Епітопний пептид rab6kifl/kif20a та вакцини, які його містять

Реферат: Цим винаходом пропонуються олігопептиди, що включають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 3, 4 та 5. Крім того, цим винаходом пропонується спосіб індукування імунної реакції із використанням таких олігопептидів та фармацевтичних агентів на їх основі. UA 102274 C2 (12) UA 102274 C2 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Пріоритет Для цієї заявки заявляється пріоритет попередньої заявки США № 61/197,106, поданої 22 жовтня 2008 року, увесь зміст якої включено у цей опис шляхом посилання. Галузь техніки Цей винахід стосується галузі біологічної науки, більш специфічно галузі протиракової терапії. Зокрема, цей винахід стосується новітніх олігопептидів та їх застосування. Попередній рівень техніки Було продемонстровано, що CD8-позитивні цитотоксичні T-лімфоцити (CTL) розпізнають епітопні пептиди, що походять від пов'язаних з пухлиною антигенів (ТАА), які знаходяться на молекулі класу І головного комплексу гістосумісності (МНС), а потім вбивають пухлинні клітини. З часу відкриття родини антигену меланоми (MAGE) як першого прикладу ТАА будо відкрито багато ТАА, здебільшого завдяки імунологічним способам (NPL 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Деякі ТАА зараз зазнають клінічної розробки як імунологічні мішені. Ідентифікація нових ТАА, спроможних індукувати сильні та специфічні протипухлинні імунні реакції, гарантує подальшу розробку та клінічне застосування стратегій пептидної вакцинації для різних типів раку (NPL 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). На цей час було зроблено декілька повідомлень стосовно клінічних випробувань із застосуванням цих пептидів, що походять з пов'язаних з пухлиною антигенів. На жаль, до цього часу у цих випробуваннях протиракових вакцин спостерігалася лише низький об'єктивний показник ефективності (NPL 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 3342; NPL 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). На сьогодні можна очікувати визначення послідовності пептиду, що зв'язується з HLA класу І, завдяки застосуванню наступних алгоритмів (NPL 14: Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190, NPL 15: J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175, NPL 16: protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846). Проте, важко сказати, що очікуваний епітопний пептид може природно перетворюватися у клітинах-мішенях та експресуватися на поверхні клітин-мішеней з молекулою HLA. Крім того, алгоритм, наприклад, BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform) (NPL 17: Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75.; NPL 18: Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81.)), може запропонувати пептид, що зв'язується з молекулу HLA, проте запропонований пептид не є настільки досконалим (NPL 19: Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6.). Отже, скринінг ТАА все ще залишає багато проблем та труднощів. Рак підшлункової залози має поганий прогноз, а саме відсоток виживаності протягом 5 років становить приблизно 5 % (1). Хірургічна резекція залишається єдиною умовою для довготривалої виживаності, проте пацієнти з операбельним раком підшлункової залози, становлять меншість (9-22 %) (NPL 20: Sener S F, et al. J Am Coll Surg 1999;189:1-7., NPL 21: Eloubeidi M A, et al. Am J Surg 2006;192:322-9., NPL 22: Goonetilleke K S, et al. Int J Surg 2007;5:147-51.). Навіть у цих пацієнтів, проте, процент виживаності протягом 5 років залишається приблизно на рівні 20 %, незважаючи на хірургію з метою лікування (NPL 23: Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103., NPL 24: Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721-31.). До 80 % пацієнтів мають місцево розвинуту або метастатичну хворобу, та значення їхніх середніх діапазонів виживаності становлять від 6 до 9 місяців (NPL 25: Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54.). Отже, розробка новітніх терапевтичних способів – це питання надзвичайної важливості, та імунотерапія може бути потенційним способом лікування раку підшлункової залози. Вперше ідентифікували, що RAB6KIFL (KIF20A) відіграє роль у динаміці апарату Гольджі через пряму взаємодію з невеликою GTPазою Rab6 (NPL 26: Echard A, et al. Science 1998;279:580-5.). RAB6KIFL належить до суперродини кінезину рушійних білків, які мають вирішальні функції у спрямованому русі молекул та органел (NPL 26: Echard A, et al. Science 1998;279:580-5., NPL 27: Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73., NPL 28: Allan VJ, and Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82.). Нещодавно Taniuchi K et al. повідомили про те, що RAB6KIFL надмірно експресувався у ракових тканинах підшлункової залози (NPL 29: Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12.). Вони знайшли докази вирішальної ролі RAB6KIFL 1 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в канцерогенезі підшлункової залози. Завдяки аналізу профілю експресії генів із застосуванням геномної широкої мікроматриці кДНК, що містить 23040 генів, нещодавно було продемонстровано, що RAB6KIFL (KIF20A) зазнає підвищувальної регуляції у деяких типах раку, таких як рак сечового міхура (PTL 1: WO2006/085684), дрібноклітинний рак легенів (SCLC) (PTL 2: WO2007/013665) та гормоностійкий рак простати (HRPC) (PTL 3: WO2008/102906), вміст вказаних документів включено шляхом посилання до цього опису. Крім того, також ідентифікували деякі епітопні пептиди генних продуктів KIF20А (PTL 4: WO2008/102557). Перелік цитованої літератури Патентна література: (PTL) [PTL 1] WO2006/085684 [PTL 2] WO2007/013665 [PTL 3] WO2008/102906 [PTL 4] WO2008/102557. Непатентна література: (NPL) [NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 [NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 [NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 [NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 [NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 [NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 [NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 [NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 [NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 [NPL 14] Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190 [NPL 15] J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175 [NPL 16] protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846 [NPL 17] Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75 [NPL 18] Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81 [NPL 19] Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6 [NPL 20] Sener S F, et al. J Am Coll Surg 1999;189:1-7 [NPL 21] Eloubeidi M A, et al. Am J Surg 2006;192:322-9 [NPL 22] Goonetilleke K S, et al. Int J Surg 2007;5:147-51 [NPL 23] Smeenk H G, et al. Langenbecks Arch Surg 2005;390:94-103 [NPL 24] Yeo C J, et al. Ann Surg 1995;221:721-31 [NPL 25] Lockhart A C, et al. Gastroenterology 2005;128:1642-54 [NPL 26] Echard A, et al. Science 1998;279:580-5 [NPL 27] Hirokawa N, et al. Curr Opin Cell Biol 1998;10:60-73 [NPL 28] Allan VJ, and Schroer TA. Curr Opin Cell Biol 1999;11:476-82 [NPL 29] Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005;65:105-12. Суть винаходу В основі цього винаходу лежить, частково, відкриття нових мішеней для імунотерапії. Оскільки ТАА часто не мають імуногенності, визначення відповідних мішеней є надзвичайно важливим. Зокрема, винахід спрямовано на RAB6KIFL (SEQ ID NO: 2), що кодується геном за номером доступу GenBank AF153329 або CR598555, який вказується як NM_005733 (SEQ ID NO: 1)), оскільки RAB6KIFL ідентифікували як такий, який зазнає підвищувальної регуляції у декількох типах раку, таких як рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарцинома, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів (SCLC). Цим винаходом пропонуються генні продукти RAB6KIFL, які містять епітопні пептиди, які викликають на диво сильну реакцію CTL, яка є специфічною для відповідних молекул. Мононуклеари периферійної крові (РВМС), отримані від здорового донора, стимулювали, застосовуючи пептиди цього винаходу. Цим винаходом далі пропонуються запроваджені CTL, які специфічно розпізнають HLA-A2 (A*0201)-позитивні клітини-мішені, мічені відповідними пептидами, та HLA-A2 (A*0201)-обмежені епітопні пептиди, які можуть індукувати сильні та специфічні імунні реакції проти RAB6KIFL, що експресується на пухлині. Ці результати демонструють, що RAB6KIFL є сильно імуногенним, та його епітопи є 2 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ефективними мішенями для протипухлинної імунотерапії. Отже, метою цього винаходу є олігопептиди, які спроможні індукувати CTL, а також амінокислотна послідовність, вибрана з групи SEQ ID NO: 3, 4 та 5. Крім того, в іншому варіанті здійснення цього винаходу одна, дві або декілька амінокислот можуть бути заміщені, видалені, вставлені та/або додані доти, доки отримані модифіковані олігопептиди зберігають спроможність оригінальних пептидів індукувати CTL. Коли їх вводять суб'єктові, тоді олігопептиди цього винаходу є присутніми на поверхні антиген-експресуючих клітин, та потім вони індукують CTL, які спрямовані на відповідні пептиди. Отже, метою цього винаходу є антиген-представляючі клітини та екзосоми, які представляють будь-які з пептидів цього винаходу, а також способи індукування антиген-представляючих клітин. Протипухлинна імунна реакція індукується внаслідок введення олігопептидів RAB6KIFL цього винаходу або полінуклеотидів, що кодують ці олігопептиди, а також екзосом та антигенпредставляючих клітин, які представляють олігопептиди RAB6KIFL. Отже, іще однією метою цього винаходу є розробка фармацевтичних агентів або фармацевтичної композиції, які містять олігопептиди або полінуклеотиди, що кодують їх, а також екзосоми та антиген-представляючі клітини як їхні активні інгредієнти. Фармацевтичні агенти або фармацевтичні композиції цього винаходу знаходять застосування як вакцини. Крім того, іще однією метою цього винаходу є розробка способів лікування та/або профілактики (тобто, попередження) раку (пухлин), та/або попередження їх післяопераційного рецидиву, а також розробка способів індукування CTL, способів індукування протипухлинного імунітету, при цьому такі способи включають етап введення олігопептидів RAB6KIFL, полінуклеотидів, що кодують олігопептиди RAB6KIFL, екзосом або антиген-представляючих клітин, які представляють поліпептиди RAB6KIFL, або фармацевтичних агентів цього винаходу. Крім того, CTL цього винаходу також знаходять застосування як вакцини проти раку. Приклади типів раку, які є мішенями, включають, проте не обмежуються лише ними, рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарциному, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів (SCLC). Слід розуміти, що як вищеописана суть цього винаходу, так і наступний докладний опис є прикладами варіантів здійснення, та вони не обмежують винахід або інші альтернативні варіанти здійснення цього винаходу. Стислий опис ілюстративного матеріалу Різні аспекти та застосування цього винаходу будуть зрозумілими для фахівців у галузі після розгляду стислого опису ілюстративного матеріалу та докладного опису цього винаходу та його переважних варіантів здійснення, які є наступними. Фіг. 1. Фігура 1 демонструє помітно та часто підсилену експресію мРНК RAB6KIFL у тканинах раку підшлункової залози, що визначається на основі аналізу з використанням мікроматриці кДНК. "А" зображує перелік генів, що зазнають підвищувальної регуляції у клітинах раку підшлункової залози. Ці гени надмірно експресувалися у ракових клітинах порівняно з їх нормальними аналогами. Експресія мРНК RAB6KIFL у ракових клітинах підшлункової залози була помітно підсиленою у всіх 6 пацієнтів з раком підшлункової залози. "В" демонструє відносний коефіцієнт експресії гена RAB6KIFL у нормальних тканинах, що визначено на основі аналізу з використанням мікроматриці кДНК. Ген RAB6KIFL слабо експресувався тільки в яєчку та тимусі. "С" демонструє, що рівень експресії гена RAB6KIFL також підвищений у багатьох випадках раку легенів та раку сечового міхура, а також раку підшлункової залози, що визначили на основі попереднього аналізу з використанням мікроматриці кДНК. Фіг. 2 На Фігурі 2 наведено результати аналізів мРНК RAB6KIFL, що експресується у здорових тканинах людини, ракових клітинних лініях та ракових тканинах. "А" демонструє, що експресію мРНК RAB6KIFL досліджували у різних здорових тканинах, застосовуючи при цьому аналіз з використанням полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (RT-PCR). "В" демонструє здійснений з використанням полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою аналіз експресії RAB6KIFL у різних ракових клітинних лініях. "С" демонструє здійснений з використанням RT-PCR аналіз експресії RAB6KIFL у тканинах пухлини підшлункової залози (Т) та їх здорових аналогах (N). Експресію гена RAB6KIFL виявили у 5 з 8 тканин раку підшлункової залози. Навпаки, незначну експресію виявили у їх здорових аналогах. Фіг. 3 Фігура 3 демонструє надмірну експресію білка RAB6KIFL, яка є специфічною для раку 3 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підшлункової залози, що виявили шляхом аналізу з використанням вестерн-блотингу. "А" демонструє, що білок RAB6KIFL не виявили у 8 зразках здорових тканин, тоді як яєчко продемонструвало слабку смугу, яка має рухомість, подібну до рухомості, що спостерігається у клітинному лізаті PANC1. "В" демонструє, що у двох пацієнтів з раком підшлункової залози білок RAB6KIFL виявили у ракових тканинах (Т), проте не виявили у суміжних здорових тканинах (N). Анти-бета-актиновий блотинг також виконували для моніторингу рівного завантаження білка. Фіг. 4 Фігура 4 демонструє імуногістохімічні аналізи білка RAB6KIFL у тканинах раку підшлункової залози (А) та різних здорових тканинах (В). "А" демонструє, що сильне забарвлення RAB6KIFL спостерігалося здебільшого у цитоплазмі та ядрах ракових клітин у 6 з 9 випадків, проте дуже слабке забарвлення спостерігалося в ацинарних клітинах та здоровому проточному епітелії їхніх здорових суміжних тканин підшлункової залози. Подібне сильне забарвлення спостерігали у метастатичних осередках очеревини. Незначне забарвлення виявили при пухлиноутворюючому панкреатиті. "В" демонструє, що RAB6KIFL не забарвлювалося у здорових органах: мозку, легенях, печінці, нирці, шлунку, тонкій кишці, товстій кишці, селезінці, скелетному м'язі, шкірі та тимусі. Можливе слабке забарвлення спостерігали у яєчку. Позитивні сигнали забарвлення зображено коричневим кольором. Смуги масштабу відповідають 100 мікрометрам. Фіг. 5 Фігура 5 демонструє ідентифікацію HLA-A2-обмежених епітопів RAB6KIFL людини для мишачих CTL із застосуванням HLA-A2.1 (HHD) Tgm. "А" демонструє, що HLA-A2.1 (HHD) Tgm 5 імунізували 5 × 10 сингенними BM-DC, міченими дванадцятьма наборами суміші трьох типів пептидів, вибраних з 36 пептидів-кандидатів, in vivo на 7-ий та 14-ий день. На 21-ий день CD4клітини селезінки, виділені з імунізованих мишей, стимулювали ВМ-DC, міченими кожним пептидом протягом 6 днів. IFN-γ, вироблений CTL, виявили за допомогою імуноферментного спот-аналізу. Було продемонстровано, що пептиди RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) та RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5) індукують пептидреактивні CTL. Аналізи виконували двічі зі схожими результатами. "В" демонструє імуногістохімічне забарвлення за допомогою анти-CD4 або анти-CD8 mAb у зразках тканини HLA-A2 (HHD) Tgm, імунізованої пептидом RAB6KIFL-A2-9-809. Після дворазової вакцинації ці зразки вирізали та проаналізували. Фіг. 6A-B Фігура 6 демонструє індукцію RAB6KIFL-специфічних CTL людини від РВМС (мононуклеарів периферійної крові) HLA-A2-позитивних здорових донорів. "А" демонструє, що CTL, реактивні до пептиду RAB6KIFL, генерувалися від РВМС HLA-A2-позитивних здорових донорів. Після триразової стимуляції аутологічними DC (дендритними клітинами), похідними від моноцитів, міченими пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO:4) та + RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO:5), виявиляли цитотоксичність CTL проти клітин Т2 (HLA-A2 , з дефіцитом TAP), мічених кожним пептидом, або клітин Т2, не мічених пептидом, за допомогою 51 стандартного аналізу вивільнення Cr. Ці CTL демонстрували цитотоксичність до клітин Т2, мічених пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 (ліворуч), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередині) та RAB6KIFLA2-10-284 (праворуч), проте не до невідповідного пептиду HIV та не до клітин Т2, не мічених пептидами. "В" демонструє, що ці CTL демонстрували цитотоксичність до клітинної лінії раку + + підшлункової залози людини PANC1 RAB6KIFL HLA-A2 (A*0201) та до клітинної лінії раку + + товстої кишки СаСо-2 RAB6KIFL HLA-A2 (A*0201) , проте не до клітинної лінії раку підшлункової + залози людини РК8 RAB6KIFL HLA-A2 (A*0201) . Фіг. 6C-D "С" демонструє, що цитотоксичність цих CTL була специфічною до RAB6KIFL. Ці CTL low вбивали SKHep1/RAB6KIFL, клітинну лінію SKHep1 раку печінки людини RAB6KIFL HLA-A2+, трансфектовану геном RAB6KIFL людини, проте не вбивали SKHep1/Mock. "D" демонструє інгібування цитотоксичності за допомогою mAb проти HLA класу I. Після того, як клітини-мішені PANC1 інкубували з анти-HLA-класу I mAb (W6/32, IgG2a) або з анти-HLA-DR mAb (H-DR-1, IgG2a), відповідно, протягом 1 години, додали CTL, що генеровалися з РВМС здорового донора шляхом стимуляції пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (угорі), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередині) та RAB6KIFL-A2-10-284 (унизу). Виробництво IFN-γ помітно інгібувалося W6/32, проте не H-DR-1. Опис варіантів здійснення Переважні способи, пристрої та матеріали буде зараз описано, хоча будь-які способи та матеріали, подібні або еквівалентні до тих, які описано у цьому описі, можна застосовувати на практиці або під час тестування варіантів здійснення цього винаходу. Проте, до того, як буде описано матеріали та способи цього винаходу, слід зрозуміти, що цей винахід не обмежується 4 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 певними розмірами, формами, вимірами, матеріалами, способами, протоколами тощо, описаними у цьому описі, оскільки вони можуть варіюватися згідно з рутинними експериментами та оптимізацією. Слід також розуміти, що термінологія, яка застосовується в цьому описі, призначена для опису лише певних варіантів або варіантів здійснення, та вона не призначена для обмеження обсягу цього винаходу, який буде обмежено лише пунктами формули винаходу, що додається. Опис кожної публікації, патенту або патентної заявки, які згадуються у цьому описі винаходу, специфічно включено до цього опису шляхом посилання у їх повному обсязі. Проте, ніщо у цьому описі не слід тлумачити як припущення того, що цей винахід не дає право передувати такому опису на основі попереднього винаходу. У випадку конфліктної ситуації цей опис винаходу, включаючи визначення, буде визначальним. Крім того, матеріали, способи та приклади мають лише ілюстративний характер, та їх не слід розглядати як обмежувальні. I. Визначення Артиклі "a", "an" та "the", як застосовуються у цьому описі, означають "принаймні один", якщо інше специфічно не вказано. Терміни "поліпептид", "пептид" та "білок" застосовуються у цьому описі як взаємозамінні та означають полімер з амінокислотних залишків. Терміни застосовуються до амінокислотних полімерів, у яких один або більше амінокислотних залишків є модифікованим залишком або залишком, виникаючим неприродним шляхом, таким як штучний хімічний міметик відповідної природно виникаючої амінокислоти, а також вони застосовуються до природно виникаючих амінокислотних полімерів. Термін "олігопептид", який іноді застосовується у цьому описі винаходу, означає пептиди цього винаходу, довжиною у 20 залишків або менше, звичайно у 15 залишків або менше, та зазвичай вони складаються з від приблизно 8 до приблизно 11 залишків, часто з 9 або 10 залишків. Термін "амінокислота", як застосовується у цьому описі, означає природно виникаючі або синтетичні амінокислоти, а також амінокислотні аналоги та амінокислотні міметики, які діють подібно до природно виникаючих амінокислот. Природно виникаючі амінокислоти – це амінокислоти, що кодуються генетичним кодом, а також амінокислоти, модифіковані після трансляції у клітинах (наприклад, гідроксипролін, гама-карбоксиглутамат та О-фосфосерин). Фраза "амінокислотний аналог" означає сполуки, які мають таку ж саму основну хімічну структуру (вуглецевий зв'язок альфа з воднем, карбокси-групою, аміно-групою та R-групою), як і у природно виникаючої амінокислоті, проте мають модифіковану R-групу або модифікований скелет (наприклад, гомосерин, норлейцин, метіонін, сульфоксид, метіонінметилсульфоній). Фраза "амінокислотний міметик" означає хімічні сполуки, що мають різні структури, проте подібні до звичайних амінокислот за функцією. Амінокислоти можна позначати у цьому описі їхніми загально відомими трилітерними символами або однолітерними символами, рекомендованими Комісією з біохімічної номенклатури IUPAC-IUB (Biochemical Nomenclature Commission). Терміни "ген", "полінуклеотиди", "нуклеотиди" та "нуклеїнові кислоти" застосовуються у цьому описі як взаємозамінні, якщо інше специфічно не вказано, та вони, подібно до амінокислот, позначаються своїми загально прийнятими однолітерними кодами. Якщо інше не визначено, термін "рак" означає тип раку, що надмірно експресує ген RAB6KIFL. Приклади типів раку, які надмірно експресують RAB6KIFL, включають, проте не обмежуються тільки ними, рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарциному, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів (SCLC). Якщо інше не визначено, терміни "цитотоксичний Т-лімфоцит", "цитотоксична Т-клітина" та "CTL" застосовуються у цьому описі як взаємозамінні, та, якщо інше специфічно не вказано, позначають підгрупу Т-лімфоцитів, які є спроможними розпізнавати чужі клітини (наприклад, пухлинні клітини, інфіковані вірусом клітини) та індукувати смерть таких клітин. Якщо інше не визначено, усі технічні та наукові терміни, що застосовуються у цьому описі, мають такі самі значення, які є загально зрозумілими звичайному фахівцю у галузі, до якої належить винахід. II. Пептиди Для того, щоб продемонструвати, що пептиди, які походять від RAB6KIFL, функціонують як антиген, що розпізнається цитотоксичними Т-лімфоцитами (CTL), пептиди, що походять від RAB6KIFL (SEQ ID NO: 2), проаналізували з метою визначення, чи є вони епітопами антигену, обмеженими HLA-A2 (A*0201), які є звичайними алелями HLA (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 5 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 391324, 1994). HLA-A2-зв'язувальні пептиди-кандидати, що походять від RAB6KIFL, ідентифікували, застосовуючи інформацію щодо їх афінітету зв'язування з HLA-A2. Після стимуляції in vitro Тклітин дендритними клітинами (DC), завантаженими цими пептидами, успішно отримали CTL, застосовуючи кожен з пептидів, особливо наступні пептиди: RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) та RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5). Ці отримані CTL демонструють сильну специфічну CTL-активність проти клітин-мішеней, мічених відповідними пептидами. Результати у цьому описі демонструють, що RAB6KIFL – це антиген, який розпізнається CTL, та що ці пептиди можуть бути епітопними пептидами RAB6KIFL, обмеженими HLA-A2 (A*0201). Оскільки ген RAB6KIFL надмірно експресується у більшості ракових тканин, таких як рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарцинома, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів (SCLC), то він є гарною мішенню для імунотерапії. Отже, цим винаходом пропонуються олігопептиди, такі як нонапептиди (пептиди, що складаються з 9 амінокислотних залишків) та декапептиди (пептиди, що складаються з 10 амінокислотних залишків), які відповідають епітопам RAB6KIFL, які розпізнаються CTL. Особливо переважні приклади олігопептидів цього винаходу включають ті пептиди, які мають амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 3, 4 та 5. Зазвичай, комп'ютерні програми, які зараз доступні в Інтернеті, такі, які описано у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, можна застосовувати для розрахунку значень афінітету зв'язування між різними пептидами та антигенами HLA у силікагелі. Афінітет зв'язування з антигенами HLA можна вимірювати, як описано, наприклад, у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; та Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Способи визначення афінітету зв'язування описано, наприклад, у Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190; Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Отже, цей винахід охоплює пептиди RAB6KIFL, у яких визначається зв'язування з антигенами HLA за допомогою таких відомих програм. Крім того, до пептидів цього винаходу з боків можна додавати амінокислотні залишки доти, доки пептид зберігає свою здатність індукувати CTL. Такі пептиди зі здатністю індукувати CTL складаються, наприклад, з менш ніж приблизно 40 амінокислот, часто менш ніж з приблизно 20 амінокислот, зазвичай з менш ніж приблизно 15 амінокислот. Амінокислотна послідовність, фланкуюча ці пептиди, складена з амінокислотної послідовності, вибраної з групи SEQ ID NO: 3, 4 та 5, не обмежується та може складатися з будь-яких амінокислот доти, доки вона не знижує здатність оригінального пептиду індукувати CTL. Отже, цим винаходом також пропонуються пептиди, які мають здатність індукувати CTL та які включають амінокислотну послідовність, вибрану з групи SEQ ID NO: 3, 4 та 5. Взагалі, модифікація однієї, двох або декількох амінокислот у білку не вплине на функцію білка, або у деяких випадках навіть підсилить бажану функцію оригінального білка. Фактично, відомо, що модифіковані пептиди (тобто, пептиди, складені з амінокислотної послідовності, у якій один, два або декілька амінокислотних залишків було модифіковано (тобто, вони зазнали заміщення, видалення, додавання та/або вставки) порівняно з оригінальною контрольною послідовністю), зберігають біологічну активність оригінального пептиду (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; DalbadieMcFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Отже, в одному варіанті здійснення олігопептиди цього винаходу можуть мати як здатність індукувати CTL, так і амінокислотну послідовність, вибрану з групи SEQ ID NO: 3, 4 та 5, де одна, дві або декілька амінокислот додані, вставлені, видалені та/або заміщені. Фахівці у галузі зрозуміють тенденцію, що наслідком окремих додавань або заміщень в амінокислотній послідовності, які змінюють єдину амінокислоту або невеликий відсоток амінокислот, буде зберігання властивостей бічного ланцюга оригінальної амінокислоти. По суті, вони традиційно називаються як "консервативні заміщення" або "консервативні модифікації", де внаслідок змін білка модифікується білок, який має властивості та функції, аналогічні властивостям та функціям оригінального білка. Таблиці консервативних заміщень, наслідком яких є функціонально подібні амінокислоти, є добре відомими у галузі. Приклади характеристик амінокислотного бічного ланцюга, які б бажано зберігали властивості, включають, наприклад, гідрофобні амінокислоти (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гідрофільні амінокислоти (R, D, N, C, E, Q, G, 6 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 H, K, S, T) та бічні ланцюги, що разом мають наступні функціональні групи або характеристики: аліфатичний бічний ланцюг (G, A, V, L, I, P); бічний ланцюг, що містить гідроксильну групу, (S, T, Y); бічний ланцюг, що містить атом сірки, (С, М); бічний ланцюг, що містить карбонову кислоту та амід, (D, N, E, Q); бічний ланцюг, що містить основу, (R, K, H); та бічний ланцюг, що містить ароматичне кільце, (H, F, Y, W). Крім того, кожна з наступних 8 груп містить амінокислоти, які є прийнятними у галузі як консервативні заміщення одного іншим: 1) Аланін (A), Гліцин (G); 2) Аспарагінова кислота (D), Глутамінова кислота (E); 3) Аспарагін (N), Глутамін (Q); 4) Аргінін (R), Лізин (K); 5) Ізолейцин (I), Лейцин (L), Метіонін (M), Валін (V); 6) Фенілаланін (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонін (T) та 8) Цистеїн (C), Метіонін (M) (дивись, наприклад, Creighton, Proteins 1984). Вважають, що такі консервативно модифіковані пептиди є також пептидами цього винаходу. Проте, пептиди цього винаходу не обмежуються тільки ними, та вони можуть включати неконсервативні модифікації доти, доки пептид зберігає здатність оригінального пептиду індукувати CTL. Крім того, модифіковані пептиди не повинні виключати CTL-індукуючі пептиди поліморфних варіантів, міжвидових гомологів та алелей RAB6KIFL. Для того, щоб зберегти необхідну здатність індукувати CTL, можна модифікувати (додати або замістити) невелику кількість (наприклад, 1, 2 або декілька) або невеликий відсоток амінокислот. У цьому описі термін "декілька" означає 5 або менше амінокислот, наприклад, 3 або менше. Відсоток амінокислот, які слід модифікувати, може становити 20 % або менше, наприклад, 15 % або менше, наприклад, 10 %, або від 1 % до 5 %. Коли йдеться про імунотерапію, тоді пептиди цього винаходу мусять бути присутніми на поверхні клітини або екзосоми, переважно у вигляді комплексу з HLA-антигеном. Отже, бажано вибирати пептиди, які не тільки індукують CTL, але також мають високий афінітет зв'язування з HLA-антигеном. З цією метою пептиди можна модифікувати шляхом заміщення, вставки, видалення та/або додавання амінокислотних залишків, щоб отримати модифікований пептид, який має покращений афінітет зв'язування. На додаток до пептидів, які виникають природно, оскільки закономірність послідовностей пептидів, що виникають внаслідок зв'язування з HLAантигенами, є вже відомою (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), можна ввести в імуногенні пептиди винаходу модифікації на основі такої закономірності. Наприклад, пептиди, що мають високий афінітет зв'язування з HLA-A2 (A*0201), мають свою другу амінокислоту від N-закінчення, заміщену лейцином або метіоніном, та пептиди, амінокислота яких на С-закінченні заміщена валіном або лейцином. Отже, цей винахід охоплює пептиди, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 3, 4 або 5, де друга амінокислота від N-закінчення заміщена лейцином або метіоніном та/або де С-закінчення заміщене валіном або лейцином. Заміщення можна ввести не лише на кінцевих амінокислотах, але також на позиції можливого розпізнавання пептидів TCR. Декілька дослідів продемонстрували, що амінокислотні заміщення у пептиді можуть бути рівнозначними або кращими порівняно з оригінальними, наприклад, CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) або gp100 (209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 та S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314). Цей винахід також передбачає додавання амінокислот до послідовностей, описаних у цьому описі. Наприклад, одну, дві або декілька амінокислот можна також додати до N- та/або Сзакінчення пептидів цього винаходу. Такі модифіковані пептиди, що мають високий афінітет зв'язування з HLA-антигеном та збережену здатність індукувати CTL, також включено до цього винаходу. Проте, коли пептидна послідовність є ідентичною з частиною амінокислотної послідовності ендогенного або екзогенного білка, який має відмінну функцію, можуть виникати побічні ефекти, такі як аутоімунні розлади та/або алергічні симптоми щодо специфічних речовин. Отже, бажано спочатку здійснити пошук гомології, застосовуючи доступні бази даних, щоб уникнути ситуацій, при яких послідовність пептиду відповідає амінокислотній послідовності іншого білка. Коли внаслідок пошуку гомології стає очевидним, що не існує жодного пептиду з лише 1 або 2 амінокислотними відмінностями порівняно з цільовим пептидом, тоді цей цільовий пептид можна модифікувати для того, щоб підвищити його афінітет зв'язування з HLA-антигенами та/або підвищити його здатність індукувати CTL без будь-якої небезпеки виникнення таких побічних ефектів. 7 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Хоча очікується, що пептиди, які мають високий афінітет зв'язування з HLA-антигенами, як описано вище, будуть надзвичайно ефективними, пептиди-кандидати, які вибираються згідно з наявністю високого афінітету зв'язування як індикатора, далі досліджуються на існування спроможності індукувати CTL. У цьому описі фраза "спроможність індукувати CTL" вказує на спроможність пептиду індукувати цитотоксичні лімфоцити (CTL), коли він є присутнім на антиген-представляючих клітинах. Крім того, "спроможність індукувати CTL" включає спроможність пептиду індукувати активацію CTL, проліферацію CTL, сприяти CTL піддавати лізису клітини-мішені та підвищувати виробництво IFN-γ CTL. Підтвердження спроможності індукувати CTL виконується шляхом індукування антигенпредставляючих клітин, які несуть антигени МНС людини (наприклад, В-лімфоцити, макрофаги та дендритні клітини (DC)), або більш специфічно DC, що походять від мононуклеарних лімфоцитів периферійної крові, та, після стимуляції цими пептидами, шляхом змішування з CD8-позитивними клітинами з наступним вимірюванням IFN-γ, що виробляється та вивільняється CTL проти клітин-мішеней. Як реакційну систему можна застосовувати трансгенних тварин, яких отримали, щоб вони експресували HLA-антиген людини (наприклад, тварин, яких описано у ВenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Наприклад, клітини-мішені можна мітити радіоактивними 51 ізотопом Cr та йому подібними, та цитотоксичну активність можна підрахувати за радіоактивністю вивільненого з клітин-мішеней ізотопу. Альтернативно, спроможність індукувати CTL можна визначити шляхом вимірювання IFN-γ, виробленого та вивільненого CTL у присутності антиген-представляючих клітин (АРС), які є носіями іммобілізованих пептидів, та шляхом візуального обстеження зони інгібування на середовищах, застосовуючи моноклональні антитіла проти IFN-γ. Внаслідок дослідження спроможності пептидів індукувати CTL, як описано вище, визначили, що ті пептиди, які мають високий афінітет зв'язування з HLA-антигеном, необов'язково мають високу спроможність індукувати CTL. Проте, було визначено, що з тих пептидів, яких ідентифікували та оцінювали, нонапептиди або декапептиди, які вибрані з пептидів, що мають амінокислотні послідовності, вказані в SEQ ID NO: 3, 4 та 5, демонструють особливо високу спроможність індукувати CTL, а також високий афінітет зв'язування з HLA-антигеном. Отже, ці пептиди є прикладами переважних варіантів здійснення цього винаходу. Окрім вищеописаних модифікацій пептиди цього винаходу можна також з'єднати з іншими речовинами, доки отриманий з'єднаний пептид зберігає необхідну спроможність оригінального пептиду індукувати CTL. Приклади придатних речовин включають, проте не обмежуються тільки ними, пептиди, ліпіди, цукор та цукрові ланцюги, ацетилові групи, природні та синтетичні полімери тощо. Пептиди можуть містити модифікації, такі як глікозилування, окиснення бічного ланцюга або фосфорилування тощо, за умови, що модифікації не руйнують біологічну активність оригінального пептиду. Ці види модифікацій можна виконувати, щоб надати поліпептиду додаткових функцій (наприклад, функцію улучання у мішень та функцію доставки) або щоб стабілізувати поліпептид. Наприклад, для того, щоб підвищити стабільність поліпептиду in vivo, у галузі відомо, що можна ввести D-амінокислоти, амінокислотні міметики або неприродні амінокислоти; цю концепцію можна також адаптувати до поліпептидів цього винаходу. Стабільність поліпептиду можна дослідити декількома шляхами. Наприклад, для того, щоб дослідити стабільність, можна застосовувати пептидази або різні біологічні середовища, такі як плазма та сироватка людини (дивись, наприклад, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302). Крім того, пептиди цього винаходу можна з'єднати з іншими пептидами за допомогою спейсерів або лінкерів. Приклади інших пептидів включають, проте не обмежуються тільки ними, пептиди зі спроможністю індукувати CTL, які походять від інших ТАА. Альтернативно, два або більше пептидів цього винаходу можна з'єднати за допомогою спейсерів або лінкерів. Пептиди, з'єднані за допомогою спейсерів або лінкерів, можуть бути однаковими або відмінними один від одного. Спейсери або лінкери специфічно не обмежуються, проте бажано, щоб вони були пептидами, більш переважно пептидами, які мають один або більше сайтів розщеплення, які можна розщепити ферментами, такими як пептидази, протеази та протеасоми. Приклади спейсерів або лінкерів включають, проте не обмежуються тільки ними, AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 73087315) або від одного до декількох залишків лізину (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Пептиди цього винаходу охоплюють ті пептиди, які з'єднані з іншими пептидами за допомогою спейсерів або лінкерів. 8 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цьому описі, пептиди цього винаходу можна також описати як "пептид(и) RAB6KIFL", "поліпептид(и) RAB6KIFL" або "олігопептид RAB6KIFL". III. Отримання пептидів RAB6KIFL Пептиди цього винаходу можна отримати, застосовуючи добре відомі способи. Наприклад, пептиди можна отримати шляхом синтезу, застосовуючи технологію рекомбінантної ДНК або хімічний синтез. Пептиди цього винаходу можна синтезувати окремо або як більш довгі поліпептиди, що складаються з двох або більше пептидів. Пептиди можна потім виділити, тобто, очистити або відокремити, так щоб вони були практично вільними від інших природно виникаючих білків клітин-хазяїнів та їх фрагментів або від будь-яких інших хімічних речовин. Пептид цього винаходу можна отримати шляхом хімічного синтезу на основі вибраної амінокислотної послідовності. Приклади традиційних способів синтезу пептидів, які можна адаптувати до цього синтезу, включають, проте не обмежуються тільки ними: (i) Peptide Synthesis ("Синтез пептидів"), Interscience, New York, 1966; (ii) The Proteins ("Білки"), Vol. 2, Academic Press, New York, 1976; (iii) Peptide Synthesis ("Синтез пептидів" (японською мовою)), Maruzen Co., 1975; (iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis ("Основи та експеримент синтезу пептидів" (японською мовою)), Maruzen Co., 1985; (v) Development of Pharmaceuticals (second volume) ("Розробка фармацевтичних препаратів" (другий том) (японською мовою)), Vol. 14 (peptide synthesis "Синтез пептидів"), Hirokawa, 1991; (vi) WO99/67288 та (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118. Альтернативно, пептиди цього винаходу можна отримати, адаптуючи будь-які відомі способи генної інженерії для виробництва пептидів (наприклад, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Наприклад, по-перше, готується придатний вектор, який містить полінуклеотид, що кодує цільовий пептид у придатній для експресії формі (наприклад, праворуч від регуляторної послідовності, що відповідає послідовності промотору), та трансформується у придатній клітиніхазяїні. Клітин-хазяїв потім культивують для виробництва пептидів, які представляють інтерес. Пептид можна також отримати in vitro, адаптуючи систему трансляції in vitro. IV. Полінуклеотиди Цим винаходом також пропонується полінуклеотид, який кодує будь-які з вищезгаданих пептидів цього винаходу. Вони включають полінуклеотиди, що походять від природно виникаючого гена RAB6KIFL/KIF20A (GenBank Accession No. NM_005733 (SEQ ID NO: 1)), а також ті, що мають його консервативно модифіковану нуклеотидну послідовність. У цьому описі фраза "консервативно модифікована нуклеотидна послідовність" означає послідовності, які кодують ідентичні або практично ідентичні амінокислотні послідовності. Внаслідок дегенерації генетичного коду велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодує будьякий даний білок. Наприклад, усі кодони GCA, GCC, GCG та GCU кодують амінокислоту аланін. Отже, на будь-якій позиції, де аланін визначається кодоном, кодон може змінюватися до будьяких відповідних описаних кодонів без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіації нуклеїнових кислот називаються "тихими варіаціями", які є одним з видів консервативно модифікованих варіацій. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти у цьому описі, яка кодує пептид, також описує кожну можливу тиху варіацію нуклеїнової кислоти. Будь-який фахівець у галузі зрозуміє, що кожен кодон у нуклеїновій кислоті (за виключенням AUG, який зазвичай є єдиним кодоном для метіоніну, та TGG, який зазвичай є єдиним кодоном для триптофану) можна модифікувати, внаслідок чого отримати функціонально ідентичну молекулу. Отже, кожна тиха варіація нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, безумовно описується у кожній описаній послідовності. Полінуклеотид цього винаходу може складатися з ДНК, РНК та їхніх похідних. ДНК придатним чином складається з основ, таких як А, Т, С та G, та Т заміщується U в РНК. Полінуклеотид цього винаходу може кодувати множинні пептиди цього винаходу з вставочними амінокислотними послідовностями між ними або без них. Наприклад, вставочна амінокислотна послідовність може утворювати сайт розщеплення (наприклад, послідовність розпізнавання ферментом) полінуклеотиду або трансльованих пептидів. Крім того, полінуклеотид може включати будь-які послідовності, додаткові до кодувальної послідовності, яка кодує пептид цього винаходу. Наприклад, полінуклеотид може бути рекомбінантним полінуклеотидом, який включає регуляторні послідовності, необхідні для експресії пептиду, або може бути вектором експресії (плазмідою) з генами-маркерами та їм подібним. Взагалі, такі рекомбінантні полінуклеотиди можна отримати шляхом маніпуляції полінуклеотидами за допомогою традиційних рекомбінантних способів, застосовуючи, наприклад, полімерази та 9 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ендонуклеази. Як способи хімічного, так і способи рекомбінантного синтезу можна застосовувати для виробництва полінуклеотидів цього винаходу. Наприклад, полінуклеотид можна отримати шляхом вставки у відповідний вектор, який можна експресувати, коли здійснюють трансфекцію у компетентну клітину. Альтернативно, полінуклеотид можна ампліфікувати, застосовуючи способи ПЛР або експресію у придатних хазяїнах (дивись, наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полінуклеотид можна синтезувати, застосовуючи твердофазні способи, як описано у Вeaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5. Вектори, що містять полінуклеотид цього винаходу, та клітини-хазяїни, що містять вектори, також включено до цього винаходу. V. Екзосоми Цим винаходом далі пропонуються внутрішньоклітинні візикули, що називаються екзосомами, які представляють комплекси, утворені між пептидами цього винаходу та HLAантигенами, на їхній поверхні. Екзосоми можна отримати, наприклад, застосовуючи способи, докладно описані у японській патентній заявці Kohyo Publications Nos. Hei 11-510507 та WO99/03499, та їх можна отримати, застосовуючи АРС, отримані від пацієнтів, які піддаються лікуванню та/або профілактиці. Екзосоми цього винаходу можна інокулювати як вакцини, способом, подібним до пептидів цього винаходу. Тип HLA-антигенів, включених у ці комплекси, повинний відповідати суб'єктові, який потребує лікування та/або профілактики. Застосування типу HLA-A2, який надзвичайно експресується серед японців та людей європеоїдної раси, є сприятливим для отримання ефективних результатів, пичому застосування знаходять такі підтипи, як HLA-A2 (A*0201) та HLA-A2 (A*0206). Зазвичай, у клінічних умовах тип HLA-антигену пацієнта, що потребує лікування, досліджується заздалегідь, що дозволяє зробити належний вибір пептидів, які мають високі рівні афінітету зв'язування з цим антигеном або які мають спроможність індукувати CTL представленням антигену. Крім того, для того, щоб отримати пептиди, які демонструють високий афінітет зв'язування та спроможність індукувати CTL, заміщення або додавання 1, 2 або декількох амінокислот можна виконувати на основі амінокислотної послідовності природно виникаючого часткового пептиду RAB6KIFL. Коли застосовується антиген HLA-A2 (A*0201) для екзосоми цього винаходу, тоді застосування знаходить пептид, що має послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 3, 4 та 5. VI. Антиген-представляючі клітини (APC) Цим винаходом також пропонуються виділені АРС, які представляють комплекси, утворені між HLA-антигенами та пептидами цього винаходу на їх поверхні. АРС, отримані внаслідок контактування пептидів цього винаходу або внаслідок введення полінуклеотидів, що кодують пептиди цього винаходу у формі, спроможній експресуватися, можуть походити від пацієнтів, які піддаються лікуванню та/або профілактиці, та їх можна вводити самостійно як вакцини або у комбінації з іншими ліками, включаючи пептиди цього винаходу, екзосоми або цитотоксичні Тклітини. АРС не обмежуються певним типом клітин та включають дендритні клітини (DC), клітини Лангерганса, макрофаги, В-клітини та активовані Т-клітини, про які відомо, що вони представляють білкові антигени на їхній клітинній поверхні, так що вони розпізнаються лімфоцитами. Оскільки дендритна клітина (DC) - це представник АРС, що має найбільш сильну CTL-індукуючу дію серед АРС, то дендритні клітини (DC) знаходять застосування як АРС цього винаходу. Наприклад, АРС можна отримати шляхом індукування DC від моноцитів периферійної крові з наступним контактуванням (стимулюванням) їх з пептидами цього винаходу in vitro, ex vivo або in vivo. Коли пептиди цього винаходу вводяться суб'єктам, тоді АРС, що представляють пептиди цього винаходу, індукуються в організмі суб'єкта. Фраза "індукування АРС" включає контактування (стимулювання) клітини з пептидами цього винаходу або нуклеотидами, що кодують пептиди цього винаходу, щоб представляти комплекси, утворені між HLA-антигенами та пептидами цього винаходу, на поверхні клітини. Альтернативно, після введення пептидів цього винаходу в АРС для того, щоб АРС представляли пептиди, АРС можна вводити суб'єктові як вакцину. Наприклад, введення ex vivo може включати наступні етапи: a: збирання АРС у першого суб'єкта; b: контактування АРС з етапу "а" з пептидом; та с: введення завантажених пептидом АРС другому суб'єктові. Перший суб'єкт та другий суб'єкт можуть бути одним і тим же суб'єктом або можуть бути різними суб'єктами. Альтернативно, згідно з цим винаходом, пропонується застосування 10 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пептидів цього винаходу для виробництва фармацевтичної композиції, яка індукує антигенпредставляючі клітини. Крім того, цим винаходом пропонується спосіб або процес виготовлення фармацевтичної композиції для індукування антиген-представляючих клітин, де спосіб включає етап змішування або введення до складу пептиду цього винаходу з фармачевтично прийнятним носієм. Альтернативно, цим винаходом пропонується спосіб або процес виробництва фармацевтичної композиції для лікування раку, включаючи рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарциному, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів (SCLC), де спосіб включає етап змішування або введення до складу пептиду цього винаходу з фармацевтично прийнятним носієм. Крім того, цим винаходом також пропонуються пептиди цього винаходу для індукування антиген-представляючих клітин. АРС, отримані на етапі "b", можна вводити суб'єктові як вакцину. Альтернативно, цим винаходом пропонуються пептиди для лікування раку, включаючи рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарциному, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів (SCLC). Згідно з одним аспектом цього винаходу АРС цього винаходу мають високий рівень спроможності індукувати CTL. У терміні "високий рівень спроможності індукувати CTL" високий рівень порівнюється з рівнем, за яким АРС не контактують з жодним пептидом або контактують з пептидами, які не можуть індукувати CTL. Такі АРС, що мають високий рівень спроможності індукувати CTL, можна отримати за способом, який включає етап переносу генів, які містять полінуклеотиди, що кодують пептиди цього винаходу, до АРС in vitro. Введені гени можуть бути у формі ДНК або РНК. Приклади способів для введення включають, без особливих обмежень, різні способи, що традиційно виконуються у цій галузі, можна застосовувати такі способи як ліпофекція, електропорація та спосіб осадження з фосфатом кальцію. Більш специфічно, введення можна здійснювати так, як описано у Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; в опублікованому перекладі японською мовою No. 2000-509281 міжнародної публікації. При переносі гена в АРС ген піддається транскрипції, трансляції тощо у клітині, а потім отриманий білок обробляється МНС класу І або класу ІІ, та він просувається шляхом представлення, щоб представити пептиди. У переважному варіанті здійснення АРС цього винаходу представляють на своїй поверхні комплекс HLA-антигену та олігопептиду, який включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 3, 4 та 5. Переважно, АРС цього винаходу несуть на своїй поверхні антиген HLA-A2, зокрема HLA-A2 (A*0201). Альтернативно, олігопептид, що утворює комплекс з HLA-антигеном, може бути олігопептидом, який включає амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 3, 4 та 5, де одна, дві або декілька амінокислот заміщені, вставлені, видалені та/або додані, наприклад, друга амінокислота від N-закінчення може бути заміщена лейцином або метіоніном, та/або амінокислота на С-закінченні може бути заміщена валіном або лейцином. VII. Цитотоксичні Т-клітини (CTL) Цитотоксична Т-клітина, індукована проти будь-яких пептидів цього винаходу, підсилює імунну реакцію, спрямовану на пов'язаний з пухлиною ендотелій in vivo, та внаслідок цього її можна застосовувати як вакцину таким же чином, що й пептиди самі по собі. Отже, цим винаходом також пропонуються виділені цитотоксичні Т-клітини, які специфічно індукуються або активуються будь-яким з цих пептидів. Такі цитотоксичні Т-клітини можна отримати шляхом (1) введення суб'єктові з наступним збиранням цитотоксичних Т-клітин від пацієнта або (2) шляхом контактування (стимулювання) похідних від суб'єкта АРС та CD8-позитивних клітин або мононуклеарних лейкоцитів периферійної крові in vitro з пептидами цього винаходу з наступним виділенням цитотоксичних Т-клітин. Цитотоксичні Т-клітини, які індукувалися внаслідок стимуляції від АРС, що представляють пептиди цього винаходу, можуть походити від пацієнтів, які піддаються лікуванню та/або профілактиці, та їх можна вводити самостійно або у комбінації з іншими ліками, включаючи пептиди цього винаходу або екзосоми з метою регулювання ефектів. Отримані цитотоксичні Тклітини діють специфічно проти клітин-мішеней, що представляють пептиди цього винаходу, або, наприклад, такі самі пептиди, що застосовувалися для індукції. Іншими словами, цитотоксичні Т-клітини можуть розпізнавати (тобто, зв'язуватися з) комплекс, утворений між HLA-антигеном та пептидом цього винаходу на поверхні клітини-мішені, за допомогою рецептора Т-клітин, а потім атакувати клітину-мішень, щоб викликати загибель клітини-мішені. Клітини-мішені можуть бути клітинами, які ендогенно експресують RAB6KIFL, або клітинами, які трансфектовані геном RAB6KIFL; та клітини, які представляють пептид цього винаходу на клітинній поверхні внаслідок стимуляції пептидом, можуть також служити як мішень активованої 11 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 атаки CTL. У переважному варіанті здійснення клітини-мішені несуть на своїй поверхні антиген HLA-A2, зокрема HLA-A2 (A*020). VIII. Рецептор Т-клітин (TCR) Цим винаходом також пропонується композиція, що складається з нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептиди, які спроможні утворювати субодиницю рецептора Тклітини (TCR), та способи застосування цієї композиції. Альфа і бета TCR мають спроможність утворювати TCR, який надає специфічності Т-клітинам проти пухлинних клітин, що експресують RAB6KIFL. Застосовуючи відомі у галузі способи, нуклеотидні послідовності ланцюгів альфа та бета TCR, що експресуються у CTL, індукованій одним або більше пептидами цього винаходу, можна виділити та застосовувати для побудови придатних векторів, які можуть опосередковувати високоефективний перенос генів в первинні лімфоцити людини (WO2007/032255 та Morgan RA, et al., J Immunol, 171, 3287 (2003)). Наприклад, ці вектори є ретровірусними векторами. Переважно, цим винаходом пропонують готову композицію, що дозволяє швидко модифікувати власні Т-клітини пацієнта (або Т-клітини іншого ссавця), щоб швидко та легко виробити модифіковані Т-клітини, які мають відмінні властивості вбивати ракові клітини. Крім того, цим винаходом пропонуються CTL, які отримують шляхом трансдукції нуклеїновими кислотами, що кодують субодиниці поліпептидів TCR, які зв'язуються з пептидом RAB6KIFL, наприклад, SEQ ID NO: 3, 4 та 5 у контексті HLA-A2 (A*0201). Трансдуковані CTL є спроможними забезпечувати хомінг раковим клітинам in vivo, та їх можна розмножувати за добре відомими способами культивування in vitro (наприклад, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Т-клітини винаходу можна застосовувати для створення імуногенної композиції, корисної при лікуванні або профілактиці раку у пацієнта, якому потрібне лікування або профілактика (WO2006/031221). IX. Фармацевтичні агенти або композиції Терміни "попередження" та "профілактика" є взаємозамінними у цьому описі, та вони означають будь-яку активність, яка знижує смертність або захворюваність від хвороби. Попередження та профілактика можуть виникати на "первинному, вторинному та третинному рівнях попередження". У той час, коли первинне попередження та профілактика дозволяють уникнути розвитку хвороби, вторинний та третинний рівні попередження та профілактики охоплюють діяльність, спрямовану на попередження та профілактику прогресування хвороби та прояву симптомів, а також на зменшення негативного впливу хвороби, що вже виникла, шляхом відновлення функції та зменшення пов'язаних з хворобою ускладнень. Альтернативно, попередження та профілактика можуть включати широкий ряд заходів профілактичного лікування, спрямованого на уникнення суворості певного розладу, наприклад, на зменшення проліферації та метастазу пухлин. Лікування та/або профілактика раку та/або попередження його післяопераційного рецидиву включають будь-які з наступних етапів, такі як хірургічне видалення ракових клітин, інгібування росту ракових клітин, зворотній розвиток або регресію пухлини, індукцію ремісії та пригнічення виникнення раку, регресію пухлини та зменшення або інгібування розвитку метастазу. Ефективне лікування та/або профілактика раку зменшують смертність та покращують прогноз пацієнтів, що мають рак, знижують рівні онкомаркерів у крові та полегшують помітні симптоми, що супроводжують рак. Наприклад, зменшення або поліпшення симптомів, що складають ефективне лікування та/або профілактику, включають зменшення симптомів на 10 %, 20 %, 30 % або більше, або стабілізацію хвороби. Оскільки експресія RAB6KIFL зазнає підвищувальної регуляції при декількох видах раку порівняно зі здоровою тканиною, то пептиди цього винаходу або полінуклеотиди, що кодують такі пептиди, можна застосовувати для лікування та/або профілактики раку, та/або попередження його післяопераційного рецидиву. Отже, цим винаходом пропонується фармацевтичний агент або композиція для лікування та/або профілактики раку, та/або попередження його післяопераційного рецидиву, який включає як активний інгредієнт один або більше пептидів цього винаходу або полінуклеотиди, що кодують пептиди. Альтернативно, пептиди цього винаходу можна експресувати на поверхні будь-яких вищезгаданих екзосом або клітин, таких як АРС, для застосування як фармацевтичних агентів або композиції. Крім того, вищезгадані цитотоксичні Т-клітини, які улучають у будь-який з пептидів цього винаходу, можна також застосовувати як активний інгредієнт фармацевтичних агентів або композиції цього винаходу. У контексті цього винаходу фраза "улучання у пептид" позначає розпізнавання (тобто, зв'язування з) комплексу, утвореного між HLA-антигеном та пептидом на поверхні клітинимішені за допомогою рецептора Т-клітин, а потім здійснення атаки на клітини-мішені для того, щоб викликати смерть клітини-мішені. 12 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті здійснення цим винаходом також пропонується застосування активного інгредієнта, вибраного з: (а) пептиду цього винаходу; (b) нуклеїнової кислоти, що кодує такий пептид, як описано у цьому описі, у формі, що може експресуватися; (c) АРС цього винаходу та (d) цитотоксичних Т-клітин цього винаходу для виробництва фармацевтичної композиції або агента для лікування раку. Альтернативно, цим винаходом далі пропонується активний інгредієнт, вибраний з: (а) пептиду цього винаходу; (b) нуклеїнової кислоти, що кодує такий пептид, як описано у цьому описі, у формі, що може експресуватися; (c) АРС цього винаходу та (d) цитотоксичних Т-клітин цього винаходу для застосування під час лікування раку. Альтернативно, цим винаходом далі пропонується спосіб або процес виробництва фармацевтичної композиції або агента для лікування раку, де спосіб або процес включає етап приготування складу фармацевтично або фізіологічно прийнятного носія разом з активним інгредієнтом, вибраним з: (а) пептиду цього винаходу; (b) нуклеїнової кислоти, що кодує такий пептид, як описано у цьому описі, у формі, що може експресуватися; (c) АРС цього винаходу та (d) цитотоксичних Т-клітин цього винаходу як активних інгредієнтів. В іншому варіанті здійснення цим винаходом також пропонується спосіб або процес виробництва фармацевтичної композиції або агента для лікування раку, де спосіб або процес включає етап змішування активного інгредієнта з фармацевтично або фізіологічно прийнятним носієм, де активний інгредієнт вибраний з: (а) пептиду цього винаходу; (b) нуклеїнової кислоти, що кодує такий пептид, як описано у цьому описі, у формі, що може експресуватися; (c) АРС цього винаходу та (d) цитотоксичних Т-клітин цього винаходу. Альтернативно, фармацевтичну композицію або агент цього винаходу можна застосовувати або для профілактики раку, або для попередження його післяопераційного рецидиву, або як для одного, так і для другого. Фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу знаходять застосування як вакцини. У контексті цього винаходу термін "вакцина" (також називається імуногенною композицією) означає речовину, що має функцію індукувати протипухлинний імунітет після інокуляції тваринам. Фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу можна застосовувати для лікування та/або профілактики раку, та/або попередження його післяопераційного рецидиву у суб'єктів або пацієнтів, які включають людей та будь-яких інших ссавців, які включають, проте не обмежуються лише ними, мишей, щурів, морських свинок, кролів, котів, собак, овець, козлів, свиней, крупну рогату худобу, коней, мавп, павіанів та шимпанзе, особливо комерційно важливих тварин або свійських тварин. Згідно з цим винаходом було визначено, що олігопептиди, які мають амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 3, 4 та 5, є HLA-A2 (A*0201)-обмеженими епітопними пептидами, які можуть індукувати сильну та специфічну імунну реакцію. Отже, фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу, які включають будь-який з цих олігопептидів з амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 3, 4 або 5, є особливо придатними для введення суб'єктам, HLA-антиген яких – це HLA-A2 (A*0201). Теж саме стосується і фармацевтичних агентів або композицій, які включають полінуклеотиди, що кодують будь-який з цих олігопептидів. Типи раку, які слід лікувати фармацевтичними агентами або композиціями цього винаходу, не обмежуються та включають усі типи раку, у які залучений RAB6KIFL, включаючи, наприклад, рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарциному, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів(SCLC). Зокрема, фармацевтичні агенти або композиції цього 13 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу переважно застосовуються до раку підшлункової залози. Фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу можуть містити як додаток до вищезгаданих активних інгредієнтів інші пептиди, які мають спроможність індукувати CTL проти ракових клітин, інші полінуклеотиди, що кодують інші пептиди, інші клітини, що представляють інші пептиди, та їм подібне. У цьому описі прикладами інших пептидів, що мають спроможність індукувати CTL проти ракових клітин, є специфічні для раку антигени (наприклад, ідентифіковані ТАА), проте вони ними не обмежуються. За необхідністю, фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу можуть необов'язково включати інші терапевтичні речовини як активний інгредієнт доти, доки ця речовина не інгібує протипухлинний ефект активного інгредієнта, наприклад, будь-якого пептиду цього винаходу. Наприклад, фармацевтичні склади можуть включати протизапалювальні агенти або композиції, знеболювальні речовини, хіміотерапевтичні агенти та їм подібне. Окрім включення інших терапевтичних речовин у самий медикамент, медикаменти цього винаходу можна також вводити послідовно або одночасно з одним або більше іншими фармакологічними агентами або композиціями. Кількість медикаменту та фармакологічного агента або композицій залежить, наприклад, від того, який тип фармакологічного агента (агентів) або композиції (композицій) застосовується, хвороби, яку лікують, та розкладу та способів введення. Слід розуміти, що окрім інгредієнтів, особливо згаданих у цьому описі, фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу можуть включати інші агенти або композиції, що є традиційними у галузі, враховуючи тип даного фармацевтичного складу. В одному варіанті здійснення цього винаходу фармацевтичні агенти або композиції можуть бути включені в одиниці виробництва та набори, що містять матеріали, корисні для лікування патологічних станів хвороби, яку слід лікувати, наприклад, раку. Одиниця виробництва може включати контейнер з будь-якими фармацевтичними агентами або композиціями цього винаходу з етикеткою. Придатні контейнери включають пляшечки, ампули та тестові пробірки. Контейнери можуть бути виготовленими з різноманітних матеріалів, таких як скло або пластик. Етикетка на контейнері мусить вказувати, що цей агент або композиції застосовуються для лікування або профілактики одного або більше станів хвороби. Етикетка може також вказувати на способи введення тощо. Окрім контейнера, описаного вище, набір, що включає фармацевтичний агент або композиції цього винаходу, може необов'язково включати іще і другий контейнер, що містить фармацевтично прийнятний розріджувач. Крім того, він може включати інші матеріали, що є бажаними з комерційної точки зору та з точки зору користувача, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци та вкладиші упаковки з інструкціями для застосування. Фармацевтичні композиції можуть, за бажанням, бути представленими у блоці або у розподілювальному пристрої, який може містити одну або більше стандартних лікарських форм, які містять активний інгредієнт. Блок, наприклад, включає металеву або пластмасову фольгу, таку як блістерний блок. Блок або розподілювальний пристрій можуть супроводжуватися інструкціями для введення. (1) Фармацевтичні агенти або композиції, що містять пептиди як активний інгредієнт Пептиди цього винаходу можуть вводитися безпосередньо як фармацевтичний агент або як композиції, якщо це необхідно, фармацевтичний склад яких зроблений за традиційними способами виготовлення фармацевтичних складів. В останньому випадку окрім пептидів цього винаходу носії, ексципієнти та їм подібне, що зазвичай застосовується для ліків, можна включити як відповідне без особливих обмежень. Прикладами таких носіїв є стерилізована вода, фізіологічний сольовий розчин, фосфатний буфер, культуральна рідина тощо. Крім того, фармацевтичні агенти або композиції можуть містити за необхідністю стабілізатори, суспензії, консерванти, поверхнево-активні речовини (ПАР) тощо. Фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу можна застосовувати для протиракового лікування. Пептиди цього винаходу можна приготувати у вигляді комбінації, що складається з двох або більше пептидів цього винаходу, для того, щоб індукувати CTL in vivo. Комбінація пептидів може мати форму коктейлю, або її інгредієнти можна з'єднати, застосовуючи стандартні способи. Наприклад, пептиди можна хімічно зшити або експресувати як єдину злиту поліпептидну послідовність. Пептиди у комбінації можуть бути однаковими або відмінними. Коли вводять пептиди цього винаходу, тоді ці пептиди представлені з високою щільністю HLA-антигенами на АРС, а потім індукуються CTL, які специфічно реагують у напрямку комплексу, утвореного між представленим пептидом та HLA-антигеном. Альтернативно, АРС, що представляють будь-який з пептидів цього винаходу на їхніх клітинних поверхнях, отримують шляхом видалення АРС (наприклад, DC) з суб'єктів, які стимулюються пептидами цього винаходу, CTL індукується у 14 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 суб'єктів внаслідок повторного введення цих АРС (наприклад, DC) суб'єктам, та, як слідство, може підвищуватися агресивність до ракових клітин, таких як рак сечового міхура, рак молочної залози, холангіокарцинома, рак стравоходу, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак підшлункової залози, рак простати, рак нирки та дрібноклітинний рак легенів(SCLC). Фармацевтичні агенти або композиції для лікування та/або профілактики раку, які включають пептид цього винаходу як активний інгредієнт, можуть також включати ад'ювант, про який відомо, що він ефективно утворює клітинний імунітет. Альтернативно, їх можна вводити з іншими активними інгредієнтами, та їх можна вводити у вигляді гранул як фармацевтичного складу. Ад'ювант означає сполуку, яка підсилює імунну реакцію проти білка, коли її вводять разом (або послідовно) з білком, що має імунологічну активність. Передбачені у цьому описі ад'юванти включають ті ад'юванти, які описані у літературі (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Приклади придатних ад'ювантів включають, проте не обмежуються лиши ними, фосфат алюмінію, гідроксид алюмінію, галун, токсин холери, токсин сальмонели та їм подібне. Крім того, можна традиційно застосовувати фармацевтичні склади з ліпосомами та фармацевтичні склади у вигляді гранул, у яких пептид зв'язується з гранулами, що мають діаметр декілька мікрометрів, та фармацевтичні склади, у яких ліпід зв'язаний з пептидом. У деяких варіантах здійснення фармацевтичні агенти або композиції винаходу можуть далі включати компонент, який первинно діє на CTL. Ліпіди визначили як агенти або композиції, спроможні здійснювати первинну дію на CTL in vivo проти вірусних антигенів. Наприклад, залишки пальмітинової кислоти можна приєднати до епсилон- та альфа-аміногруп залишку лізину, а потім зшити з пептидом цього винаходу. Ліпідований пептид можна потім вводити або безпосередньо у міцелій або частинку, включену в ліпосому, або емульгувати в ад'юванті. Як інший приклад ліпідного первинного стимулювання реакцій CTL, ліпопротеїни Е. coli, такі як трипальмітоїл-S-гліцерилцистеїнлізерил-серин (P3CSS) можна застосовувати для первинного стимулювання CTL, коли їх ковалентно приєднують до відповідного пептиду (дивись, наприклад, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4). Спосіб введення може бути пероральним, інтрадермальним, підшкірним, може бути внутрішньовенною ін'єкцією або їм подібним, та введення може бути системним або місцевим поблизу ділянок, що є мішенями. Введення можна виконувати як єдине введення, або воно може бути підсилене внаслідок чисельних введень. Дозу пептидів цього винаходу можна привести у відповідність належним чином, залежно від хвороби, яку слід лікувати, віку пацієнта, маси, способу введення та їм подібного, та вона зазвичай становить від 0,001 мг до 1000 мг, наприклад, від 0,001 мг до 1000 мг, наприклад, від 0,1 мг до 10 мг, та її можна вводити від одного разу на декілька днів до одного разу на декілька місяців. Фахівець у галузі зможе відповідним чином вибрати придатну дозу. (2) Фармацевтичні агенти або композиції, що містять полінуклеотиди як активний інгредієнт Фармацевтичні агенти або композиції цього винаходу можуть також містити нуклеїнові кислоти, що кодують пептиди, описані у цьому описі, у формі, що може експресуватися. У цьому описі фраза "у формі, що може експресуватися" означає, що полінуклеотид, коли його вводять у клітину, буде експресуватися in vivo як поліпептид, який індукує протипухлинний імунітет. У прикладі варіанту здійснення нуклеотидна послідовність полінуклеотиду, що представляє інтерес, включає регуляторні елементи, необхідні для експресії полінуклеотиду. Полінуклеотид (полінуклеотиди) може бути влаштований так, щоб здійснити стійку вставку у геном клітинимішені (дивись, наприклад, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 для опису гомологічних рекомбінаційних касетних векторів). Дивись, наприклад, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; патенти США №№ 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647 та WO 98/04720. Приклади способів доставки на основі ДНК включають "голу ДНК", полегшену доставку (бупівакаїн, полімери, пептид-опосердкована), катіонні ліпідні комплекси та опосередковану частинками (генна гармата) або опосередковану тиском доставку (дивись, наприклад, патент США № 5,922,687). Пептиди цього винаходу можуть також експресуватися вірусними або бактеріальними векторами. Приклади векторів експресіє включають ослаблені вірусні хазяїни, такі як коров'яча віспа або пташина віспа. Цей підхід застосовує вірус коров'ячої віспи, наприклад, як вектора для експресії нуклеотидних послідовностей, що кодують пептид. Після введення хазяїну рекомбінантний вірус коров'ячої віспи експресує імуногенний пептид та, тим самим, викликає імунну реакцію. Вектори коров'ячої віспи та способи, що є корисними у протоколах імунізації, описано, наприклад, у патенті США № 4,722,848. Приклад іншого вектора включає BCG (Bacille Calmette Guerin). Вектори BCG описано у Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Очевидною буде велика різноманітність інших векторів, що є корисними для терапевтичного введення або імунізації, наприклад, вектори аденовірусів та адено-пов'язаних вірусів, ретровірусні вектори, 15 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вектори Salmonella typhi, детоксифіковані вектори токсину сибірської виразки та їм подібні. Дивись, наприклад, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85. Доставка полінуклеотиду в організм суб'єкта може бути або прямою, у випадку якої суб'єкт безпосередньо піддається дії вектора, що є носієм полінуклеотиду, або непрямою, у випадку якої клітини, по-перше, трансформуються полінуклеотидом, що представляє інтерес, in vitro, потім ці клітини трансплантуються суб'єктові. Ці два підходи називаються, відповідно, генною терапією in vivo та генною терапією ex vivo. Загальний огляд способів генної терапії представлено у Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Загально відомі у галузі способи технології з використанням рекомбінантної ДНК, які також можна застосовувати для цього винаходу, описано у наступних роботах: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; та Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990. Спосіб введення може бути пероральним, інтрадермальним, підшкірним, внутрішньовенною ін'єкцією або їм подібним, та введення може бути системним або місцевим поблизу ділянок, що є мішенями. Ведення можна виконувати як єдине введення, або воно може бути підсиленим шляхом чисельних введень. Дозу полінуклеотиду у придатному носії, або клітин, трансформованих полінуклеотидом, що кодує пептиди цього винаходу, можна зробити належним чином відповідною, залежно від хвороби, яку слід лікувати, віку пацієнта, маси, способу введення та їм подібного, та вона зазвичай становить від 0,001 мг до 1000 мг, наприклад, від 0,001 мг до 1000 мг, наприклад, від 0,1 мг до 10 мг, та її можна вводити від одного разу на декілька днів до одного разу на декілька місяців. Фахівець у галузі зможе відповідним чином вибрати придатну дозу. X. Способи, в яких використовуються пептиди, екзосоми, АРС та CTL Пептиди цього винаходу та полінуклеотиди, що кодують такі пептиди, можна застосовувати для індукування АРС та CTL. Екзосоми та АРС цього винаходу можна також застосовувати для індукування CTL. Пептиди, полінуклеотиди, екзосоми та АРС можна застосовувати у комбінації з будь-якими іншими сполуками доти, доки ці сполуки не інгібують їх спроможність індукувати CTL. Отже, будь-які з вищезгаданих фармацевтичних агентів або композицій цього винаходу можна застосовувати для індукування CTL, та окрім них, ті фармацевтичні агенти або композиції, що включають пептиди та полінуклеотиди, можна також застосовувати для індукування АРС, як обговорюється далі. (1) Спосіб індукування антиген-представляючих клітин (АРС) Цим винаходом пропонуються способи індукування АРС із застосуванням пептидів цього винаходу або полінуклеотидів, що кодують пептиди. Індукцію АРС можна здійснювати, як описано вище у розділі "VI. Антиген-представляючі клітини". Цим винаходом також пропонується спосіб індукування АРС, що мають високий рівень спроможності індукувати CTL, індукцію яких також згадували у розділі "VI. Антиген-представляючі клітини", вище. Переважно, способи індукування АРС включають, принаймні один етап, вибраний з: а: контактування АРС з пептидами цього винаходу та b: введення поліпептидів цього винаходу у спроможній експресуватися формі в АРС. Такі способи індукування АРС переважно виконують in vitro або ex vivo. При застосуванні способів in vitro або ex vivo АРС, які слід індукувати, можна отримати від суб'єкта, якого слід лікувати, або інших суб'єктів, HLA-антигени яких є такими ж самими, що і HLA-антигени суб'єкта. У переважному варіанті здійснення АРС, що індукуються за способами цього винаходу, несуть на своїй поверхні HLA-A2-антиген, зокрема HLA-A2 (A*0201). (2) Спосіб індукування CTL Крім того, цим винаходом пропонуються способи індукування CTL із застосуванням пептидів цього винаходу, полінуклеотидів, що кодують пептиди, або екзосом, або АРС, що представляють пептиди. Цим винаходом також пропонуються способи індукування CTL із застосуванням полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який є спроможним утворювати субодиницю рецептора Tклітин (TCR), яка розпізнає (тобто, зв'язується з) комплекс пептидів цього винаходу та HLAантигенів на клітинній поверхні. Переважно, спосіб індукування CTL включає принаймні один етап, вибраний з: a: контактування CD8-позитивних Т-клітин з антиген-представляючою клітиною та/або екзосомою, які представляють на своїй поверхні комплекс HLA-антигену та пептиду цього 16 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу, та b: введення полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який є спроможним утворювати субодиницю TCR, яка розпізнає комплекс пептиду цього винаходу та HLA-антигену, у CD8позитивну Т-клітину. Коли пептиди цього винаходу вводяться суб'єктові, тоді CTL індукується в організмі суб'єкта, та підвищується сила імунної реакції, спрямованої на пов'язаний з пухлиною ендотелій. Альтернативно, ці пептиди та полінуклеотиди, що кодують ці пептиди, можна застосовувати для терапевтичного способу ex vivo, при якому АРС, що походять від суб'єкта, та CD8-позитивні клітини або мононуклеарні лейкоцити периферійної крові контактують (стимулюються) пептидами цього винаходу in vitro, та після індукування CTL активовані клітини CTL повертають суб'єктові. Наприклад, спосіб може включати наступні етапи: а: збирання АРС від суб'єкта, b: контактування АРС з етапу "а" з пептидом, 8+ c: змішування АРС з етапу "b" з T-клітинами CD та культивування їх разом для індукування CTL та 8+ d: збирання T-клітин CD зі спільної культури з етапу "c". Альтернативно, згідно з цим винаходом запропоновано застосування пептидів цього винаходу для виробництва фармацевтичної композиції, яка індукує CTL. Крім того, цим винаходом пропонується спосіб або процес виробництва фармацевтичного агента або композиції, які індукують CTL, де спосіб включає етап змішування або створення фармацевтичного складу пептиду цього винаходу з фармацевтично прийнятним носієм. Крім того, цим винаходом також пропонується пептид цього винаходу для індукування CTL. + T-клітини CD8 , які мають цитотоксичну активність та які отримано на етапі "d", можна + вводити суб'єктові як вакцини. АРС, які слід змішувати з CD8 T-клітинами на вищезгаданому етапі "с", можна також отримати внаслідок переносу генів, що кодують пептиди цього винаходу, в АРС, як докладно описано у розділі "VI. Антиген-представляючі клітини", проте вони не обмежуються лише ними, та будь-яку АРС або екзосому, яка ефективно представляє пептиди цього винаходу Т-клітинам, можна застосовувати у способі цього винаходу. Хоча способи та матеріали, подібні або еквівалентні тим способам та матеріалам, що описані у цьому описі, можна застосовувати на практиці або під час тестування цього винаходу, ми описуємо придатні способи та матеріали. Усі публікації, патентні заявки, патенти та інші посилання, що згадуються у цьому описі, включено до цього опису шляхом посилання у їхньому повному обсязі. У випадку конфлікту цей опис винаходу, включаючи визначення, буде визначальним. Крім того, матеріали, способи та приклади мають тільки ілюстративний характер та не призначенні для обмеження. Наступні приклади наведено з метою проілюструвати цей винахід та допомогти звичайному фахівцю у галузі зробити та використовувати таке ж саме. У жодному випадку приклади не призначені обмежувати обсяг винаходу. ПРИКЛАДИ Матеріали та способи Мікроматричний кДНК-аналіз Аналіз профілю експресії генів шляхом мікроматричного аналізу кДНК виконували, як описано раніше (Nakamura T, et al. Oncogene 2004;23:2385-400). Зразки тканини від раку підшлункової залози та сусідніх неракових здорових тканин підшлункової залози отримали від хірургічних зразків, та усі пацієнти надали свою письмову згоду на участь у цьому досліді. На Фіг. 1С відносний коефіцієнт експресії розрахували, розділивши значення експресії мРНК RAB6KIFL у ракових клітинах на значення експресії мРНК RAB6KIFL у здорових аналогах. На Фіг. 1В відносний коефіцієнт експресії здорових тканин розрахували, розділивши значення експресії мРНК RAB6KIFL у кожній здоровій тканині на значення експресії мРНК RAB6KIFL у контрольній РНК, яка представляла собою суміш рівної кількості зразків РНК з 40 здорових тканин, вказаних на Фіг. 1В. Миші b-/-/Мишей з подвійним нокаутом HLA-A2.1 (HHD) Tgm; H-2D бета 2m , яким ввели b одноланцюговий генний конструкт бета 2m-HLA-A2.1 (альфа 1, альфа 2)-H-2D (альфа 3 трансмембранний цитоплазмовий; HHD) людини, отримали у Департаменті SIDA-Retrovirus, Unite d' Immunite Cellulaire Antivirale, Institute Pasteur, France (підрозділі противірусного клітинного імунітету Інституту Пастера, Франція) (Pascolo S, et al. J Exp Med 1997;185:2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1999;29:3112-21), та вони були люб'язно надані Доктором F.A. Lemonnier. Мишей тримали у Центрі ресурсів та розвитку тварин університету Кумамото, та їх доглядали згідно з інструкціями догляду за тваринами університету Кумамото. 17 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Клітинні лінії та HLA-експресія Клітинну лінію раку підшлункової залози людини PANC1, клітинну лінію раку товстої кишки людини СаСо-2 та HLA-A2 (A*0201)-позитивну клітинну лінію Т2 з дефіцитом ТАР купили у RikenCell Bank (Tsukuba, Japan). Клітинну лінію РК8 раку підшлункової залози людини було люб'язно надано Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University (Sendai, Japan). Клітинну лінію SKHep1 раку печінки людини було люб'язно надано Dr. Kyogo Ito, Kurume University (Kurume, Japan). Експресію HLA-A2 досліджували із застосуванням проточної цитометрії з моноклональним антитілом (mAb) проти HLA-A2, ВВ7,2 (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA), з метою вибрати донорів з HLA-A2-позитивною кров'ю та лінії клітин-мішеней для аналізу циотоксичності. Ці клітини зберігали in vitro у середовищі RPMI 1640 або DMEM, до якого було додано 10 % FCS в атмосфері 5 % CO2 при 37 °C. Пацієнти, зразки крові та пухлинні тканини Клінічні дослідження із застосуванням РВМС від донорів було ухвалено Institutional Review Board of Kumamoto University, Kumamoto, Japan. Зразки крові, ракових та сусідніх неракових тканин отримали під час звичайних діагностичних процедур після отримання офіційних письмових згод пацієнтів у Kumamoto University Hospital. Зразки крові також отримали від здорових донорів після отримання їхньої письмової згоди. Усі зразки були анонімними, пронумеровані випадково, та їх зберігали при -80 °C до застосування. Усі пацієнти та здорові донори були японської національності. RT-PCR та нозерн-блот аналіз Аналіз з використанням полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (RTPCR) здорових та ракових тканин та клітинних ліній виконували для оцінки експресії RAB6KIFL на рівні мРНК. Праймерні послідовності були наступними: RAB6KIFL, смислова 5'CTACAAGCACCCAAGGACTCT-3' (SEQ ID NO: 6) та антисмислова 5'AGATGGAGAAGCGAATGTTT-3' (SEQ ID NO: 7) та бета-актин, смислова 5'CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3' (SEQ ID NO: 8) та антисмислова 5'TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3' (SEQ ID NO: 9), та застосовували реакції RT-PCR, які складалися з початкової денатурації при 94 °C протягом 5 хвилин та 32-35 циклів ампліфікації при температурі відпалу 58 °C. Після нормалізації мРНК бета-актину як контролю порівнювали експресію мРНК RAB6KIFL у тканинах та клітинних лініях. Вестерн-блот аналіз та імуногістохімічне обстеження Вестерн-блотинг та імуногістохімічне забарвлення білка RAB6KIFL виконували, як описано раніше (Nakatsura T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44. Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48.). Для вестерн-блот аналізів здорових тканин людини застосовували зроблений заздалегідь блот здорової тканини дорослої людини (Biochain, Hayward, CA). Первинні антитіла, що застосовуються у цьому описі, поліклональне антитіло проти RAB6KIFL та моноклональне антитіло проти b-актину, купили у Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX, USA) та Sigma (Steinheim, Germany), відповідно. Імуногістохімічне забарвлення CD4 або CD8 у тканинних зразках HLA-A2.1 (HHD) Tgm, імунізованих пептидом RAB6KIFL-A2-10-284, здійснювали, як описано раніше (Matsuyoshi H, et al. 2004;172:776-86). Перенос гена за допомогою лентивіруса Перенос генів, опосередкований лентивірусним вектором, здійснювали, як описано раніше (Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Tahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002; 30:117). Стисло кажучи, 17 мкг самоінактивуючих векторів CSII-CMV-RfA та CSIIEF-RfA (Miyoshi H, et al. J Virol 1998; 72: 8150-7), що несуть кДНК RAB6KIFL, та 10 мкг pCMV-VSV-G-RSV-Rev та pCAG-HIVgp трансфектували у клітини 293Т, вирощені у 10-мм чашці з культурою, застосовуючи реагент Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Після 60 годин трансфекції середовище відновили та вірусні частинки осадили шляхом ультрацентрифугування (50000 х g, 2 години). Осад суспендували у 50 мкл середовища RPMI 4 1640 та 10 мкл вірусної суспензії додали до 5 × 10 клітин SKHep1 у кожну комірку плоскодонного планшета з 96 комірками. Експресію трансфектованого гена RAB6KIFL підтвердили за допомогою вестерн-блот аналізу. Індукція RAB6KIFL-реактивних мишачих CTL та імуноферментний спот-аналіз IFN-гама Пептиди, що походять від RAB6KIFL людини (чистота >95 %), що несуть зв'язувальні мотиви для молекул, що кодуються HLA-A2 (A*0201), вибрали, застосовуючи програмне забезпечення BIMAS (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH, Bethesda, MD), та синтезували 36 пептидів (American Peptide Company, CA, USA). HLA-A2обмежений пептид ВІЛ (SLYNTYATL) (SEQ ID NO: 10) застосовували як нерелевантний пептид. Імунізацію мишей пептидами виконували, як описано раніше (Nakatsura T, et al. Biochem Biophys 5 Res Commun 2003; 306:16-25). Частоту клітин, що виробляють IFN-гама/1 × 10 CD4 клітин 18 UA 102274 C2 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 селезінки після стимуляції сингенними BM-DC (1 × 10 /комірку), міченими пептидами або не міченими пептидами, проаналізували за допомогою імуноферментного спот-аналізу (ELISPOT), як описано раніше (Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-97). Індукція RAB6KIFL-реактивних CTL людини Пептиди, які походять від RAB6KIFL людини (чистота >95 %) та які несуть зв'язувальні мотиви для кодованих HLA-A2 (A*0201) молекул, вибрали, застосовуючи програмне забезпечення BIMAS (BioInformatics and Molecular Analysis Section, Center for Information Technology, NIH, Bethesda, MD), та синтезували 36 пептидів (American Peptide Company, CA, USA) (Таблиці 1А та 1В). Похідні від моноцитів DC застосовували як антиген-представляючі клітини, щоб індукувати реакції CTL проти пептидів, представлених у контексті HLA. DC генерували у культурі in vitro, як описано раніше (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; в друці, Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; в друці). Стисло кажучи, РВМС, виділені від здорового добровольця, позитивного щодо HLA-A2, сортували шляхом застосування розчину Ficoll-Plaque (GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, + + UK) щодо популяції CD8 та популяції CD14 за допомогою мікрогранул (Miltenyi Biotec, Bergisch + Gladbach, Germany). Для того, щоб генерувати DC, популяцію CD14 культивували у присутності 100 нг/мл колонієстимулюючого фактору щодо гранулоцитів-макрофагів (GM-CSF; PeproTec Inc., NJ, USA) та 10 нг/мл інтерлейкіну (IL)-4 (PeproTec) у AIM-V (Invitrogen) з 2 % інактивованої теплом аутологічної плазми. Після 5 днів культивування до чашки додали ОК-432, щоб DC стали зрілими. Через 7 днів після початку культивування генерованих цитокінами DC їх мітили 20 нг/мл HLA-A2-зв'язувальними пептидами у присутності 4 мкг/мл бета 2-мікроглобуліну (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) протягом 2 годин при температурі 37 °C в AIM-V. Ці мічені пептидами DC потім опромінювали (40 Гр (Грей)) та змішали у співвідношенні 1:50 з + аутологічними T-клітинами CD8 , отриманими шляхом позитивної селекції РВМС за допомогою мікрогранул анти-CD8 (Miltenyi Biotec). Ці культури завантажили у планшет із 24 комірками, при 5 6 + цьому кожна комірка містила 1 × 10 мічених пептидом DC, 2 × 10 T-клітин CD8 та 5 нг/мл рекомбінантного IL-7 людини (Wako, Osaka, Japan) у 2 мл AIM-V з 2 % аутологічної плазми. Через два дні до цих культур додали рекомбінантний IL-2 людини (PeproTec Inc.) кінцевої концентрації 20 МО/мл. Дві додаткові щотижневі стимуляції навантаженими пептидом аутологічними DC із застосуванням такої ж самої процедури здійснювали на 7 та 14 дні. Через шість днів після останньої стимуляції антиген-специфічні реакції індукованих CTL досліджували 51 шляхом аналізу вивільнення Cr та імуноферментного спот-аналізу IFN-гама. Реакції CTL проти ракових клітинних ліній CTL культивували разом з кожною з ракових клітин або з міченими Т2-клітинами як 3 клітинами-мішенями (5 × 10 /комірку) при вказаному відношенні "ефектор/мішень" та 51 виконували стандартний аналіз вивільнення Cr, як описано раніше (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48. Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; в друці). Стисло кажучи, клітини51 4 мішені мітили 3,7 кБк Na2 Cr (Perkin Elmer Life Sciences) протягом 1 години при 37 °C в інкубаторі з CO2. Мічені клітини-мішені промили тричі, мічені пептидом клітини-мішені отримали шляхом інкубування клітин з 20 мкг/мл пептиду протягом 3 годин при 37 °C. Клітини-мішені змішали з ефекторними клітинами у кінцевому об'ємі 200 мкл в плоскодонних титраційних мікропланшетах та інкубували. Після 6 годин інкубування 50 мкл надосадової рідини зібрали з кожної комірки та визначили радіоактивність, застосовуючи лічильник гама-частинок. 51 Специфічну цитотоксичність оцінили, розрахувавши відсоток специфічного вивільнення Cr. Блокування HLA класу І або HLA-DR здійснювали, як описано раніше (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004;10:6437-48., Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; в друці). Стисло кажучи, до 51 початку культивування CTL разом з раковою клітинною лінією в аналізі вивільнення Cr або імуноферментному спот-аналізі ракові клітини-мішені інкубували протягом 1 години з 10мкг/мл анти-клас І mAb, W6/32, або 10 мкг/мл анти-HLA-DR mAb, H-DR-1, а потім досліджували вплив mAb на цитотоксичну активність CTL або на виробництво IFN-гама. Статистичний аналіз Двофакторний t-критерій Стьюдента застосовували для оцінки статистичної значущості різниці даних, отриманих внаслідок імуноферментного спот-аналізу, та різниці розміру пухлин між групами лікування. Значення P < 0,05 вважали суттєвим. Статистичний аналіз виконували, застосовуючи комерційний пакет статистичних програм (SPSS для Windows, версія 11.0, Chicago, IL, USA). Результати Ідентифікація гена RAB6KIFL, що зазнає підвищувальної регуляції при раку підшлункової залози та різних злоякісних хворобах, на основі мікроматриці кДНК Застосовуючи геномну широку мікроматрицю кДНК, що містить 27648 генів, заздалегідь 19 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 досліджували профілі експресії генів 6 тканин раку підшлункової залози та їхніх сусідніх здорових аналогів. Після аналізу вибрали 6 генів, оскільки відносний коефіцієнт експресії цих генів був більш ніж у 5 разів вищим у тканинах з раком підшлункової залози порівняно з їхніми здоровими аналогами (Фіг. 1А) (Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95). Експресію цих генів проаналізували, застосовуючи мікроматричний кДНК-аналіз у 29 типах здорових тканин, включаючи 4 ембріональні тканини (Фіг. 1В). Внаслідок цього зосередилися на RAB6KIFL/KIF20A як на новому ТАА раку підшлункової залози. Експресія гена RAB6KIFL у тканинах раку підшлункової залози була помітно підвищеною у всіх 6 пацієнтів, яких тестували (середній відносний коефіцієнт експресії становив 32000, діапазон від 15 до 72000). Крім того, ген RAB6KIFL слабо експресувався тільки в яєчку та тимусі (Фіг. 1В). Рівень експресії гена RAB6KIFL був також підвищеним при раку легенів та раку сечового міхура, що визначили на основі попереднього мікроматричного кДНК-аналізу (Фіг. 1С) (Nakamura T, et al. Oncogene 2004;23:2385-400, Kitahara O, et al. Cancer Res 2001; 61: 3544-9, Hasegawa S, et al. Cancer Res 2002; 62: 7012-7, Kikuchi T, et al. Oncogene 2003; 22: 2192-205, Obama K, et al. Hepatology 2005; 41: 1339-48). Експресія мРНК RAB6KIFL та білка в здорових органах, ракових клітинних лініях та тканинах раку підшлункової залози Експресію гена RAB6KIFL у здорових тканинах на рівні мРНК проаналізували, застосовуючи аналіз з використанням RT-PCR. Внаслідок аналізу RAB6KIFL з використанням напівкількісної RT-PCR у здорових клітинах виявили, що RAB6KIFL експресувався тільки у яєчку (Фіг. 2А). Експресію гена RAB6KIFL виявили майже в усіх клітинних лініях раку підшлункової залози та інших HLA-A2-позитивних ракових клітинних лініях, застосовуючи аналіз з використанням RTPCR (Фіг. 2В). Отже, експресію гена RAB6KIFL проаналізували, застосовуючи RT-PCR-аналіз щодо ракових тканин підшлункової залози та їхніх сусідніх здорових аналогів, які вирізали хірургічним способом. Експресію гена RAB6KIFL виявили у 5 з 8 ракових тканин підшлункової залози, проте незначну експресію виявили у їхніх здорових аналогах (Фіг. 2С). Крім того, його експресію виявили у метастатичних осередках шкіри та очеревини. Експресію білка RAB6KIFL у ракових та декількох здорових тканинах також проаналізували шляхом вестерн-блотингу (Фіг. 3А, В). Білок RAB6KIFL не вдалося виявити у 8 здорових тканинах, а яєчко продемонструвало дуже слабку смугу, яка мала рухомість, подібну тій, яку спостерігали в лізаті клітин PANC1 (Фіг. 3А). З іншого боку, білок RAB6KIFL виявили в ракових тканинах підшлункової залози двох пацієнтів, яких обстежували, проте не виявили у сусідніх здорових тканинах (Фіг. 3В). Для того, щоб підтвердити пов'язану з пухлиною надмірну експресію білка RAB6KIFL, багато залитих парафіном зразків тканин раку підшлункової залози потім досліджували за допомогою імуногістохімічних аналізів. Сильне забарвлення RAB6KIFL спостерігали здебільшого на цитоплазмі ракових клітин у раку підшлункової залози, проте дуже слабке забарвлення спостерігали в ацинарних клітинах та здоровому проточному епітелії їх здорових сусідніх тканин підшлункової залози (Фіг. 4А). Крім того, подібне сильне забарвлення спостерігали у метастатичних осередках очеревини (Фіг. 4А). Забарвлення не виявили у зразках тканин при панкреатиті, що утворює пухлину (Фіг. 4А). RAB6KIFL не забарвлювався у наступних здорових органах: мозку, легені, печінці, нирці, шлунку, тонкому кишечнику, товстій кишці, селезінки, скелетному м'язі, шкірі, тимусі та яєчку (Фіг. 4В). Передбачення HLA-A2 (A*0201)-зв'язувальних пептидів, що походять з RAB6KIFL Таблиці 1А та В демонструють HLA-A2 (A*0201)-зв'язувальні пептиди білка RAB6KIFL у порядку показників передбачення високого афінітету зв'язування. Загалом, вибрали 36 пептидів з сильною зв'язувальною активністю HLA-A2. Таблиця 1А. 9-мірні пептиди, які зв'язують HLA-A2 (A*0201) та походять від RAB6KIFL 50 20 UA 102274 C2 Таблиця 1В. 10-мерні пептиди, які зв'язують HLA-A2 (A*0201) та походять від RAB6KIFL 5 10 Ідентифікація RAB6KIFL-похідних та HLA-A2-обмежених епітопів мишачих CTL із застосуванням трансгенних мишей HLA-A2.1 (HHD) Для того, щоб ідентифікувати RAB6KIFL-похідні та HLA-A2-обмежені епітопи CTL, вибрали 36 різних пептидів-кандидатів. Кожен пептид складався з 9 або 10 амінокислот, які мали високі передбачені показники зв'язування з HLA-A2 (A*0201), найбільш звичайний повсюдний HLAалельний продукт, на основі алгоритму передбачення зв'язування пептиду з HLA, наданого NIH BIMAS (Таблиці 1А, В). Для того, щоб визначити, який пептид був спроможним індукувати 21 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пептид-реактивні CTL, клітини селезінки CD4 , виділені з HLA-A2.1 (HHD) Tgm, імунізованих інтраперитонеально двічі за допомогою ВМ-DC, мічених 12 наборами суміші з трьох типів пептидів, вибраних з цих 36 пептидів, знов стимулювали in vitro BM-DC, міченими кожним пептидом. Результати імуноферментного спот-аналізу (Фіг. 5А) показали, що клітини селезінки CD4 , стимульовані пептидом RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809 та RAB6KIFL-A2-10-284, виробляли велику кількість IFN-гама специфічним до пептиду чином. Ці клітини селезінки CD4 4 (2 × 10 ) продемонстрували 149,0 плюс/мінус 22,2 плям/комірку у відповідь на BM-DC, мічених пептидом RAB6KIFL-A2-9-12, тоді як вони продемонстрували 32,6 плюс/мінус 9,9 плям/комірку у присутності BM-DC без завантаження пептиду (P < 0,01). Подібно до цього, клітини селезінки CD4 , стимульовані BM-CD, міченими пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, продемонстрували 117,2 плюс/мінус 23,4 плям/комірку, тоді як вони продемонстрували 51,4 плюс/мінус 7,8 плям/комірку у присутності BM-DC без завантаження пептиду (P < 0,01). Крім того, клітини селезінки CD4 , стимульовані BM-DC, міченими пептидом RAB6KIFL-A2-10-284 також продемонстрували 141,2 плюс/мінус 5,5 плям/комірку, тоді як вони продемонстрували 19,2 плюс/мінус 5,2 плям/комірку у присутності BM-DC без завантаження пептиду (P < 0,01). Жодної суттєвої специфічної до пептиду реакції не спостерігали з іншими пептидами. Ці результати дозволяють припустити, що пептиди RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809 та RAB6KIFL-A2-10-284 могли бути HLA-A2обмеженими епітопними пептидами CTL у HLA-A2.1 (HHD) Tgm, та очікували, що ці пептиди будуть епітопними для CTL людини. Жодний аутоімунний феномен не індукувався внаслідок імунізації епітопним пептидом, RAB6KIFL-A2-9-809, у HLA-A2.1 (HHD) Tgm Дуже важливо дослідити, чи індукує, чи не індукує аутоімунну реакцію імунізація пептидом RAB6KIFL. Отже, ми виконали імуногістохімічний аналіз декількох життєво необхідних органів з анти-CD4 та анти-CD8 mAb в HLA-A2 (HHD) Tgm після вакцинації два рази пептидом RAB6KIFLA2-9-809, амінокислотні послідовності якого були повністю консервативними між RAB6KIFL людини та мишачим RAB6KIFL. Внаслідок цього не спостерігали жодних патологічних змін, таких як інфільтрація лімфоцитів або руйнування тканин, які передбачають аутоімунітет (Фіг. 5В). Аномалії, що часто спостерігаються у мишей, уражених аутоімунними хворобами, такими як аномалії волосся та шкіри, діарея та втрата маси, також не спостерігалися у цих мишей. Ці результати вказують на те, що лімфоцити, стимульовані пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, не атакують здорові тканини, принаймні, у HLA-A2 Tgm. Індукція RAB6KIFL-реактивних CTL від РВМС HLA-A2 (A*0201)-позитивних здорових донорів Зробили спробу отримати RAB6KIFL-специфічні CTL від РВМС здорових донорів, позитивних до HLA-A2 (A*0201), шляхом стимуляції пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) та RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5). РВМС виділили + від HLA-A2-позитивних здорових донорів та T-клітини CD8 , узяті з РВМС, інкубували з аутологічними, похідними від моноцитів дендритними клітинами (DC), міченими кожним пептидом. Після триразової стимуляції досліджували цитотоксичну активність проти імпульсно51 мічених пептидом Т2-клітин за допомогою аналізу вивільнення Cr (Фіг. 6А) та імуноферментного спот-аналізу IFN-гама (дані не показано). Індуковані CTL від РВМС двох здорових донорів демонстрували цитотоксичну активність до Т2-клітин, мічених пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (SEQ ID NO: 3), RAB6KIFL-A2-9-809 (SEQ ID NO: 4) або RAB6KIFL-A2-10-284 (SEQ ID NO: 5), проте не демонстрували цитотоксичну активність до Т2-клітин, мічених нерелевантним та HLA-A2-обмеженим пептидом ВІЛ, або без завантаження пептиду. Подібні реакції спостерігали у інших донорів (дані не наведено). Ці результати вказують на те, що ці CTL мали специфічну до пептиду цитотоксичність. Далі було досліджено, чи були ці CTL спроможними вбивати ракові клітинні лінії людини, які експресують RAB6KIFL та HLA-A2 (A*0201). Як показано на Фіг. 6В, RAB6KIFL-реактивні CTL, стимульовані пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (ліворуч), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередині) або + RAB6KIFL-A2-10-284 (праворуч), демонстрували цитотоксичність до PANC1 (RAB6KIFL , HLA+ + + + A2 ), CaCo-2 (RAB6KIFL , HLA-A2 ), проте не до PK8 (RAB6KIFL , HLA-A2 ) у здорових донорів. високий + низький Крім того, клітини SKHep1/RAB6KIFL (RAB6KIFL , HLA-A2 ), SKHep1 (RAB6KIFL , + HLA-A2 ), трансфектовані геном RAB6KIFL (Фіг. 2В), застосовували як клітини-мішені, щоб підтвердити, що ці пептиди зазнають природного перетворення від білка RAB6KIFL у ракових клітинах. Як показано на Фіг. 6С, CTL, індуковані внаслідок стимуляції пептидом RAB6KIFL-A2-912 (ліворуч), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередині) та RAB6KIFL-A2-10-284 (праворуч), демонстрували цитотоксичність проти SKHep1/RAB6KIFL, проте не проти SKHep1/Mock. Ці результати дозволяють припустити, що ці пептиди можуть зазнавати природного перетворення та експресуватися на поверхні ракових клітин у контексті молекул HLA-A2. Для того, щоб довести, що індуковані CTL розпізнавали клітини-мішені HLA класу І 22 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмеженим чином, виконували аналіз із блокуванням HLA класу І, застосовуючи mAb проти HLA класу І, (W6/32) застосовували для блокування розпізнавання ракових клітин CTL (Фіг. 6D). Внаслідок цього, антитіло проти HLA класу І могло помітно інгібувати виробництво IFN-гама, стимульоване клітинами PANC1 під час імуноферментного спот-аналізу CTL, генерованих внаслідок стимуляції пептидом RAB6KIFL-A2-9-12 (ліворуч), RAB6KIFL-A2-9-809 (посередині) або RAB6KIFL-A2-10-284 (праворуч), зі статистичною значущістю (Фіг. 6D, P < 0,01). Ці результати очевидно вказують на те, що ці індуковані CTL розпізнавали клітини-мішені, що експресують RAB6KIFL HLA класу І-обмеженим способом. Обговорення Згідно з прикладом, було показано, що RAB6KIFL – це ТАА як перспективна мішень протиракової імунотерапії для лікування раку підшлункової залози. Для того, щоб здійснити протиракову імунотерапію, важливо ідентифікувати ТАА, що сильно експресуються у пухлинних клітинах, проте не в здорових клітинах. Мікроматричний кДНК-аналіз продемонстрував, що мРНК RAB6KIFL надмірно експресувалася у ракових клітинах підшлункової залози (Imai K, Hirata S, Irie A, Senju S, Ikuta Y, Yokomine K, Harao M, Inoue M, Tsunoda T, Nakatsuru S, Nakagawa H, Nakamura Y, et al. Clin Cancer Res 2008; 14: 6487-95) та ледве експресувалася у своїх здорових аналогах та багатьох тканинах здорових дорослих, за виключенням яєчка та тимусу (Фіг. 1В). Крім того, ген RAB6KIFL також надмірно експресувався у раці легенів та сечового міхура, а також у раці підшлункової залози (Фіг. 1С). RT-PCR-аналіз продемонстрував, що мРНК RAB6KIFL часто експресувалася у декількох ракових клітинних лініях та ракових тканинах підшлункової залози, проте не експресувалася у здорових тканинах дорослих, включаючи кістковий мозок, за виключенням яєчка (Фіг. 2). Подібно до цього внаслідок вестернблот аналізу та імуногістохімічних аналізів визначили, що білок RAB6KIFL виявили у ракових клітинах підшлункової залози, проте він не виявлявся в їхніх здорових аналогах та здорових тканинах дорослих, включаючи тимус, за виключенням яєчка (Фіг. 3, 4). Ці спостереження підтверджують характеристику RAB6KIFL як подібного до раку яєчка ТАА на рівні білка. Для ідентифікації ТАА як корисних мішеней для протиракової імунотерапії іще одним важливим пунктом є вибір антигенів, які є необхідними для проліферації, інвазії, метастазу та виживаності ракових клітин. Нещодавно Taniuchi et al. повідомили про те, що RAB6KIFL залучається в канцерогенез підшлункової залози (Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65:105-12), окрім його попередньо описаної ролі у мембранному трафіку (Echard A, et al. Science 1998;279:580-5) та цитокінезі (Fontijn RD, et al. Mol Cell Biol 2001;21:2944-55, Hill E, Clarke M, Barr FA. EMBO J 2000; 19:5711-9). Вони продемонстрували, що внаслідок знижувальної регуляції ендогенного RAB6KIFL в ракових клітинах підшлункової залози невеликою перешкоджаючою РНК відбулося рішуче ослаблення росту ракових клітин через взаємодію дискового великого гомологічного 5 (DLG5) вантажного білка RAB6KIFL (Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65:10512), що дозволяє припустити, що, як здається, RAB6KIFL відіграє критичну роль у канцерогенезі підшлункової залози та буде завдяки цьому потенційно корисною мішенню для протиракової імунотерапії. Потенціал RAB6KIFL як імунотерапевтичної мішені був підтверджений у цьому описі шляхом ідентифікації HLA-A2-обмежених епітопних пептидів та визначення їхньої імуногенності. Експеримент із застосуванням HLA-A2 (HHD) Tgm визначив три HLA-A2-обмежені епітопні пептиди RAB6KIFL, які можуть стимулювати вироблення HLA-A2-обмежених мишачих CTL внаслідок вакцинації 36 пептидами-кандидатами, щодо яких передбачається, що вони мають афінітет зв'язування з HLA-A2 (A*0201), за допомогою алгоритму BIMAS, при цьому не відбувається аутоімунний феномен, такий як інфільтрація лімфоцитів або руйнування тканин (Фіг. 5). Крім того, RAB6KIFL-реактивні CTL можуть генеруватися від РВМС, стимульованих усіма цими трьома пептидами у трьох незалежних здорових донорах (Фіг. 6). Ці CTL могли б вбивати не тільки Т2-клітини, мічені їхніми спорідненими пептидами, проте також ракові клітинні лінії, що експресують як RAB6KIFL, так і HLA-A2. Антигенну специфічність CTL стосовно цих пептидів підтвердили завдяки одержаним даним того, що ці CTL демонстрували цитотоксичність до клітин SKHep1, трансфектованих геном RAB6KIFL людини, проте не до псевдотрансфектованих SKHep1. Ці дані дозволяють припустити, що ці пептиди RAB6KIFL (RAB6KIFL-A2-9-12, RAB6KIFL-A2-9-809 та RAB6KIFL-A2-10-284) зазнають природного перетворення від білка RAB6KIFL у ракових клітинах, та вони є представленими на клітинній поверхні разом з молекулами HLA-A2, які мусять розпізнаватися CTL. Крім того, можливо, що пептид RAB6KIFL-A2-9-809 був би спроможним зазнавати більш ефективного перетворення від білка RAB6KIFL порівняно з пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 та RAB6KIFL-A2-10-284 у ракових клітинах, оскільки індуковані пептидом RAB6KIFL-A2-9-809 CTL демонстрували більш сильну цитотоксичність, спрямовану проти ракових клітин, що експресують як RAB6KIFL, так і HLA-A2 23 UA 102274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 порівняно з цитотоксичністю, опосередкованою CTL, індукованими внаслідок стимуляції пептидами RAB6KIFL-A2-9-12 або RAB6KIFL-A2-10-284. HLA-A2.1 (HHD) Tgm, яким не вистачало експресії ендогенних мишачих молекул класу І, b кодованих H-2 , застосовували для ідентифікації HLA-A2-обмежених епітопних пептидів RAB6KIFL щодо CTL. Повідомлялося, що HLA-A2.1 (HHD) Tgm є багатофункціональною тваринною моделлю для доклінічного оцінювання імунотерапії на основі пептидів (Imai K, et al. Clin Cancer Res 2008; 14:6487-95, Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12:2689-97, Harao M, et al. Int J Cancer 2008; 123: 2616-25, Pascolo S, et al. J Exp Med 1997; 185: 2043-51, Firat H, et al. Eur J Immunol 1999; 29: 3112-21). Щоб уникнути побічних ефектів, які є наслідком вакцинації ТАА, як мішені обрали RAB6KIFL, який ледве експресувався у здорових тканинах дорослих. Проте, було дуже важливим визначити, чи може вакцинація RAB6KIFL індукувати аутоімунну хворобу під час протиракової імунотерапії або після неї. У цьому описі амінокислотні послідовності двох з трьох епітопних пептидів не є консервативними між людиною та мишею (RAB6KIFL-A2-9-12, людина: LLSDDDVVV (SEQ ID NO: 3), миша: LLSDEDVVD (SEQ ID NO: 11); RAB6KIFL-A2-10-284, людина: AQPDTAPLPV (SEQ ID NO: 5), миша: AQPDTVPVSV) (SEQ ID NO: 12). Отже, аутоімунний феномен у HLA-A2 Tgm досліджували після дворазової вакцинації пептидом RAB6KIFL-A2-9-809, у якому амінокислотні послідовності були повністю консервативними між людиною та мишею. Одна з переваг застосування HLA-A2 Tgm полягає у тому, що ймовірність аутоімунного феномену можна дослідити in vivo. Звичайно, оскільки кількість здорових тканин, які досліджуються у цьому описі, є обмеженою, то не можна виключати можливу експресію RAB6KIFL у деяких здорових тканинах, які не були досліджені тут. Отже, слід бути обережними щодо виникнення аутоімунних хвороб, коли пептиди RAB6KIFL застосовуються для протиракової імунотерапії. На завершення, ці результати дозволяють припустити, що RAB6KIFL – це епітопний пептид, який містить ТАА та який індукує CTL, що є реактивними до ракових клітин, які експресують як RAB6KIFL, так і HLA-A2. Оскільки RAB6KIFL надзвичайно експресується у широкому діапазоні злоякісних новоутворень людини, то RAB6KIFL є перспективною мішенню для імунотерапії на основі пептидів для лікування широкого спектру злоякісних хвороб, особливо раку підшлункової залози. Подальше дослідження спроможності індукувати RAB6KIFL-специфічні CTL у пацієнтів з раком підшлункової залози, отже, залишається завданням великої важливості для клінічного застосування. Промислова придатність Цей винахід описує нові ТАА, особливо ті ТАА, що походять від RAB6KIFL, які індукують сильні та специфічні протипухлинні імунні реакції та які можна застосовувати щодо широкого ряду типів раку. Такі ТАА гарантують подальшу розробку пептидних вакцин проти хвороб, пов'язаних з RAB6KIFL, наприклад, раку ряду типів, таких як рак сечового міхура, рак шийки матки, холангіокарцинома, рак стравоходу, рак шлунку, недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), остеосаркома, рак підшлункової залози, рак нирки та рак м'якої тканини. Незважаючи на те, що цей винахід описано у цьому описі докладно та з посиланням на його специфічні варіанти здійснення, слід розуміти, що попередній опис є за своєю природою лише прикладом та поясненням, та він призначений для того, щоб проілюструвати винахід та його переважні варіанти здійснення. Внаслідок рутинних експериментів фахівець у галузі легко зрозуміє різні зміни та модифікації, які можна зробити у винаході, не відхиляючись від духу та обсягу винаходу, границі та зв'язки якого визначено пунктами формули винаходу, що додається. 24 UA 102274 C2 25 UA 102274 C2 26 UA 102274 C2 27 UA 102274 C2 28