Виділена молекула днк, що кодує біологічно функціональні стимульовану солями жовчних кислот ліпазу / карбоксил-складноефірну ліпазу (ссжл/ксл), реплікований експресуючий вектор, спосіб одержання ссжл/ксл людини

1. Выделенная молекула ДНК, кодирующая биологически функциональные стимулируемую солями желчных кислот липазу/карбоксилсложноэфирную липазу (ССЖЛ/КСЛ) , причем указанная молекула ДНК включает (а) нуклеотидную последовательность (19) (21) 94129155 (22) 09.06.1993 (24) 17.09.2001 (31) 9201809-2, 9201826-6, 9202088-2, 9300902-5 (32) 11.06.1992, 12.06.1992, 03.07.1992, 19.03.1993 (33) SE, SE, SE, SE (86) PCT/SE93/00515, 09.06.1993 (46) 17.09.2001, Бюл. № 8, 2001 р. (72) Бьюрселль Карл Гуннар, SE, Карлссон Петер Нільс Івар, SE, Енербекк Курт Свен Магнус, SE, Ханссон Стіг Леннарт, SE, Лідберг Ульф Фредрік 41322 2 41322 3 41322 4 41322 5 41322 6 41322 7 41322 8 41322 обозначенную как SEQ ID NO: 1, или (б) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с комплементом последовательности ДНК из (а), или (в) нуклеотидную последовательность, которая является генетически вырожденной нуклеотидной последовательностью из (а). 2. Молекула ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что представляет собой последовательность, обозначенную как SEQ ID NO: 1. 3. Реплицируемый экспрессирующий вектор, несущий и способный опосредовать экспрессию молекулы ДНК, охарактеризованной в любом из пп. 1, 2, где вектор представляет собой pS452 (DSM 7499). 4. Вектор по п. 3, отличающийся тем, что включает молекулу ДНК, охарактеризованную в любом из пп. 1, 2, способную кодировать биологически функциональные ССЖЛ/КСЛ, и регуляторные элементы гена молочного белка, способные управлять экспрессией в молочной железе отличного от человека млекопитающего. 5. Способ получения ССЖЛ/КСЛ человека, отличающийся тем, что включает а) вставку молекулы ДНК, охарактеризованной в пп. 1-2, в вектор, способный реплицироваться в конкретной клетке-хозяине; б) введение полученного рекомбинантного вектора в клетку-хозяина; в) культивирование полученной клетки в или на культуральной среде с целью экспрессии полипептида; и г) выделение полипептида. 6. Способ получения трансгенного отличного от человека млекопитающего, способного экспрессировать ССЖЛ/КСЛ человека, отличающийся тем, что включает а) введение вектора, охарактеризованного в п. 4, в оплодотворенную яйцеклетку или клетку эмбриона отличного от человека млекопитающего с тем, чтобы ввести указанный вектор в зародышевую линию млекопитающего, и б) развитие полученной введенной оплодотворенной яйцеклетки или клетки эмбриона во взрослую самку отличного от человека млекопитающего. 7. Способ получения трансгенного отличного от человека млекопитающего, способного экспрессировать ССЖЛ/КСЛ человека и, по существу, неспособного экспрессировать ССЖЛ/КСЛ самого млекопитающего, отличающийся тем, что включает а) устранение способности млекопитающего экспрессировать ССЖЛ/КСЛ с тем, чтобы, по существу, не происходила экспрессия ССЖЛ/КСЛ млекопитающего, и введение вектора, охаракте ризованного в п. 4, в зародышевую линию млекопитающего таким образом, чтобы в организме млекопитающего происходила экспрессия ССЖЛ/КСЛ человека; и/или б) замену гена ССЖЛ/КСЛ млекопитающего или его части вектором, охарактеризованным в п. 4. 8. Способ получения детского питания путем введения в состав детского питания полипептида, кодируемого молекулой ДНК, охарактеризованной в одном из пп. 1 и 2. 9. Молекула ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима для получения ССЖЛ/КСЛ человека. 10. Молекула ДНК по п. 9, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима для получения трансгенного отличного от человека млекопитающего, экспрессирующего ССЖЛ/КСЛ человека. 11. Молекула ДНК по п. 9, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима для получения молока, содержащего ССЖЛ/КСЛ человека, полученного от трансгенного отличного от человека млекопитающего. 12. Молекула ДНК по п. 9, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима для получения детского питания, содержащего молоко, содержащее ССЖЛ/КСЛ человека, полученное от трансгенного отличного от человека млекопитающего. 13. Молекула ДНК по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима в производстве лекарственного препарата для лечения патологического состояния, связанного с экзокринной недостаточностью поджелудочной железы. 14. Молекула ДНК по п. 13, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима в производстве лекарственного препарата для лечения муковисцидоза. 15. Молекула ДНК по п. 13, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима в производстве лекарственного препарата для лечения хронического панкреатита. 16. Молекула ДНК по п. 13, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима в производстве лекарственного препарата для лечения нарушения всасывания жиров. 17. Молекула ДНК по п. 13, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима в производстве лекарственного препарата для лечения нарушения всасывания жирорастворимых витаминов. 18. Молекула ДНК по п. 13, отличающаяся тем, что указанная молекула ДНК применима в производстве лекарственного препарата для лечения нарушения всасывания жиров, развивающегося в силу физиологических факторов. Настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей интронные последовательности и кодирующей человечий белок, который в зависимости от места действия называется стимулируемой солями желчных кислот липазой (ССЖЛ) или карбоксил-сложноэфирной липазой (КСЛ). ДНК молекула с успехом применима в получении рекомбинантных ССЖЛ/КСЛ человека, предпочти тельно посредством продукции в трансгенных млекопитающих (но не человеке). Рекомбинанные ССЖЛ/КСЛ человекa могут быть использованы в качестве компонента детского питания в виде заменителя материнского молока, предназначенного для кормления младенцев, или для изготовления лекарственных средств против, например: малаб 9 41322 сорбции жиров, муковисцидоза и хронического панкреатита. Гидролиз пищевых липидов Пищевые липиды являются важным источником энергии. Богатые энергией триацилглицерины составляют более 95% таких липидов. Некоторые липиды, например: определенные жирные кислоты и растворимые в жирах витамины являются существенными компонентами пищи. Перед абсорбцией желудочно-кишечным трактом триацилглицерины, а также присутствующие в меньших количествах компоненты, например этерифицированные растворимые в жирах витамины и холестерин, и диацилфосфатидилглицерины должны подвергнуться гидролизу по сложноэфирной связи с образованием менее гидрофобных абсорбируемых продуктов. Реакция гидролиза катализируется особой группой ферментов, называемых липазами. В организме взрослого человека к важнейшим липазам относятся желудочная липаза, панкреатическая колипаза - зависимая липаза (гидролиз три- и диацилглицеринов), панкреатическая фосфолипаза А2 (гидролиз диацилфосфатидилглицеринов) и карбоксил-сложноэфирная липаза (КСЛ) (гидролиз сложных эфиров холестерина и растворимых в жирах витаминов). У вскармливаемых грудью новорожденных стимулируемая солями желчных кислот липаза (ССЖЛ) играет существенную роль в гидролизе некоторых из вышеупомянутых липидов. Совместно с солями желчных кислот продукты гидролиза липидов образуют смешанные мицеллы, из которых и происходит абсорбция. Стимулируемая солями желчных кислот липаза В лактирующей молочной железе человека происходит синтез и секреция с молоком стимулируемой солями желчных кислот липазы (ССЖЛ) (Bläckberg и др., 1987), которая после особой активации первичными солями желчных кислот придает вскармливаемому грудью младенцу эндогенную способность усваивать в кишечнике жиры. Указанный фермент, составляющий примерно 1% всего молочного белка (Bläckberg & Hernell, 1981), не разрушается при прохождении с молоком через желудок, а от содержащихся в двенадцатиперстной кишке панкреатических протеаз, например: трипсина и химотрипсина липаза защищена от дезактивации солями желчных кислот. И тем не менее липаза дезактивируется при пастеризации молока, например, при нагревании при 62,5°С, 30 мин (Björksten и др., 1980). Опыты на моделях in vitro предполагают, что конечные продукты гидролиза триацилглицерина отличаются в присутствии ССЖЛ (Bernbäck и др., 1990; Hernell & Bläckberg, 1982). Вследствие низкой внутрипросветной концентрации солей желчных кислот в течение неонатального периода, это может иметь важное значение для абсорбции продукта. Карбоксил-сложноэфирная липаза Карбоксил-сложноэфирная липаза (КСЛ) человеческого панкреатического сока (Lombardo и др.) функционально, видимо, идентична или по меньшей мере очень схожа, с ССЖЛ (Bläckberg и др., 1981). Кроме того, обе липазы характеризуют ся общими элитопами, имеют идентичные N-концевые последовательности аминокислот (Abouaki и др., 1988) и ингибируются ингибиторами cеринэстераз, например эсерином и диизопропилфторфосфатом. В недавних исследованиях, проведенных в нескольких лабораториях, выявлено строение кДНК как молочной липазы, так и панкреатической липазы (Baba и др. 1991; Hui и др.. 1991; Nilsson и др., 1990; Reue и др., 1991), и исследователи пришли к выводу, что и молочный фермент, и панкреатический фермент являются продуктами одного и того же гена (в данном описании называется CEL-геном, ЕС 3.1.1.1). Последовательность кДНК и определенная на ее основе аминокислотная последовательность описаны в WO 91/15234 (Оклахома Медикал Рисерч Фаундейшн) и в WO 91/18923 (Актиэболагет Астра). Таким образом, предполагается, что КСЛ идентичен ССЖЛ, и полипептид, кодируемый CELгеном, в контексте настоящего описания называется ССЖЛ/КСЛ. Малабсорбция лилидов Общие причины малабсорбции липидов, а следовательно нарушенного питания заключается в пониженном внутрипросветного содержания панкреатической колипаза-зависимой липазы и/или солей желчных кислот. Типичные примеры случаев такого дефицита липазы включают больных, страдающих муковисцидозом - обычным генетическим нарушением, сопровождающих 80% больных с таким дефицитом на протяжении всей их жизни, и хроническим панкреатитом, часто связанным с хроническим алкоголизмом. Лечение больных, страдающих дефицитом панкреатической липазы, в настоящее время заключается во введении очень больших доз сырого препарата панкреатических ферментов свиньи. Однако, колипаза-зависимая панкреатическая липаза дезактивируется при низких значениях рН, преобладающих в желудке. Этот феномен не может быть полностью преодолен применением больших доз фермента. Таким образом, вводимые в больших дозах препараты не приносят облегчение большинству больных, а сами препараты загрязнены и неприятны на вкус. Приготовлены таблетки, способные пройти через кислотные области желудка с выделением фермента только в сравнительно щелочном окружении тощей кишки. Однако, многие больные, страдающие панкреатическими нарушениями, отличаются необычайно высоким содержанием кислоты в тощей кишке, и в этих случаях фермент из таблеток может и не выделиться. Более того, поскольку выпускаемые в настоящее время промышленностью препараты животного происхождения, имеется риск иммунных реакций, могущих нанести вред больным или уменьшить эффективность лечения. Еще один недостаток существующих препаратов заключается в том, что для них не установлено проявлений других форм липолитической активности, отличной от активности колипаза-зависимой липазы. В самом деле, большинство таких препаратов в очень незначительной степени проявляют ССЖЛ/КСЛ активность. В этом может быть одна из причин того, что страдающие муковисцидозом больные, несмотря на поддерживающую терапию, 10 41322 испытывают недостаток в растворимых в жирах витаминах и в необходимых жирных кислотах. Таким образом, существует большая необходимость в продуктах со свойствами и строением, аналогичными свойствам и строению человечьих липаз, и широкой специфичностью субстрата, при этом такие продукты могут быть введены перорально больным, страдающим дефицитом одного или нескольких панкреатических липолитических ферментов. Продукты, которые могут быть приготовлены использованием настоящего изобретения, отвечают такой необходимости, как сами по себе, так и в комбинации с препаратами, содержащими другие липазы. Детское питание Хорошо известно, что вскармливание младенца материнским молоком считается более полезным, чем искусственное кормление. И не только потому, что молоко человека является хорошо сбалансированным источником питательных веществ, но еще и потому, что молоко матери легко усваивается младенцем. Так, некоторые биологически активные вещества, которые, как известно, выполняют физиологические функции в организме младенца, являются либо компонентами человечьего молока, либо образуются в ходе его усвоения, включая компоненты, участвующие в защите от инфекции, и компоненты, облегчающие усвоение питательных веществ человечьего молока. Несмотря на серьезные попытки в направлении получения детского питания, так и не удалось создать состав, хоть в какой-то заметной степени отвечающего преимуществам материнского молока. Так, детское питание, часто приготовляемое на основе коровьего молока, как правило, не полностью усваивается младенцем, и в нем отсутствуют вещества, которые, как известно, оказывают влияние на физиологические функции организма младенца. С целью получения детского питания, аналогичного по своей питательной ценности материнскому, в состав питания предлагались разнообразные добавки, в том числе: белковые фрагменты, витамины, минеральные вещества и т.д. с последующим риском повышенной нагрузки на важнейшие органы, например печень и почки с их возможным длительным разрушением. Другой недостаток, связанный с применением составов на основе коровьего молока, заключается в повышенном риске возникновения у младенца аллергии к коровьим белкам. В качестве альтернативы детскому питанию на основе коровьего молока используется человечье молоко, которое можно получить в так называемых молочных банках. Однако, кормление новорожденных младенцев молоком из молочных банков в последние годы в значительной степени стараются избежать из боязни присутствия в молоке инфекционных агентов, например: ВИЧ или ВОМ (вирус огуречной мозаики). Для разрушения инфекционных агентов в человечьем молоке молоко перед употреблением необходимо пастеризовать. Однако, при пастеризации питательная ценность и биологическое действие компонентов молока уменьшается, например, как указано выше, происходит дезактивация ССЖЛ. Введение в детское питание липаз Функционирование поджелудочной железы и печени при рождении проявляется не в полной мере, что особенно заметно в случае недоношенного ребенка. По физиологическим причинам малабсорбция жиров является наиболее общим нарушением, которое, как полагают, возникает в результате низкой внутрипросветной концентрации панкреатической колипаза-зависимой липазы и солей желчных кислот. Однако, вследствие присутствия ССЖЛ такая малабсорбция отмечается гораздо реже в случаях вскармливания грудью младенцев по сравнению с младенцами, вскармливаемыми пастеризованным человечьим молоком или детским питанием (Bernbäck и др., 1990). Чтобы обойти вышеуказанные недостатки, связанные с применением пастеризованного молока и детского питания на основе коровьего молока, желательно, таким образом, создать такое детское питание, состав которого был бы особенно близок составу материнского молока, то есть состав, содержащий белки материнского молока. ССЖЛ/КСЛ обладают несколькими уникальными свойствами, делающими их идеально применимыми в качестве добавки к детскому питанию: Самой природой эти липазы предназначены для перорального введения. Так липазы устойчивы к прохождению через желудок, и активируются под действием содержимого тонкой кишки. Вследствие своей широкой специфичности к субстрату липазы со своей стороны обладают потенциалом, способствующим полному усвоению большинства пищевых липидов, в том числе и растворимых в жирах сложных эфиров витаминов. ССЖЛ/КСЛ могут превосходить панкреатическую колипаза-зависимую липазу по способности гидролизовать сложноэфирные связи в эфирах, содержащих длиноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты. В присутствии желудочной липазы и в отсутствие или при низком содержании колипазазависимой липазы ССЖЛ/КСД способны обеспечить полный гидролиз триацилглицерина in vitro даже при низкой концентрации солей желчных кислот, как, например, в случае новорожденных младенцев. В присутствии ССЖЛ/КСЛ конечными продуктами гидролиза триацилглицерина являются свободные жирные кислоты и свободный глицерин, а не моноацилглицерин, образующийся в присутствии двух других липаз (Bernbäck и др., 1990). Это может благоприятствовать абсорбции продукта, особенно при низком внутрипросветном содержании солей желчных кислот. Для применения ССЖЛ/КСЛ в качестве добавки к детскому питанию необходимо, однако, иметь доступ к большим количествам этого продукта. Хотя белки человечьего молока могут быть выделены непосредственно из молока, такой подход не является реалистичным и достаточно экономичным для получения больших количеств продуктов, необходимых для широкомасштабного производства детского питания. В связи с этим необходимо создать другие методы для того, чтобы иметь возможность получать детское питание, содержащее белки человечьего молока. Настоящим изо 11 41322 бретением даются такие способы получения в больших количествах ССЖЛ/КСЛ. Продуцирование белков с молоком трансгенных животных Выделение генов, кодирующих фармакологически активные белки, позволяет получать такие белки более дешевым путем в гетерологичных системах. Приемлемая экспрессионная система для молочных белков может быть представлена трансгенным животным (обзор см. Hennighausen и др., 1990). Пищевые составы, содержащие активированные солями желчных кислот липазы, полученные, например, технологией с использованием трансгенных животных, описаны в ЕР 317,355 (Оклахома Медикал Рисерч Фаундейшн). В случае трансгенного животного кодирующая белок последовательность может быть введена в виде кДНК или в виде геномной последовательности. Поскольку для регулируемой экспрессии гена могут потребоваться интроны (Brinster и др., 1988; Whitelaw и др., 1991), во многих случаях рекомендуется применять геномную форму, а не кДНК форму структурного гена. В патенте WO 90/05188 (ФармасьютикалПротеинс Лимитид) описано применение в трансгенном животном кодирующей белок ДНК, включающей хотя бы один, но не все интроны, встречающиеся в природном кодирующем белок гене. Целью настоящего изобретения является создание средств для получения с высоким выходом и по приемлемой цене человеческих рекомбинантных ССЖЛ/КСЛ, предназначенных для применения в детском питании с тем, чтобы избежать недостатков, характерных для пастеризованного молока и составов на основе коровьих белков. Цель изобретения достигнута клонированием и секвенированием человеческого гена CEL. Для повышения выхода ССЖЛ/КСЛ при продуцировании человеческих ССЖЛ/КСЛ в трансгенном млекопитающем (но не человеке) вместо известной последовательности кДНК применена полученная молекула ДНК, содержащая интронные последовательности. Соответственно, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, приведенной в списке последовательностей как SEQ ID NO: 1, или аналог указанной молекулы ДНК, который гибридизуется с комплементом молекулы ДНК, приведенной в списке последовательностей как SEQ ID NO: 1, или ее конкретной частью, в жестких условиях гибридизации. Методика, применяемая для выделения молекулы ДНК человеческих ССЖЛ/КСЛ, приведена в нижеследующих примерах. Жесткие условия гибридизации, упомянутые выше, следует понимать в их обычном значении, то есть как гибридизацию, проводимую согласно стандартному лабораторному руководству, например, Sambrook и др. (1989). Другим аспектом настоящего изобретения является экспрессирующая система млекопитающего, включающая последовательность ДНК, кодирующую человеческие ССЖЛ/КСЛ, встроенную в ген, кодирующий молочный белок отличного от человека млекопитающего, с образованием, в результате, гибридного гена, способного экспресси роваться в молочной железе взрослой самки млекопитающего, принявшей гибридный ген, с последующим продуцированном человечьих ССЖЛ/КСЛ при экспрессировании гибридного гена. И в еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу создания трансгенного отличного от человека млекопитающего, способного экспрессировать ССЖЛ/КСЛ человекa. Способ состоит с инъецировании вышеохрактеризованной экспрессионной системы млекопитающего в оплодотворенное яйцо или клетку эмбриона млекопитающего с введением в результате экспрессирующей системы в зародышевую линию млекопитающего с последующим развитием инъецированного оплодотворенного яйца или эмбриона во взрослую самку млекопитающего. Молекула ДНК, показанная в перечне последовательностей, как ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ № 1, общей длины в 11531 п. о. имеет следующие признаки: Признак Фланкирующая 5'-область Рамка Хогнесса Экзон 1 Начало трансляции Экзон 2 Экзон 3 Экзон 4 Экзон 5 Экзон 6 Экзон 7 Экзон 8 Экзон 9 Экзон 10 Экзон 11 Фланкирующая 3'-область От основания 1 1611 1641 1653 4071 4307 4707 6193 6501 6751 8335 8719 10124 10650 11491 До основания 1640 1617 1727 1653 4221 4429 4904 6323 6608 6868 8521 8922 10321 11490 11531 В контексте настоящего изобретения термин "ген" применяется для обозначения ДНК последовательности, участвующей в продуцировании полипептидной цепи и включающей области до и после области кодирования (5'-восходящая и 3'нисходящая последовательности), а также промежуточные последовательности (так называемые интроны), расположенные между отдельным кодирующими сегментами (так называемые экзоны) или в 5'-восходящей или 3'-нисходящей области. Восходящая 5'-область включает регуляторную последовательность, контролирующую экспрессию гена, как правило, промотор. Нисходящая 3'-область включает последовательности, участвующие в прекращении транскрипции гена, и возможно последовательности, ответственные за полиаденилирование транскрипта и нетранслируемой 3'-области. Молекулы ДНК изобретения, о которых идет здесь речь, могут представлять собой естественные или синтетические ДНК последовательности, причем источником естественной последовательности обычно является непосредственно геномная ДНК, как правило, млекопитающего, например, описанная ниже. Синтетическая последовательность может быть получена обычными способами синтеза молекулы ДНК. Кроме того, ДНК по 12 41322 следовательность может быть смешанного геномного и синтетического происхождения. В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к реплицируемому вектору экспрессии, кoтoрый осуществляет и который способен поддерживать экспрессию ДНК последовательности, кодирующей человечьи ССЖЛ/КСЛ. В контексте настоящего изобретения термин "реплицируемый" означает, что вектор способен реплицироваться в клетке-хозяине данного типа, в которую был введен. Непосредственно в восходящем направлении от ДНК последовательности человечьих ССЖЛ/КСЛ может быть предусмотрена последовательность, кодирующая сигнальный пептид, присутствие которого гарантирует секрецию человечьих ССЖЛ/КСЛ, экспрессируемых клетками-хозяевами, принявших вектор. Сигнальная последовательность может быть последовательностью, связанной в природе с ДНК последовательностью человечьих ССЖЛ/КСЛ, или иметь иной источник происхождения. Вектор может быть представлен любым вектором, который может быть использован в методах биотехнологии, и выбор вектора часто зависит от клетки-хозяина, в которую вектор будет вводиться. Так вектор может быть представлен автономно реплицирующимся вектором, то есть вектором, существующим в виде внехромосомной частицы, репликация которой не зависит от хромосомной репликации. Примеры подобных векторов включают: плазмиды, фаги, космиды, минихромосомы или вирусы. Или же вектор может быть таким, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой -(ами), с которой был интегрирован. Примеры приемлемых векторов включают бактериальные вектора экспрессии и дрожжевые вектора экспрессии. Вектор изобретения может нести любую молекулу ДНК изобретения, охарактеризованную выше. Настоящее изобретение, кроме того, относится к клетке, принявшей вышеохарактеризованный реплицируемый вектор экспрессии. В принципе, такая клетка может быть клеткой любого типа, то есть прокариотной клеткой, одноклеточным эукариотным микроорганизмом или клеткой, происходящей из многоклеточного организма, например млекопитающего. Клетки млекопитающего особенно пригодны для целей изобретения, и более подробно обсуждаются ниже. В другом своем важном аспекте изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантных ССЖЛ/КСЛ человека, в которой ДНК последовательность, кодирующую ССЖЛ/КСЛ человека, вводят в вектор, способный реплицироваться в специфичной клетке-хозяине, причем полученный рекомбинантный вектор вводят в клеткухозяина, выращиваемую в соответствующей культурной среде в приемлемых для экспрессии ССЖЛ/КСЛ человека условиях с последующим выделением ССЖЛ/КСЛ человека. Применяемой для выращивания клеток средой может служить любая пригодная для таких целей среда. Приемлемый вектор может быть представлен любым вышеописанным вектором и клетка-хозяин может относиться к любому из вышеперечисленных клеточных типов. Для конст руирования вектора и осуществления его введения в клетку-хозяина могут быть использованы любые известные способы, применяемые для этих целей в биотехнологии. Экспрессируемые клетками рекомбинантные ССЖЛ/КСЛ человека могут секретироваться, например, переноситься через клеточную мембрану по механизму, зависящему от типа клетки и состава вектора. Если ССЖЛ/КСЛ человека продуцируется рекомбинантным хозяином внутриклеточно, то есть не секретируются клеткой, в этом, случае их выделяют стандартными методами, включающими разрушение клетки механическими средствами, например: обработкой ультразвуком или гомогенизацией или ферментативными или химическими средствами с последующей очисткой. Для возможности секретирования ДНК последовательности, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека, ей должна предшествовать последовательность, кодирующая сигнальный пептид, присутствие которой гарантирует секретирование из клетки ССЖЛ/КСЛ человека таким образом, что по меньшей мере значительная часть экспрессируемых ССЖЛ/КСЛ человека секретируется в культурную среду с последующим их выделением из среды. Рекомендуемый способ продуцирования рекомбинатных ССЖЛ/КСЛ человека настоящего изобретения состоит в использовании трансгенных, отличных от человека млекопитающих, способных выделять ССЖЛ/КСЛ человека в свое молоко. Использование трансгенных, отличных от человека млекопитающих имеет то преимущество, что рекомбинантные ССЖЛ/КСЛ человека могут быть получены с высокими выходами и при разумных затратах, особенно, если отличным от человека млекопитающим является корова. В этом случае рекомбинантные ССЖЛ/КСЛ человека продуцируются с молоком, являющимся обычным компонентом, например, детского питания, в результате чего нет необходимости в интенсивной очистке при использовании рекомбинантных ССЖЛ/КСЛ человека в качестве питательной добавки к продуктам на основе молока. Более того, продуцирование в высшем организме, например, отличном от человека млекопитающем, обычно ведет к точному процессингу белка млекопитающего, например, с точки зрения пострансляционного процессинга, обсуждаемого выше, и надлежащей укладки белка. Кроме того, по существу чистые ССЖЛ/КСЛ человека могут быть получены в больших количествах. Соответственно, еще одним своим важным аспектом настоящее изобретение относится к экспрессирующей системе млекопитающего, включающей кодирующую ССЖЛ/КСЛ человека ДНК последовательность, встроенную в ген, кодирующий молочный белок отличного от человека млекопитающего, с образованием в результате гибридного гена, экопрессируемого в молочной железе взрослой самки млекопитающего, принявшей гибридный ген. В качестве ДНК последовательности, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека, рекомендуется ДНК последовательность, показанная в перечне последовательностей, как ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ № 1, или геномный CEL-ген человека, или его аналог. 13 41322 Молочная железа в качестве экспрессирующей ткани и гены, кодирующие молочные белки, как правило, считаются наиболее пригодными для применения с целью продуцирования гетерологичных белков в трансгенных, отличных от человека млекопитающих, поскольку молочные белки в естественных условиях продуцируются молочной железой на высоком уровне. Кроме того, молоко легко собирается и доступно в больших количествах. В этой связи, применение генов молочного белка в продуцировании рекомбинантных ССЖЛ/КСЛ человека имеет еще и то преимущество, что ССЖЛ/КСЛ продуцируются в условиях, аналогичных условиям их естественного продуцирования, с точки зрения регулирования экспрессии и места продуцирования (молочная железа). В контексте настоящего изобретения термин "гибридный ген" относится к ДНК последовательности, содержащей, с одной стороны, ДНК последовательность, кодирующую вышеохарактеризованные ССЖЛ/КСЛ человека, а с другой стороны, ДНК последовательность гена молочного белка, способного поддерживать экспрессию продукта гибридного гена. Термин "ген, кодирующий молочный белок", относится ко всему гену, а также к его последовательности, способных поддерживать и направлять экспрессию гибридного гена в представляющей интерес ткани, то есть в молочной железе. Обычно такая последовательность - это последовательность, включающая по меньшей мере одну или несколько областей промотра, участок начал транскрипции, некодирующие 3'- и 5'области и структуральные последовательности. ДНК последовательность, кодирующая ССЖЛ/КСЛ человека предпочтительно по существу не содержит прокариотных последовательностей, например, векторных последовательностей, которые могут быть связаны с ДНК последовательностью после, например, ее клонирования. Гибридный ген рекомендуют создавать вставкой in vitro известными специалистам методами в ген молочного белка ДНК последовательности, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека. Или же ДНК последовательность, кодирующая ССЖЛ/КСЛ человека, может быть вставлена in vivo гомологичной рекомбинацией. Как правило, ДНК последовательность, кодирующая ССЖЛ/КСЛ человека, вставляется в один из первых экзонов выбранного гена молочного белка или в его эффективную последовательность, содержащую первые экзоны и предпочтительно значительную часть фланкирующей 5'области, которые, как полагают, играют важную регулирующую роль. Рекомендуется, чтобы гибридный ген включал последовательность, кодирующую сигнальный пептид, необходимый для секретирования надлежащим образом продукта гибридного гена в молочную железу. Сигнальный пептид - это, как правило, пептид, находящийся обычно в рассматриваемом гене молочного белка, или пептид, связанный с ДНК последовательностью, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека. Однако, также возможны и другие сигнальные последовательности, способные поддерживать секрецию продукта гибридного гена в молочную железу. Разумеется, различные элементы гибридного гена должны быть слиты пу тем, позволяющим правильную обработку и экспрессию генного продукта. Так, ДНК последовательность, кодирующая выбранный сигнальный пептид, как правило, должна быть точно слита с N-концевой частью ДНК последовательности, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека. В гибридном гене ДНК последовательность, кодирующая ССЖЛ/КСЛ человека, обычно включает их терминирующий кодон, но без их участка сигнала отщепления и полиаденилирования. В нисходящем направлении от ДНК последовательности, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека, обычно сохраняются процессинговые последовательности мРНК гена молочного белка. Считается, что целый ряд факторов отвечает за реальный уровень экспрессии конкретного гибридного гена. Эффективность промотора, а также других вышеупомянутых регуляторных последовательностей, участок интеграции экспрессионной системы в геноме млекопитающего, участок интеграции ДНК последовательности, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека, в кодирующем молочный белок гене, элементы, создающие послетранскрипционную регуляцию, и другие аналогичные факторы могут иметь жизненно важное значение для достигаемого уровня экспрессии. Основываясь на знании разнообразных факторов, влияющих на уровень экспрессии гибридного гена, специалист способен создать экспресионную систему, применимую для целей настоящего изобретения. Молочной железой секретируется целый ряд различных молочных белков. Существует основная группа молочных белков, а именно: казеины и сывороточные белки. Состав молока от животных различного вида меняется качественно, а также количественно по содержанию указанных белков. Большинство отличных от человека млекопитающих продуцируют казеин 3 различных типов, а именно: a-казеин, b-казеин и c-казеин. К наиболее обычным коровьим сывороточным белкам относятся a-лактальбумин и b-лактальбумин. Состав молока различного происхождения подробно раскрывается в работе Сlark и др. (1987). Применяемый ген молочного белка может происходить от того же вида, что и вид, в который вводится экспрессионная система, или может происходить от других видов животных. В этой связи показано, что регуляторные элементы, направляющие экспрессию гена на молочную железу, функциональны в границах вида, что может быть связано с возможным общим предшественником (Hennighausen и др., 1990). Примеры приемлемых генов, кодирующих молочный белок, или его эффективных субпоследовательностей, предназначенных для конструирования экспрессирующей системы изобретения, как правило, могут быть обнаружены среди генов сывороточных белков разнообразных млекопитающих, например: гена сывороточного кислотного белка (WAP-ген), предпочтительно мышиного происхождения и гена b-лактоглобулина, предпочтительно овечьего происхождения. Кроме того, для трансгенного продуцирования ССЖЛ/КСЛ человека, могут оказаться пригодны гены казеина различного происхождения например: коровий aS1казеин и кроличий b-казеин. Рекомендуемым для 14 41322 применения в настоящем изобретении геном является мышиный WAP-ген, поскольку обнаружено, что этот ген способен обеспечить на высоком уровне экспрессию ряда чужеродных белков человека в молоке различных трансгенных животных (Hennighausen и др. 1990). Другой рекомендуемой последовательностью, связанной с экспрессирующей системой изобретения, является так называемая стабилизирующая экспрессирующая последовательность, способная поддерживать высокий уровень экспрессии. Существуют сильные доказательства того, что такая стабилизирующая последовательность находится вблизи и в восходящем направлении от генов молочных белков. ДНК последовательность, кодирующая ССЖЛ/КСЛ человека и подлежащая вставке в экспрессирующую систему изобретения, может быть геномного или искусственного происхождения, или их комбинацией. Некоторые экспрессионные системы для достижения удовлетворительной экспрессии, как обнаружено, требуют присутствия интронов и иных регуляторных областей (Hennighausen и др., 1990). В некоторых случаях может оказаться желательным введение в векторные конcтрукции в качестве кодирующего полилептид элемента геномных структур, а не элементов кДНК (Brinster и др.). Применение интронных и экзонных структур может привести к более высокому уровню мРНК в устойчивом состоянии, чем в случае применения векторов на основе кДНК. В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к гибридному гену, включающему ДНК последовательность, кодирующую ССЖЛ/КСЛ человека и вставленную в ген, кодирующий молочный белок отличного от человека млекопитающего, при этом ДНК последовательность вставляется в ген молочного белка таким образом, что способна экспрессироваться в молочной железе млекопитающего, принявшего гибридный ген. Гибридный ген и его составляющие подробно обсуждены выше. Гибридный ген является важным промежуточным элементом в конструировании экспрессирующей системы изобретения, раскрытой выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к клетке отличного от человека млекопитающего, принявшей вышеохарактеризованную экспрессирующую систему. Рекомендуемой клеткой млекопитающего является клетка эмбриона, или пронуклеус. Экспрессирующую систему вводят соответствующим образом в клетку млекопитающего применением способа, разъясняемого далее и иллюстрируемого нижеследующими специальными примерами. В еще одном своем важном аспекте настоящее изобретение относится к способу создания трансгенного, отличного от человек млекопитающего, способного экспрессировать ССЖЛ/КСЛ человека. Способ состоит в инъецировании вышеопределенной экспрессионной системы изобретения в оплодовторенную яйцеклетку или клетку эмбриона млекопитающего с введением в результате экспрессионной системы в зародышевую линию млекопитающего с последующим развитием полученного инъецированного оплодотворенного яйца или эмбриона во взрослую самку млекопитающего. Введение экспрессионной системы в зародышевую линию млекопитающего может быть осуществлено применением любой приемлемой методики, приведенной, например, в издании "Манипуляции с эмбрионом мыши", Лабораторное руководство, Коулд Спринг Харбор Лаборетори Пресс, 1986. К примеру, несколько сот молекул экспрессионной системы могут быть непосредственно инъецированы в оплодотворенную яйцеклетку, например, в одну ее оплодотворенную клетку или ее пронуклеус, или в эмбрион выбранного млекопитающего, после чего микроинъецированные яйцеклетки могут быть перенесены в яйцеводы псевдобеременных приемных матерей с последующим развитием эмбрионов. Как правило, не все инъцированные яйцеклетки развиваются во взрослые самки, экспрессирующие ССЖЛ/КСЛ человека. Так, около половины животных со статистической точки зрения будут самцами, от которых, однако, в следующих поколениях могут быть получены и самки. После интегрирования в зародышевую линию ДНК последовательность, кодирующая ССЖЛ/КСЛ человека, может быть экспрессированна на высоком уровне с продуцированием правильно обработанных и функциональных ССЖЛ/КСЛ человека в стабильных линиях рассматриваемого млекопитающего. Особый интерес представляет способ созданий трансгенных, отличных от человека млекопитающих, способных экспрессировать ССЖЛ/КСЛ человека и по существу неспособных экспрессировать собственные ССЖЛ/КСЛ. Способ состоит в: (а) уничтожении способности млекопитающим экспрессировать ССЖЛ/КСЛ с тем, чтобы по существу никакой экспрессии ССЖЛ/КСЛ не происходило, и введении вышеохарактеризованной экспрессионной системы изобретения или ДНК последовательности, кодирующей ССЖЛ/КСЛ человека, в зародышевую линию млекопитающего таким образом, что в млекопитающем экспрессируются ССЖЛ/КСЛ человека, и/или (b) замене CEL-гена млекопитающего или части гена на вышеохарактеризованную экспрессионную систему изобретения или на ДНК последовательность, кодирующую ССЖЛ/КСЛ человека. Способность млекопитающего экспрессировать ССЖЛ/КСЛ обычно уничтожают созданием мутаций в ДНК последовательности, отвечающей за экспрессию ССЖЛ/КСЛ. Такие мутации включают мутации, при которых ДНК последовательность выводится из рамки, вводится терминирующий кодон или происходит делеция одного или нескольких нуклеотидов ДНК последовательности. Замена CEL-гена млекопитающего или его части на вышеохарактеризованную экспрессионную систему или на ДНК последовательность, кодирующую ССЖЛ/КСЛ человека, может быть осуществлена применением хорошо известных принципов гомологичной рекомбинации. В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к трансгенному, отличному от человека млекопитающему, созданному вышеприведенным способом. 15 41322 брану подвергают гибридизации с разнообразными кДНК зондами. Фрагменты рестрикции, гибридизованные с зондами, выделяют применением метода изтахофореза (Öfverstedt и др., 1984). Более мелкие фрагменты (