику при 405нМ із інтервалом в 10сек протягом 15хв. 4. Аналіз активації білка С (на TF-багатій поверхні) Даний аналіз проводили, як і хромогенний аналіз активації білка С, наведений вище, за винятком того, що в даному аналізі людські TF-вмісні везикули пептидного хромофора/пептидного субстрату (PC/PS) додавали до злитого білка або контрольному ТМ до додатка тромбіну й білка С. Приклад 6 Характеристика антитіл проти TF Сім різних зв'язувальних TF антитіл виділяли з фагової дисплейної бібліотеки людських одноланцюгових антитіл. Значення спорідненості зв'язувальних sTF антитіл, виміряні з використанням ВІАсоrе, були між 35 й 470нМ. Аналіз sTF/VTIa використали, щоб визначити, чи блокують антитіла утворення активного комплексу VIIa/TF. В аналізі sTF/VIIa зв'язування Vila з sTF більш ніж 20-кратно збільшує швидкість розщеплення в порівнянні із хромогенним пептидним субстратом S2266. Анти тіла, які пригнічують зв'язування FVIIa з TF, блокують дане прискорення. Серед виділених семи різних антитіл тільки одне з них, scFv(TF)3e10, не викликало пригнічення в аналізі sTF/VIIa. Дане антитіло збільшувало спорідненість FVIIa до sTF, знижуючи константу дисоціації КD п'ятикратно (Фіг.1). Значення KD антитіла scFv(TF)3e10 для sTF, виміряне з використанням аналізу sTF/FVIIa, склало 65,4нМ (Фіг.2). Мікрокалориметрію використали, щоб порівняти спорідненість scFv(TF)3e10 до TF при порівнянні з комплексом FVIIa/TF. Ці експерименти показали, що антитіло мало 20кратне більш високу спорідненість до комплексу TF/FVIIa у порівнянні з вільним sTF 9 (33нМ проти 600нМ, Фіг.3). Антитіла порівнювали, використовуючи аналіз активації FX, що складався з TF повної довжини у фосфоліпідних везикулах, FVIIa й FX. Кількість генерованого FXa визначали, використовуючи хромогенний субстрат S2765. Хоча антитіло scFv(TF)3e10 не мало найвищої спорідненості, як виміряно за допомогою ВІАсоrе, і це підвищувало спорідненість FVIIa до sTF, воно було єдиним антитілом у групі, яке пригнічувало активацію FX і подовжувало час згортання в аналізі ПЧ. Значення ІС50 (димерного) антитіла scFv(TF)3e10 для інгібування в аналізі активації FX склало 0,44нМ (Фіг.4), і двократне збільшення ПЧ відбувалося при 417нМ (Фіг.5). Антитіло scFv(TF)3e10 ідентифікували на основі зв'язування з рекомбінантним людським розчинним TF. Гомологія послідовностей TF між людською і мишиною або людською й кролячою склала 58% й 71%, відповідно. Антитіло зв'язується з унікальним епітопом на людському TF, що перешкоджає активації FX комплексом FVIIa/TF. Фізіологічно антитіло має перевагу над антитілами, які конкурують зі зв'язуванням FVTI або FVIIa з TF. Значення KD як FVII, так й FVIIa у людській плазмі склало 10нМ або між 100-і 1000-кратним значенням, більш високим, ніж KD. Дисоціація для комплексу з високою спорідненістю буде повільною (70-700 сек, припускаючи значення константи швидкості асоціації kon= 108М-1сек-1). На відміну від цього, константа Михаеліса Кm фактора X для комплексу VIIa/TF була між 0,200 й 4 мкМ, і концентрація FX у людській плазмі склала 130нМ (між 0,03- і 0,65-кратним KD). Первинна функція комплексу FVIIa/TF при коагуляції складається в перетворенні FX в FXa. Приклад 7 Властивості in vitro злитого білка scFv(TF)3e10-TMi456 Властивості злитого білка за винаходом scFv(TF)3e10-TMi456 оцінювали в різних аналізах in vitro. Злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 зберігав здатність пригнічувати активацію FX за допомогою комплексу FVIIa/TF (IC50= 0,5нМ, дані не наведені) і діяти як кофактор каталізованої тромбіном активації білка С (хромогенний аналіз, Фіг.6). Не спостерігалося ніякої значної відмінності в кофакторній активності ТМ між злитим білком й одним ТМі456 за відсутності фосфоліпідних пухирців, які містять TF. На відміну від цього, кофакторна активність ТМ злитого білка, але не ТМІ456, підвищувалася більш ніж 5-кратно в присутності фосфоліпідних везикул, які містять TF (Фіг.7). Активність in 41 vitro злитого білка scFv(TF)3e10-TMi456 проти індукованої TF коагуляції (аналіз ПЧ, невластивий шлях коагуляції) була в 6 разів вище, ніж антитіла scFv(TF)3e10 й в 17 разів вище, ніж одного ТМі456 (Фіг.5). На відміну від цього, ефективність злитого білка in vitro проти властивих і загальних шляхів коагуляції не була змінена значно (аналізи АРТТ і ТСТ, дані не наведені). Отже, доза злитого білка, яка викликала двократне збільшення ПЧ, тільки помірно впливала на АРТТ, тоді як ТМі456 в еквівалентній дозі в аналізі ПЧ викликав 4-кратне збільшення АРТТ (Фіг.8). Профіль in vitro був сумісний з таким, очікуваним для антикоагулянтів, спрямованих на TF/FVIIa, які, як відомо, мають винятковий вплив на співвідношення кровотечі на тваринних моделях тромбозу. Відповідно до аналізів заснованої на плазмі коагуляції злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 був сильнішим в аналізі індукованої TF коагуляції цільної крові (тромбоеластограф, TEG), ніж або антитіло scFv(TF)3e10, або один ТМі456 (Фіг.9). Крім того, злитий білок scFv(TF)3e10-TMi456 давав більше передбачуваний дозовий відклик при коагуляції цільної крові, індукованої TF, ніж низькомолекулярний гепарин (LMWH, Фіг.10). У підсумку наведені вище дані демонструють, що злиті білки за винаходом є потужними й селективними антикоагулянтами in vitro. Приклад 8 Модель щурячої тромбоемболії in vivo TF-частина антитіла злитого білка scFv(TF)3e10-TMi456 є специфічною для TF приматів. Модель тромбоемболії, ініційована за допомогою людського TF (тромбопластиновий реагент, який містить людський рекомбінантний TF, Ortho), була створена в самців, які знаходяться при сві 85996 42 домості, щурів лінії Sprague-Dawley (350-400г, n>7/групу). На цій моделі коагулопатії споживання (DIC) фактор тканини за посередництвом ін'єкції тромбопластину індукує відкладення легеневого фібрину, порушення дихання й смерть. Еквімолярні дози scFv(TF)3e10-TMi456 або scFv(TF)3e10, або наповнювача вводили за допомогою ін'єкції у хвостову вену, потім через 15хв за допомогою болюсної ін'єкції вводили тромбопластин (0,5мг/кг). У групі, обробленій наповнювачем, дана доза TF приводила до 60% летальності (LD60) звичайно протягом 5хв після ін'єкції тромбопластину. Щурів оцінювали відповідно до наступної системи показників у балах, що характеризують поширеність захворювання-смертність: 0 - без впливу; 1 - слабкий розлад дихання (відновлення до норми через 30хв); 2 - гострий розлад дихання (агонуючий стан, відновлення до норми потребувало більше 60хв); і 3 - загибель. Середня оцінка була вибрана для порівняння ефективності 4 різних оброблених груп. Результати використання даного аналізу in vivo наведені на Фіг.11. У цьому аналізі злитий білок за винаходом був здатний пригнітити загибель і розлад дихання. Попередні приклади можуть бути повторені з однаковим успіхом за допомогою заміщуваних у родовому відношенні або конкретно описаних реагентів та/або робочих умов за даним винаходом для тих, які використані в попередніх прикладах. Незважаючи на те, що винахід ілюстрований щодо одержання деяких конструкцій злитих білків, очевидно, що можуть бути зроблені зміни й модифікації за винаходом без відходу від суті й обсягу винаходу. 43 85996 44 45 85996 46 47 85996 48 49 85996 50 51 85996 52 53 85996 54 55 85996 56 57 85996 58 59 85996 60
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюTissue factor targeted thrombomodulin fusion proteins as anticoagulants
Автори англійськоюLight David, Мсlееn Kirk
Назва патенту російськоюСлитый антикоагулянтный белок тромбомодулина, который обеспечивает направленное перенесение к тканевому фактору
Автори російськоюЛайт Дэвид, Маклин Кирк
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/62, A61P 43/00, C07K 14/745, A61P 35/00, C07K 7/02, A61K 39/395, A61P 7/02, A61P 9/10, A61K 38/17, C07K 14/47
Мітки: фактора, антикоагулювальний, білок, спрямоване, тромбомодуліну, тканинного, перенесення, злитий, забезпечує
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/31-85996-zlitijj-antikoagulyuvalnijj-bilok-trombomodulinu-yakijj-zabezpechueh-spryamovane-perenesennya-do-tkaninnogo-faktora.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Злитий антикоагулювальний білок тромбомодуліну, який забезпечує спрямоване перенесення до тканинного фактора</a>
Злитий білок, який складається з мишачого або олюдненого моноклонального антитіла мав425 або його фрагменту, який спрямовано проти пухлинної клітини, спосіб його отримання, фармацевтична композиція
Номер патенту: 41888
Опубліковано: 15.10.2001
Автори: Фон Хьогєн Ілка, Хофманн Уве, Штадльмюллер Йорг, Матцку Зігфрід, Йегле Карлота-Сільва, Штріттматтер Вольфганг
МПК: C12P 21/08, A61K 39/00, C12R 1/19, C07K 14/52, C07K 16/46, C07K 16/00, A61K 39/395, A61K 38/18, C07K 19/00, C12N 15/13, A61P 35/04, C12R 1/91, C12N 15/79, A61K 38/20, A61K 38/00, A61K 39/44, A61P 35/00, C07K 14/525, C12P 21/02, C12N 15/09, A61K 38/19, C12N 15/64, C07K 16/30, A61K 38/16, C12N 15/62, C07K 16/28, C07K 14/54, A61K 47/48, C12N 15/55, C12N 15/19, C12N 15/72, C07K 16/42
Мітки: мав425, антитіла, моноклонального, фрагменту, злитий, спосіб, складається, клітині, пухлинної, отримання, олюдненого, фармацевтична, композиція, білок, мишачого, спрямовано
Формула / Реферат:
Слитый белок, состоящий из мышиного или очеловеченного моноклонального антитела Mab425 или его фрагмента, направленного против опухолевой клетки, несущей антигенную детерминанту рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), и биологически активного цитокина, слитого с указанным антителом или фрагментом антитела, и обладающего цитотоксической способностью к специфическому лизису опухолевой клетки.2. Слитый белок по п. 1, отличающийся...
Нові антитіла до тканинного фактора як антикоагулянти
Номер патенту: 81114
Опубліковано: 10.12.2007
Автори: Маклін Кірк, Лайт Девід
МПК: A61P 7/02, C07K 16/28, A61P 37/06, A61P 43/00, A61P 9/10, C07K 14/47, C07K 14/745, C07K 14/485, A61K 48/00, C12N 15/13, A61L 33/00, A61K 38/00, C12Q 1/68, A61K 39/395, A61P 31/04, C07K 16/36, C07K 16/40, C12N 15/09, C07K 19/00, A61P 29/00, A61P 35/00, C12P 21/08
Мітки: антикоагулянти, тканинного, нові, антитіла, фактора
Формула / Реферат:
1. Антикоагулювальне антитіло, яке є антитілом до тканинного фактора (ТФ) і яке зв'язується з більшою афінністю з комплексом фактор VIIa/тканинний фактор (ТФ), ніж з вільним тканинним фактором (ТФ), і яке має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3.2. Антитіло за п. 1, де антитіло має принаймні в 2 рази більш високу афінність до зв'язування з комплексом FVIIa/ТФ, ніж з вільним ТФ при вимірюванні за...
Злитий білок таці-імуноглобулін
Номер патенту: 82830
Опубліковано: 26.05.2008
Автори: Гросс Джейн А., Ріксон Марк У.
МПК: C07K 19/00, A61K 48/00, C12N 15/09, A61P 35/00, C07K 16/00, C07K 14/715, A61K 38/00, C07K 14/705, A61K 39/395
Мітки: злитий, таці-імуноглобулін, білок
Формула / Реферат:
1. Злитий білок, що містить:а) фрагмент трансмембранного активатора і кальцієвого модулятора та взаємодіючого з циклофіліновим лігандом рецептора (ТАСІ), причому фрагмент рецептора ТАСІ являє собою поліпептид, що складається з послідовності довжиною 32-80 амінокислот, причому фрагмент рецептора ТАСІ включає в себе принаймні один з (і) амінокислотних залишків з 34 по 66 SEQ ID NO:2 та іі) амінокислотних залишків з 71 по 104 SEQ ID NO:2,...
Спосіб одержання та виділення білка, що має активність фактора viii та лінії клітин людини, що експресують білок, що має активність фактора viii
Номер патенту: 77383
Опубліковано: 15.12.2006
Автори: Чан Шам-Юен, Чо М'юнг-Сам, Йі Хелена, Келсі Уільям
МПК: C12N 5/10, C12N 15/09, C07K 14/755, C12P 21/04, A61P 7/04, C12P 21/02, A61K 38/00
Мітки: має, фактора, людини, білка, одержання, лінії, експресують, клітин, білок, спосіб, активність, виділення
Формула / Реферат:
1. Спосіб одержання та виділення білка, що має активність фактора VIII, який передбачає вирощування клітин АТСС CRL-12568, що включають послідовність, яка кодує білок, що має активність фактора VIII, та яка оперативно зв'язана з промотором, при цьому вирощування проводять в умовах, прийнятних для експресії білка та його виділення.2. Спосіб за пунктом 1, в якому білок має амінокислотну послідовність, позначену як SЕQ ID NО:1.3....
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продуктований бактеріями e.coli, імітуючий білок оболонки trepanema pallidum
Номер патенту: 14746
Опубліковано: 04.02.1997
Автори: Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч, Міхайлова Татьяна Гавріловна, Чумак Ростислав Максимович, Мартиненко Дмитро Леонідович
МПК: C07K 14/20, C12N 15/31
Мітки: pallidum, модифікований, продуктований, бактеріями, рекомбінантний, генно-інженерно, trepanema, білок, очищений, імітуючий, оболонки, e.coli
Формула / Реферат:
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий білок оболонки Trepanema pallidum, який має основні імунодомінантні епітопи, притаманні нативному білку, має молекулярну масу 106 кД, містить в собі 883 амінокислотних залишків і відповідає загальній формулі N-бетa-Gal-pTr-COOH.
Попередній патент: Химерне антитіло, що специфічно зв’язується з людським il-6, та фармацевтична композиція, що його містить
Наступний патент: Використання еритропоетину
Випадковий патент: Штам вірусу діареї bovine viral diarrhoea (кмиэв-7) у великої рогатої худоби для виготовлення вакцинних і діагностичних препаратів