Спосіб покращення харчового профілю рослин шляхом модифікації рівня вторинних метаболітів у рослинах, генетично змінена рослина або її нащадок та корм для тварин

1. Спосіб покращення харчового профілю рослини, що складається з : - забезпечення ДНК послідовності, що кодує фермент, здатний модифікувати використання проміжного субстрату у вторинному метаболічному шляху, зв’язаний з харчовим профілем рослини, причому зазначений фермент не зустрічається в природі у вказаному вторинному метаболічному шляху; - трансформування рослинної клітини вказаної рослини експресійною касетою, що містить вказану діючу ДНК послідовність, операбельноз’єднану з насіннєселективним промотором, та - регенерація генетично зміненої рослини з вказаної рослинної клітини, причому вказана 2 (19) 1 3 75562 4 послідовність міоінозит-О-метилтрансферази 25. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 24, яка відрізняється тим, що вказаним Mesembryanthemum crystallinum. 13. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що холіновим метаболізуючим ферментом є вказаний покращений харчовий профіль включає холіноксидаза. зменшений склад фітинової кислоти в порівнянні з 26. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 25, яка відрізняється тим, що вона додатково диким типом вказаної рослини. 14. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що містить ДНК послідовність, що кодує бетаїнвказаний покращений харчовий профіль включає альдегіддегідрогеназу, здатну перетворювати зменшений склад синапіну в порівнянні з диким альдегід бетаїну на бетаїн. типом вказаної рослини. 27. Генетично змінена рослина або її нащадок за 15. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що п. 23, яка відрізняється тим, що вказаний вказаний покращений харчовий профіль включає фермент впливає на ферулову кислоту. змінений склад лігніну в порівнянні з диким типом 28. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 27, яка відрізняється тим, що вказаним вказаної рослини. 16. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який ферментом є декарбоксилаза ферулової кислоти. відрізняється тим, що вказаним субстратом не є 29. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаним первинний метаболіт з групи, що складається з глюкози, амінокислот, простих жирних кислот та вторинним метаболічним шляхом є вторинний нуклеотидів. метаболічний шлях цукрового спирту. 17. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який 30. Генетично змінена рослина або її нащадок за відрізняється тим, що вказаним насінним п. 22, яка відрізняється тим, що вказаний промотором є фазеоліновий промотор або napinсубстрат вибрано із групи, що складається з промотор. міоінозиту, галактинолу та УДФ-похідних цукрів. 18. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який 31. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаним додатково містить наступну стадію: вирощування вищевказаної генетично зміненої субстратом є міоінозит, а вказаним ферментом є рослини за умов, які дозволяють утворення фермент, що діє на міоінозит. насіння та регенерацію цього насіння. 32. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 31, яка відрізняється тим, що вказаним 19. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який відрізняється тим, що рослина вибрана з ферментом є міоінозит-О-метилтрансфераза. дводольних і однодольних. 33. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 32, яка відрізняється тим, що вказана 20. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який відрізняється тим, що вищезгадана рослина міоінозит-О-метилтрансфераза має ДНК вибрана з родини Brassicaсеае, краще з роду послідовність міоінозит-О-метилтрансферази Brassica, краще Brassica rapa або Brassica napus. Mesembryanthemum crystallinum. 21. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який 34. Генетично змінена рослина або її нащадок за відрізняється тим, що вищезгадана рослина будь-яким з пунктів 22-33, яка відрізняється тим, вибрана із групи, що складається з кукурудзи, що вказаним субстратом не є первинний каноли, пшениці, ячменю, люцерни, сої та сорго. метаболіт з групи, що складається з глюкози, 22. Генетично змінена рослина або її нащадок, що амінокислот, простих жирних кислот та містить рекомбіновану молекулу ДНК, стабільно нуклеотидів. вбудовану в ген згаданої рослини, причому 35. Генетично змінена рослина або її нащадок за будь-яким з пунктів 22-33, яка відрізняється тим, вказана рекомбінантна молекула ДНК містить: насіннєселективний промотор; що вказаним насіннєселективним промотором є ДНК послідовність, операбельно з’єднану з фазеоліновий промотор або napin-промотор. зазначеним насіннєселективним промотором, яка 36. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаний кодує фермент, здатний модифікувати використання проміжного субстрату у вторинному покращений харчовий профіль включає метаболічному шляху, зв’язаному з харчовим зменшений склад фітинової кислоти в порівнянні з профілем рослини, причому фермент не диким типом вказаної рослини. зустрічається в природі у вказаному вторинному 37. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що включає метаболічному шляху; причому згадана генетично змінена рослина, її зменшений склад синапіну, в порівнянні з диким клітина, насіння або складова вказаної генетично типом вказаної рослини. зміненої рослини, або її нащадка, 38. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вона має характеризується покращеним харчовим профілем рослини по відношенню до дикого типу вказаної змінений склад лігніну, в порівнянні з диким типом рослини. вказаної рослини. 23. Генетично змінена рослина або її нащадок за 39. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаним будь-яким з пунктів 22-38, яка відрізняється тим, вторинним метаболічним шляхом є що рослина вибрана з дводольних і однодольних. фенілпропаноїдний шлях. 40. Генетично змінена рослина або її нащадок за будь-яким з пунктів 22-38, яка відрізняється тим, 24. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 23, яка відрізняється тим, що вказаним що вищезгадана рослина вибрана з родини ферментом є холіновий метаболізуючий Brassicaсеае, краще з роду Brassica, краще фермент. Brassica rapa або Brassica napus. 5 75562 6 41. Генетично змінена рослина або її нащадок за 42. Корм для тварин, який хоча б частково будь-яким з пунктів 22-38, яка відрізняється тим, отримують з генетично зміненої рослини або її що вищезгадана рослина вибрана з групи, що нащадка за будь-яким з пунктів 22-41, або з її складається з кукурудзи, каноли, пшениці, ячменю, клітини, насіння, або будь-якої іншої її складової. люцерни, сої та сорго. Ця заявка є частковим продовженням заявки США, порядковий номер 09/012, 453, та заявляє пріоритет з попередньої заявки 60/072, 156. У даному винаході пропонуються способи та композиції для зміни рівня сполук, що утворюються внаслідок процесів вторинних метаболічних шляхів у рослин. Також у винаході пропонуються рослинні клітини зі зміненим рівнем вторинних метаболітів та насіння рослин зі зміненим рівнем вторинних метаболітів. В одному втіленні у рослинах, рослинних клітинах та насінні рослин згідно з винаходом змінено рівень нехарчових вторинних метаболічних речовин. В іншому втіленні у рослинах, рослинних клітинах та насінні рослин згідно з винаходом змінено рівень продуктів вторинних метаболічних шляхів, таких як фенілпропаноїди та цукрові спирти. Також у винаході пропонуються генетичні конструкти та вектори, що застосовуються для модифікації рівня вторинних метаболітів у рослинних клітинах та насінні. Винахід також стосується борошна з модифікованого зерна, корму для тварин, що містить борошно з модифікованого зерна, і зокрема борошно з зерна, у якому рівень вторинних метаболітів зменшено або змінено. Рослини утворюють велику кількість різних сполук шляхом вторинного метаболізму. Внаслідок вторинних метаболічних шляхів, що не вважаються суттєвими для метаболізму рослин, часто утворюються унікальні біохімічні речовини, причому деякі з них вважаються нехарчовими або навіть токсичними. Вторинні метаболічні шляхи та сполуки, що утворюються внаслідок цих шляхів, часто є специфічними для окремого виду або роду. Тому обробка вториних метаболічних шляхів може привести до виникнення нових композицій біохімічних речовин або рослинних тканин зі зміненим рівнем вторинних метаболітів. Зокрема, обробка вторинних метаболічних шляхів з метою зміни рівня вторинних метаболічних сполук, що є нехарчовими або токсичними за своєю природою, може привести до унікальних застосувань у галузі харчів та корму. Обробку вторинного метаболізму бажано проводити, не змінюючи біохімічних процесів, що вважаються життєво необхідними для росту та життєздатності рослинної клітини. Сукупність біохімічних процесів та сполук, що є важливими для росту та життєздатності рослини, які беруть у них участь, вважаються процесами основного метаболізму та їхніми продуктами. Основний метаболізм взагалі розглядається як такий, що включає в себе ті біохімічні процеси, що приводять до утворення основних цукрів (наприклад, глюкози), амінокислот, звичайних жирних кислот, нуклеотидів та їх полімерів (полісахаридів, таких як крохмаль, білки, ліпіди, рибонуклеїнові та дезоксирибонуклеїнові кислоти тощо) [Yeoman and Yeoman, Tansley Review No.90, Manipulating Secondary Metabolism in Cultured Plant Cells, New Phytologist, 134:553-569, 1996]. Таким чином, прийнято розрізняти основний метаболізм як процес обміну речовин, що є важливими для життєздатності та росту усіх клітин рослини, та вторинний метаболізм як біохімічні процеси, що не є життєво необхідними для усіх клітин рослини. Наприклад, вторинні метаболічні шляхи обумовлюють такі ознаки рослини, як колір, смак, морфологію тощо. Також внаслідок процесів вторинних метаболічних шляхів утворюються різноманітні сполуки, що сприймаються комахами або беруть участь у реакції на патогени. Деякі з цих сполук можуть бути корисними для деяких видів рослин у диких умовах, але у культивованому стані ці сполуки можуть погіршувати якість вирощуваного продукту або обмежувати використання врожаю при певних застосуваннях. Деякі вторинні метаболіти є унікальними сполуками, що виникли внаслідок еволюції у видів як результат спеціалізованих біохімічних процесів. Вторинний метаболізм не відзначається надмірністю біохімічних механізмів, що є типовим для основного метаболізму, тому, як правило, продукти вторинного метаболізму не утворюються в рослині багатьма шляхами. Вторинні метаболіти типово є більш специфічними для окремих рослин, ніж розповсюджені біохімічні речовини, що беруть участь у основних шляхах. Численні спроби модифікації процесів основного метаболізму призвели до появи рослинних клітин зі зміненим рівнем крохмалю або олії (ліпідів). Проте грубий вплив на основний метаболізм може призвести до шкідливих наслідків. Наприклад, можна змінити склад ліпідів, проте видалення ліпідів було б негативним наслідком для життєздатності клітини. Обробка основного метаболізму не завжди є цілком успішною, тому що велика кількість біохімічних механізмів може подолати будь-які спроби обробки. Таким чином, процеси основного метаболізму в рослин часто важко змінити так, щоб можна було б повністю передбачити та одержати застосовувані та помітні результати в умовах культивування. У деяких випадках основний метаболізм було успішно модифіковано для створення нового фенотипу, у якому було досягнуто зміни складу, а 7 75562 8 не зменшення чи виключення окремої речовини. розглядаються як шляхи вторинного Типово, такі маніпуляції здійснювалися шляхом метаболізму, були предметом досліджень, метою ектопічної експресії гена рослини, наприклад, яких є зміна рівня кінцевого продукту. Способи, надекспресією гена у деяких тканинах або у що використовувались для маніпулювання цими конститутивній формі частіше, ніж у регульованій шляхами, не призвели до бажаного результату. формі, або інгібуванням активності певного гена Наприклад, фенілпропаноїдний шлях бере участь за допомогою антизмістовної РНК, рибосомних в утворенні лігніну та може вважатися вторинним ферментів або косупресії. Проте, дуже важко метаболічним шляхом. Біосинтез лігніну є було передбачити a priori наслідки таких частиною загального шляху біосинтезу маніпуляцій. фенілпропаноїдів, у якому утворюються Експресію рослинного ферменту можна принаймні три основні фенольні попередники: змінити на багатьох рівнях. До них відноситься кумарова, ферулова та синапінова кислоти, контроль на рівні експресії гена, трансляції, продукти яких полімеризуються у лігнін та інші процесингу білка та алостеричний контроль за фенольні сполуки (див. Фіг.2). функцією білка. Таким чином, ектопічна експресія У спробах змінити вторинний метаболічний гена рослини, що бере участь в основному шлях фенілпрвланоїдів гени багатьох ферментів, метаболізмі, може не подолати комплексного що беруть участь в утворенні мономерів лігніну, біохімічного контролю основного метаболізму. тепер розглядаються як мішені для зменшення Окрім того, проблему великої кількості шляхів рівня лігніну шляхом використання основного метаболізму також важко подолати, антизмістовних послідовностей або косупресії оскільки процеси основного метаболізму важливі (наприклад, патент США №5451514, патент США для росту та життєздатності рослини. Таким №5633439, WO 93/05160, WO 94/08036). До цих чином, спроби змінити основний метаболізм генів-мішеней відносяться ті, що кодують часто не призводять до створення бажаного дегідрогеназу цинамілового спирту, О-метилфенотипу. Більше того, випробування таких трансферазу кофеїнової кислоти та модифікованих рослин у польових умовах або в фенілаланінамонійліазу. Ці способи спрямовані екстремальних умовах навколишнього на зменшення рівня лігніну, оскільки вважається, середовища часто виявляють, що що це матиме загальний корисний вплив на передбачуваний ефект не спостерігається або переробку або засвоєння рослин. життєдіяльність рослини ставиться під загрозу. Проте зменшення рівня лігніну шляхом Таким чином, модифікація основного використання антизмістовної послідовності або метаболізму вимагає ретельного розгляду косупресії одного з генів фенілпропаноїдного процесу основного метаболізму або обачливого шляху може мати велику кількість небажаних впровадження етапу в межах шляху, щоб досягти наслідків. До них відносяться: підвищена потрібного фенотипу. схильність до захворювань, змінені темпи росту Маніпулювання процесами вторинних або зменшення фізичної міцності рослинних метаболічних шляхів утруднювалася недостатнім волокон та, як наслідок, зменшення агрономічної розумінням їх біохімії, недостатньою інформацією ефективності. Було показано, що інгібування про гени, задіяні у вторинних метаболічних ферменту фенілаланінамонійліази призводить до шляхах, та складною взаємодією між виникнення численних шкідливих фенотипів біохімічними процесами взагалі. [Elkind et. al., Abnormal Plant Development and Проте, способи зміни вторинного Down-Regulation of Phenylpropanoid Biosynthesis метаболізму можуть надати корисні засоби для in Transgenic Tobacco Containing a Heterologous створення нових фенотипів, включаючи Phenylalanine Ammonia Lyase Gene, Proc. Natl. фенотипи зі зміненою кількістю сполук Acad. Sci. USA 87:9057-9061, 1990]. Фермент вторинного метаболізму, наприклад, таких, що фенілаланінамонійліаза діє на основний вважаються нехарчовими за своєю природою. метаболіт фенілаланін, що є амінокислотою. Отже, вторинні метаболічні шляхи речовин є Результати цих експериментів показують, що важливим завданням для генетичної модифікації зміна вторинного метаболізму шляхом рослин. модифікації одного з основних метаболітів, що Були здійснені спроби щодо перенесення бере участь в окремому вторинному шляху біосинтезу бетаїну в рослини, що є метаболічному шляху, може створити небажані нездатними синтезувати осмопротектор — та шкідливі фенотипи. Отже, вибір біохімічного бетаїн. [Holmstrom, К.О. et al., Production of the етапу або етапів у межах вторинного Escherichia coli betaine-aldehyde dehydrogenase? метаболічного шляху є вирішальним для An enzyme required for synthesis of osmoprotectant створення рослин, які є фенотипічно glycine betaine, in transgenic plants, The Plant нормальними, але виявляють зменшення рівня Journal, (1994) 6(5):749-58] описує використання певного вторинного метаболіту. гена, що кодує бетаїн-альдегіддегідрогеназу для Окрім того, застосування антизмістовної РНК синтезу осмопротектора — гліцинбетаїну. або косупресії може не призвести до зниження У роботі [Derwent abstract AN 96-512578, рівня або специфічності певного вторинного Toyota Jidosha KK, 15 жовтня, 1996] описується метаболіту, що є економічно прийнятним. На використання гена холіндегідрогенази та гена додаток, інгібування генів, що кодують головні бетаїн-альдегіддегідрогенази для синтезу ферменти, може вплинути на експресію осмопротектора бетаїну. пов'язаних з ними генів. Таким чином, було Два біохімічних шляхи в рослинах, що досягнуто невеликого прогресу у зменшенні рівня 9 75562 10 фенольних сполук, що вважаються нехарчовими, метаболіти (амінокислоту триптофан та або у зменшенні рівня лігніну шляхом мінеральну сірку) і, отже, будь-яка значна зміна застосування антизмістовної РНК або косупресії рівня цих сполук в рослинній клітині може без шкідливих побічних ефектів. викликати шкідливі наслідки. Таким чином, Другим прикладом спроб змінити запропонованим способом не можна специфічно метаболічний шлях, що зазнали невдачі, є впливати на вторинний метаболізм. Дійсно, зміна модифікація біосинтезу глюкозинолату в насінні рівня триптофану може призвести до багатьох рапсу. Повідомлялося про спроби змінити рівень шкідливих наслідків. Таким чином, зміна рівня глюкозинолату в борошні з рапсу шляхом основного метаболіту не дає бажаного ефекту обробки — глюкозинолатного шляху. зниження глюкозинолатів у борошні з рапсу, що Пропонувався спосіб зміни біосинтезу підкреслює складність зміни основного глюкозинолату, що полягав у створенні нового метаболізму. шляху, конкурентного для сірки, що У WO 97 23599 A Method for Regulation of використовується при утворенні глюкозинолатів, Plant Composition, [E.I. DuPont and Purdue або в зменшенні рівня триптофану, що Research Foundation, 3 липня, 1997 року] використовується при утворенні глюкозинолатів описується використання ферулат-5-гідроксилази шляхом перетворення триптофану на триптамін (ФГ), одержаної з хрестоцвітої рослини, для ["Engineering Altered Glucosinolate Biosynthesis by регулювання рівня лігніну в рослинних клітинах. Two Alternative Strategies", by Ibrahim, Chavadej & Фермент ФГ, описаний у WO 97 23599, являє De Luca, published in: Generic engineering of plant собою фермент, що зазвичай розглядається як secondary metabolism 1994, Plenum Publishing частина фенілпропаноїдного шляху в рослинних Corporation; New York; USA]. клітинах, наприклад, у хрестоцвітій рослині, з якої Однак цей спосіб не був успішним для він був одержаний. Фермент ФГ, описаний у WO зниження рівня глюкозинолату в борошні з рапсу. 97 23599, не виявляє активності у Виявилося, що цим способом неможливо трансформованій клітині, проте виявляє зменшити рівень нехарчових глюкозинолатів у активність у клітині, з якої він був одержаний. борошні з рапсу. Глюкозинолати утворюються в Таким чином, загальний спосіб зміни листі рослин і потім переносяться до насіння. вторинного метаболізму буде корисним для зміни Тому цей спосіб був оснований на припущенні, біохімічного складу рослинних тканин. Він може що проста зміна доступності одного з основних включати, наприклад, зменшення рівня метаболітів (сірки, амінокислоти триптофану), що нехарчових сполук, зміну профілю вторинного беруть участь в утворенні глюкозинолатів, метаболізму, одержання рослинної тканини зі зменшить утворення глюкозинолатів. Однак зміненим процесингом, зміну рівня сполук, що основними глюкозинолатами в насінні є знаходять застосування у промисловості або у аліфатичні глюкозинолати, що не використовують фармацевтиці, створення рослин зі зміненим амінокислоту триптофан для створення бокових смаком, будовою або виглядом, створення ланцюгів. Більше того, результати цих рослин зі зміненими вторинними метаболітами, експериментів (наприклад, [Chavadej et. al., Proc. що приваблюють комах, пов'язані з чутливістю до Natl. Acad. Sci. USA, 91:2166-2170, 1994] захворювань або іншими біологічними показали, що трансгенні рослини, у складі яких є процесами, на які впливають вторинні фермент, здатний змінювати кількість основної метаболіти, або рослин з позитивно зміненими амінокислоти триптофану, не містять зменшеної характеристиками росту внаслідок зміни рівня кількості глюкозинолатів у насінні; рівень вторинних метаболітів. аліфатичного глюкозинолату в насінні дорівнює У даному винаході пропонується спосіб або є навіть більшим, ніж у нетрансгенних спрямованого впливу на утворення вторинних рослин. Таким чином, загальне утворення метаболітів. Спосіб включає зміну доступності глюкозинолатів у насінні не зменшилося, навіть субстрату, що є специфічним до вторинного коли виявилось зменшення рівня мінорного метаболічного шляху та важливим для утворення компоненту (індолглюкозинолатів). З генетичних кінцевих продуктів вторинного метаболізму, досліджень видно, що рослини з низьким рівнем зокрема сполук, що беруть участь на 1—5 глюкозинолату можна одержати шляхом біохімічних етапах утворення кінцевого продукту. звичайного розведення. Та існує велика кількість Спрямування впливу на субстрати на етапах, локусів, що контролюють низький рівень близьких до утворення кінцевого продукту, глюкозинолатів у хрестоцвітих. Існують чисельні дозволяє уникнути проблем, пов'язаних зі зміною біохімічні перетворення, що відбуваються при рівня метаболітів, які також причетні до основних біосинтезі глюкозинолатів, та ці перетворення, шляхів, оскільки воно відбувається після моменту подібно до усіх або більшості процесів синтезу потрапляння субстрату до основного глюкозинолатів, мають бути об'єктом у способі метаболічного шляху. Таким чином, цей спосіб зменшення загального рівня глюкозинолатів. пропонує нові засоби специфічного спрямування Таким чином, при розробці загального способу впливу зменшення або зміни рівня вторинних зміни утворення глюкозинолатів у хрестоцвітих метаболітів за допомогою виявлення треба враховувати різні ферменти та субстрати, попередників, що беруть участь у вторинному що беруть участь у біосинтезі глюкозинолатів. метаболічному шляху, що не являються Проте виявляється, що ферменти, які субстратами основних метаболічних шляхів. використовуються для одержання цієї Спосіб може також включати зміну модифікації, також впливають на основні доступності субстрату тканинно-специфічним 11 75562 12 способом так, що змінюватимуться тільки окремі шкірці проростаючого насіння як частини тканини, наприклад, тканини насіння. загальної кількості міченого синапіну в насінні. Таким чином, у даному способі пропонуються Фіг.8: Рівень синапіну в сім'ядолі та осях нові засоби специфічного спрямовування впливу зародка проростаючого насіння на одиницю маси на зменшення або зміну рівня вторинних зразка тканини. метаболітів завдяки виявленню попередників, що Фіг.9 : Визначення рівня синапіну в сім'ядолі беруть участь у вторинному метаболічному та осі зародка проростаю чого насіння на одну шляху, які не являються сполуками основного насінину, тобто на вісь або пару сім'ядоль. метаболізму. Фіг.10А та 10Б: Послідовність нуклеотидів У першому втіленні цей винахід пропонує відкритої рамки зчитування холіноксидази (SEQ. спосіб створення генетично трансформованої ID. №3). рослини, що складається з: Фіг.11 : Передбачувана послідовність А) введення в клітину, яка може бути амінокислот відкритої рамки зчитування трансформована та регенерована у цілу рослину, холіноксидази (SEQ. ID. №4). касети для експресії ДНК, що містить окрім Фіг.12: Діаграма вектора pHS 731, що містить послідовності ДНК, потрібної для трансформації ген ХО під контролем тканино-селективного та селекції в рослинних клітинах, також промотору, для трансформації рослини. послідовність ДНК, яка під контролем промотору, Фіг.13: Зменшення рівня синапіну у насінні активного в рослинних клітинах, кодує білок, Brassica sp. завдяки експресії гена ХО. здатний змінити використання субстрату у Фіг.14: Діаграма вектора pHS 981, що містить вторинному метаболічному шляху за умови, що ген БАДГ під контролем тканино-селективного субстрат не є основним метаболітом, таким як промотору, для трансформації рослини. глюкоза, амінокислоти, звичайні жирні кислоти та Фіг.15: Зменшення рівня синапіну у насінні нуклеотиди; Brassica sp. завдяки експресії генів ХО та БАДГ. Б) вирощування рослини зі зміненим рівнем Фіг.16 : Зміна рівня фенольних сполук в принаймні одного з продуктів вторинного насінні Brassica sp. завдяки експресії генів ХО та метаболічного шляху. БАДГ. В іншому втіленні цей винахід пропонує Фіг.17: Послідовність нуклеотидів спосіб створення генетично трансформованого синтетичного гена декарбоксилази Федулової насіння, що складається з вирощування рослини, кислоти В. pumulis, оптимізованого для експресії одержаної на етапах А та Б описаного вище у рослинних клітинах (SEQ. ID.№1). способу за умов утворення насіння. Фіг.18: Передбачувана послідовність Рекомбінантна ДНК — це послідовність ДНК, амінокислот білка, закодованого синтетичною інтегрована у хромосому та геном родючої відкритою рамкою зчитування декарбоксилази рослини таким чином, що вона успадковується ферулової кислоти В.pumulis (SEQ. ID. №2). наступними поколіннями. Фіг.19: Рестрикційна мапа вектора, що В іншому втіленні цей винахід пропонує вектори містить ген декарбоксилази Федулової кислоти для трансформації рослин, рослини та насіння, під контролем конститутивного промотору 35S, трансформовані згідно з вищеописаним методом, для трансформації рослини. та харчові продукти, що містять насіння або Фіг.20: Рестрикційна мапа вектора, що борошно, одержане з насіння. містить ген декарбоксилази Федулової кислоти Короткий опис малюнків: під контролем насіння-селективного напінового Фіг.1: Схематичне зображення загальної промотору, для трансформації рослини. схеми способу зміни будь-якого вторинного Фіг.21: Накопичення фітинової кислоти під метаболічного шляху. час проростання насіння. Фіг.2: Схематичне зображення загального Фіг.22: Особливості накопичення фітинової фенілпропаноїдного метаболізму та утворення кислоти в різних тканинах насіння, що проростає. синапіну у хрестоцвітих. Фіг.23: Рівень засвоєного міченого міоінозиту Фіг.3: Початок та розвиток синтезу синапіну в у фітиновій кислоті, ліпідах, TFA-розчинній насінні, що проростає. Аналіз насіння Brassica фракції стінки клітини та уламках клітини. napus сорту Westar методом тонкошарової Фіг.24: Послідовність ампліфікованого хроматографії. фрагмента ДНК гена О-метилтрансферази Фіг.4: Кількісний аналіз накопичення синапіну міоінозиту (SEQ. ID. №5). в насінні, що проростає, методом HLPC. Фіг.25: Рестрикційна мапа вектора pSIMT, що Фіг.5: Визначення здатності проростаючого містить касету: промотор 35S - IMT-GUS-Nos насіння синтезувати синапін шляхом уведення термінатор, в pRD400. радіоактивного холіну через ніжку вирізаних Фіг.26: Рестрикційна мапа вектора pNIMT, що стручків та включення мітки у синапін з 7-го по містить насіння-селективний промотор 35S -IMT43-тій день після запилення. Nos термінатор, у pRD400. Фіг.6: Визначення здатності проростаючого Фіг.27: PCR-аналіз трансгенних рослин, що насіння синтезувати синапін за поглинанням містять ген ІМТ. розчину, що містить радіоактивний холін, Фіг.28: Нозерн-блот аналіз рослин, що виділеним насінням та включення мітки у синапін містять ген ІМТ. з 43-го по 64-тий день після запилення. Фіг.29: Діаграма спостережуваного Фіг.7: Накопичення новосинтезованого зменшення рівня фітинової кислоти в синапіну в сім'ядолі, осях зародка та насінній трансгенних рослинах. 13 75562 14 Фіг.30: Зменшення рівня фітинової кислоти в в якій він експресується, можна обійти звичайні рослинах F1, F2 та F3, що містять вектор pSIMT. біохімічні механізми контролю та змінити Фіг.31: Зменшення рівня фітинової кислоти у вторинний метаболізм у передбачуваному рослинах F1 та F2, що містять вектор pNIMT. напрямі. Особливий інтерес у межах цього Цей винахід стосується специфічного винаходу викликає модифікація продуктів зменшення або зміни співвідношення рівня вторинного метаболічного шляху, що має попередників та продуктів вторинного відношення до вторинного метаболічного шляху метаболізму, відмінних від основних метаболітів. цукрових спиртів та фенілпропаноїдів. У такий спосіб можна уникнути потенціальних Додаткові приклади використання цього шкідливих ефектів зміни основних метаболічних способу - зміна рівня модифікованих цукрових шляхів, щоб досягти подібного результату. Таким сполук, таких як галактоза та нехарчові цукрові чином, цей винахід не стосується сполук, які глікозиди, такі як стахіоза та рафіноза. Галактоза могли б вважатися основними метаболітами. перетворюється на галактинол, який є одним з У кращому втіленні змінюється доступність попередників утворення цих нехарчових цукрових субстрату завдяки використанню ферменту, глікозидів. Попередником галактози є наприклад, стороннього для цієї рослинної кон'югована форма — УДФ-галактоза. Як спосіб, клітини, придатного для дії на цей субстрат та у об'ємі цього винаходу можна розглянути такого, що видаляє згаданий субстрат або змінює запобігання утворенню та накопиченню УДФйого доступність у наявній сукупності субстратів. галактози (та її наступному перетворенню у Узагальнений огляд способу та взаємодії між галактинол) завдяки використанню активності основним та вторинним метаболізмом показані ферменту, стороннього для рослинних клітин, на Фіг.1. Використання стороннього ферменту причому цей фермент здатен змінювати рівень для зміни потоку продуктів вторинного УДФ-галактози. Фермент 4-епімераза УДФметаболічного шляху призводить до модифікації галактози (УГЕ) використовується на одному з бажаного кінцевого вторинного метаболіту. Це головних етапів метаболізму галактози в живих змінює потік продуктів у вторинному системах. Він спричиняє перетворення УДФметаболічному шляху, призводячи до модифікації галактози на УДФ-глюкозу. Ген цього ферменту бажаного кінцевого вторинного метаболіту. Таким можна отримати з людини, дріжджів та бактерій. чином, рівень кінцевого продукту на окремих У цьому винаході передбачається використання ферментативних етапах вторинного ферменту, кодованого геном бактерій. метаболічного шляху зменшується, у той час як Внаслідок експресії цього стороннього на інших етапах, навпаки, продукт накопичується, ферменту в рослинній клітині може бути інгібуючи ферменти, що відповідають за зменшена доступність УДФ-галактози та утворення цього продукту. Це інгібування за утворена корисна речовина — УДФ-глюкоза. принципом зворотнього зв'язку, у свою чергу, Можна з упевненістю припустити, що експресія 4впливає на утворення кінцевого продукту всього епімерази УДФ-галактози призведе до зниження вторинного метаболічного шляху. Отже, зміна біосинтезу галактинолу, який є одним з рівня продуктів певного вторинного попередників нехарчових цукрових глікозидів. метаболічного шляху та пов'язаних з ними Окрім зменшення швидкості накопичення процесів досягається завдяки застосуванню небажаних цукрових глікозидів, активність нових ферментів, що змінюють потік біохімічних уведеного ферменту може спричинити підвищену речовин (тобто субстратів та їхніх продуктів) доступність УДФ-глюкози та внаслідок цього через цей шлях. Сторонні ферменти були утворення цукрози. Остання, як очікується, буде експресовані в рослинних тканинах, спричиняючи брати участь та збільшувати активність інших метаболічний перерозподіл попередників в метаболічних шляхів, для яких необхідна межах цих шляхів до речовин, які накопичуються цукроза, або для джерела вуглецю для без шкідливих ефектів у рослинній клітині. збільшення продуктивності рослини (тобто для У деяких втіленнях у результаті застосування білків, ліпідів, загального врожаю тощо) або цього способу утворюються корисні продукти або безпосередньо для накопичення цукрози. продукти, що корисно діють на рослинну клітину. Проте у об'ємі цього винаходу можна В одному втіленні попередник-мішень розглянути також інші застосування даного змінюється завдяки додаванню нового ферменту. способу. Існує можливість змінити рівень різних В одному кращому аспекті винаходу вибирається похідних цукрів, таких як глюкозо-1-фосфату та такий фермент, що має активність, сторонню для глюкозо-6-фосфату, використовуючи фермент рослинної клітини, в якій він експресується. фосфоглюкомутазу (ФГМ). Цей фермент Наприклад, такий фермент у звичайному стані не викликає взаємоперетворення глюкозо-1- та пов'язаний з вторинним метаболічним шляхом, глюкозо-6-фосфату (Глюкозо-1-Ф, Глюкозо-6-Ф) у що розглядається у рослинній клітині. синтезі та поглинанні цукрози. Він відіграє Використовуваний фермент може мати рослинне, головну роль у синтезі та використанні цукрози, тваринне або мікробіологічне походження та крохмалю та глікогену й присутній у всіх може бути модифікований для належної експресії організмах. Ген цього ферменту можна отримати в рослинних клітинах. Вибраний сторонній з великої кількості еукаріот, а також фермент здатний модифікувати попередник бактеріальних джерел (наприклад, таким чином, щоб змінити його доступність при Agrobacterium). утворенні вторинного метаболіту. Глюкозо-6-Ф є головним вихідним матеріалом Використовуючи фермент, сторонній для клітини, для великої кількості взаємоперетворень цукрів, 15 75562 16 одне з яких — синтез міоінозиту-1-Ф. Останній є карденоліди, кукурбітацини, квасиноїди та головним субстратом та кофактором у синтезі лимоніди, також утворюються зі сквалену. фітинової кислоти та, відповідно, нехарчових Надлишок сапоніну у раціоні тварин пов'язаний зі цукрових глікозидів. Експресія ферменту, як станом, відомим як здуття. можна очікувати, знизила б рівень Глюкозо-6-Ф, У даному винаході показано застосування що знизило б рівень вищезгаданих нехарчових способу у великій кількості незалежних вторинних факторів. У такий спосіб у об'ємі цього винаходу метаболічних шляхів. Однак застосовуваність можна розглянути різноманітні метаболічні зміни. способу модифікації будь-якого вторинного Цей спосіб не обмежується будь-яким метаболічного шляху в рослин буде очевидною окремим вторинним метаболічним шляхом. для кваліфікованого фахівця, та пропонується Також він не обмежується будь-яким окремим загальний спосіб втілення винаходу. видом рослини. Навпаки, цей спосіб може В одному втіленні цей винахід пропонує застосовуватися для зміни вторинних способи та композиції ДНК для зміни рівня метаболічних шляхів, звичайних у багатьох синапіну та пов'язаних з ним фенольних сполук в економічно корисних видів сільськогосподарських рослинах. В іншому втіленні винахід пропонує культур, включаючи одно- та дводольні, чи бути рослинні клітини зі зміненим рівнем фенольних спрямованим на вторинний метаболіт, який має речовин та насіння рослин зі зменшеним рівнем унікальне значення для окремої культури. фенольних речовин, зокрема хрестоцвіті рослини Біохімічна основа способу цього винаходу зі зменшеним рівнем синапіну. В іншому втіленні полягає в регулюванні активності ферментів за цей винахід пропонує способи та композиції ДНК рахунок доступності субстратів. Загалом, на для зміни рівня фітинової кислоти в рослинних швидкість ферментативних перетворень впливає клітинах (продукту вторинного метаболічного доступність субстратів. Інакше кажучи, фермент шляху цукрових спиртів). В іншому втіленні синтезує продукт у кількості, пропорційній винахід пропонує рослинні клітини зі зменшеним кількості доступного субстрату. Зменшення рівнем фітинової кислоти та насіння рослин зі концентрації субстрату викликає зменшення зменшеним рівнем фітинової кислоти. В іншому утворення продукту. Крім того, багато ферментів втіленні винахід пропонує насіння рослин зі інгібуються кінцевим продуктом, тобто швидкість зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне ферментативних перетворень зменшується у для харчового використання, насіння рослин зі присутності великого надлишку кінцевого зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне продукту. Отже, змінюючи рівень доступних для модифікованого борошна, та рослинні субстратів чи ферментативних продуктів, можна клітини зі зміненим метаболізмом цукрового керувати загальним утворенням сполук, що спирту (інозит). утворилися біохімічним шляхом. Кожен вторинний метаболічний шлях в Прикладами вторинних метаболічних шляхів, рослинах має обмежену кількість пов'язаних з що можуть бути змінені згідно з представленим ним ферментів та субстратів для них, які самі є винаходом, є біосинтез ізопреноїдів, біосинтез унікальними або використовуються в унікальний алкалоїдів, біосинтез терпеноїдів, біосинтез спосіб. Вторинний метаболічний шлях може фенолів, біосинтез цукрових спиртів або будьутворювати різні сполуки, що використовуються який інший вторинний метаболічних шлях, в або присутні в усій рослині. Тобто, як засіб для якому утворюються сполуки з нехарчовими або зміни вторинного обміну речовин економічно корисними властивостями. До використовуються унікальні ферменти для окремих вторинних метаболітів, що можуть бути специфічної зміни потоку сполук через певний змінені згідно з цим винаходом, відносяться шлях. Для ілюстрації використання способу було нехарчові фенольні сполуки, такі як синапін або змінено два різні вторинні метаболічні шляхи. глюкозинолати у хрестоцвітих, продукти цукрових Нижче представлено інформацію щодо цих спиртів, такі як фітинова кислота або стахіоза та процесів, яка допоможе повністю усвідомити рафіноза, госипол у бавовнику, нікотин, природу цього способу. хлорогенова кислота, конденсовані таніни або (А) Вторинний метаболічний шлях будь-який інший нехарчовий вторинний фенілпропаноідів метаболіт. Хлорогенова кислота звичайно Рослини синтезують велику кількість зустрічається в сої, бавовні, соняшнику та фенольних сполук через фенілпропаноїдний утворюється з кофеїнової кислоти — сполуки, що шлях, який є вторинним метаболічним шляхом. утворюється в межах фенілпропаноїдного шляху. Фенілпропаноїдний метаболізм бере участь у Проте, до інших нехарчових сполук належать багатьох фізіологічних процесах рослин, сапоніни — нехарчові сполуки, що зустрічаються включаючи резистентність до захворювань, в багатьох рослинах, включаючи люцерну. захист від ультрафіолетового випромінювання та Сапоніни — це високомолекулярні глікозиди, що регулювання росту рослини. Продукти цього складаються з цукрової складової, приєднаної до процесу використовуються у біосинтезі лігніну та тритерпену чи стероїду аглікону. Існують суберіну, які є компонентами рослинних тканин та принаймні три класи відомих сапонінів: беруть участь у формуванні рослинних волокон тритерпенові глікозиди, стероїдні глікозиди та — загальний термін, що стосується стероїдні алкалоїдні глікозиди. Біосинтез слабозасвоюваних вуглеводів зерна або сапонінів у рослинах засновується на вихідному борошна. Лігнін, як вважається, бере участь у матеріалі — сквалені. Інші важливі класи формуванні нерозчинних волокон, отже, високий вторинних метаболітів, такі як фітостерини, рівень лігніну зерна чи борошна пов'язаний з 17 75562 18 неефективним використанням зерна чи борошна у формі синапоїлглюкози завдяки дії ферменту одношлунковими тваринами. Отже, рослинні УДФ-глюкози-синапоїлтрансферази (УГСТ). феноли, особливо фенольні попередники лігніну, Синапоїлглюкоза є субстратом для можуть розглядатися як нехарчові фактори для синапоїлглюкози : синапоїлхолінтрансферази корму тварин. Скорочення або належна зміна (СХТ), що призводить до утворення рівня рослинних фенолів, зокрема фенолів, що синапоїлхолину або синапіну. Останні два етапи використовуються у формуванні лігніну, може розповсюджені у хрестоцвітих; у Brassicas створити корм вищого ґатунку. синапін, накопичений у насінні, представляє Рослинні феноли також причетні до головну неполімерну фенольну сполуку, формування різноманітних сполук, деякі з яких є знайдену в стиглому насінні. Узагальнений також нехарчовими за своєю природою. процес фенілпропаноїдного метаболізму Винахід пропонує засіб зменшення рівня показано на Фіг.2. Слід зазначити, що у деяких окремих фенольних сполук, які вважаються видів рослин додаткові ферменти можуть бути нехарчовими, в рослинних клітинах, насінні або частиною фенілпропаноїдного шляху. борошні, що використовується для корму. Синапін або синапоїлхолін — це найбільш Зокрема, у цьому винаході передбачається поширена фенольна сполука в насінні зменшення рівня гіркої нехарчової сполуки хрестоцвітих; у В. napus він може складати до 4% синапіну (або синапоїлхоліну) у рослинних борошна [Blair and Reichert, 1984., J. Sci. Food клітинах, які її синтезують. Також синапін, як Agric. 35:29]. Синтез синапіну відбувається у вважається, об'єднується з білком у кормі, недостиглому насінні, яке зовні виглядає ще зменшуючи придатність білка для засвоєння й світло-зеленим, і, як вважається, не зазнає використання твариною. Гіркий смак може також деградації під час вистигання [Vogt et. al., 1993., впливати на рівень споживання. Крім того, при Arch. Biochem. Biophys. 300: 622.]. годуванні деяких порід курей, що несуть яйця з Проростання насіння (тобто, схожість коричневою шкаралупою, синапін викликає насіння) зменшує рівень синапіну за рахунок дії неприпустимий рибний запах у яєць. Кількість естерази, яка розкладає його на синапінову синапіну в кормі у цих випадках повинно кислоту та холін. Було припущено, але не утримуватись нижче 10% і це обмежує доведено, що розкладення синапіну може використання корму, що містить синапін. Отже, надавати холін для синтезу фосфоліпіду скорочення синапіну у зерні або борошні з нього протягом проростання насіння [Strack et.al., у хрестоцвітих є важливою економічною задачею. 1981., Ζ. Naturforsch. 36c: 215]. Проте, оскільки Утворення синапіну відбувається як більшість нехрестоцвітих рослин не містить збільшення фенілпропаноїдного шляху. Шлях, синапіну в своєму насінні, малоймовірно, що визначений у цьому винаході, містить біохімічні синапін є основною сполукою для проростання шляхи, що приводять до утворення синапінової насіння чи схожості насіння взагалі. кислоти, а також біохімічні процеси, що У Arabidopsis thaliana були виділені мутанти з відгалужуються від різних етапів, такі як бічні дефектним загальним фенілпропаноїдним шляхи, що приводять до формування мономерів шляхом [Chappie et. al., 1992., The Plant Cell 4: лігніну та інших біохімічних речовин, похідних від 1413-1424]. Ці мутанти являють собою чудовий продуктів фенілпропаноїдного шляху. матеріал для фізіологічних, біохімічних і У фенілпропаноїдному шляху L-фенілаланін генетичних досліджень, хоча не мають ніякої — ароматична амінокислота, є субстратом агрономічної цінності через негативні наслідки ферменту фенілаланінамонійліази (ФАЛ). мутації, що включають підвищену чутливість до Ферментативна активність ФАЛ приводить до ультрафіолетового випромінювання через прояв утворення коричної кислоти, яка є субстратом мутантного фенотипу у всій рослині, особливо в цинамат-4-гідроксилази (Ц4Г). Продукт Ц4Г — це листі. Ці мутанти, що позначаються SIN1 п-кумарова кислота, що є попередником багатьох (мутанти біосинтезу синапоїлмалату), блокують флаваноїдних сполук, причому деякі з них також синтез ефірів синапінової кислоти, зменшуючи можуть утворюватися з L-тирозину завдяки дії рівень синапіну (складного ефіру синапоїлхоліну) ферменту тирозинамонійліази (ТАЛ). Кумарова та змінюючи склад мономерів лігніну рослини. кислота може також бути попередником Зміна рівня лігніну може призвести до появи біосинтезу лігніну. Фермент п-кумарат-3рослини з унікальним складом лігніну і, отже, гідроксилаза (КЗГ) діє на п-кумарову кислоту та зміненим волокном. утворює кофеїнову кислоту. Кофеїнова кислота Chappie et al. розглядають можливість перетворюється кофеат/5-гідроксиферулат-Овикористання мутантів типу SIN1 для зменшення метилтрансферазою (ОМТ) на ферулову кислоту. рівня лігніну або зміни рівня лігніну у важливих Ферулова кислота — це один з трьох відомих видах насіння хрестоцвітих, таких як насіння основних фенольних мономерів, що беруть рапсу, але не визначають напрямку, у якому це участь у біосинтезі лігніну. Ферулова кислота можна здійснити. Також вказується, що також може бути субстратом ферменту ферулатскорочення синапіну в насінні рапсу є важливою 5-гідроксилази (Ф5Г), що утворює 5метою, але не визначається спосіб, як це можна гідроксиферулову кислоту, яка, у свою чергу, зробити, використовуючи мутацію SIN1. З огляду може бути перетворена ферментом ОМТ на на очевидну чутливість мутанта SIN1 до синапінову кислоту. Синапінова кислота — це ультрафіолету, мутація не має великого значення другий головний фенольний мономер лігніну. для застосування у сільськогосподарських Синапінова кислота також може бути кон'югована умовах. Однак хоча способи зниження вмісту 19 75562 20 синапінового компоненту у насінні не описані у культур впливає кількість волокна, тому що існуючому рівні техніки, мутація SIN1 дає перехресно зшиті лігніни стійкі до розкладення та важливий науковий доказ того, що синапін не є фізично з'єднують між собою компоненти основним компонентом росту та розвитку клітинної стінки. рослини, і що насіння зі зменшеним рівнем З вищесказаного очевидно випливає, що синапіну здатне до проростання й розвитку. будь-які спроби поліпшити зерновий корм за Проте, мутація SIN1 не забезпечує способу рахунок зменшення рівня або виключення зменшення рівня синапіну у синапіну та зміни загального рівня фенолів сільськогосподарському виробництві зерна повинні бути спрямовані на насіння, що хрестоцвітих без супроводжуючої шкідливої проростає. Щоб змінити біохімічний процес чутливості до ультрафіолету. синтезу синапіну саме у насінні, найбільш На додаток до нехарчових фенольних придатним є молекулярний генетичний підхід, сполук, таких як синапін, у формуванні лігніну беручи до уваги нестачу ендосперму, що приймають участь багато продуктів природно забезпечує низький рівень синапіну. фенілпропаноїдного шляху. Біосинтез лігніну є В одному втіленні у представленому винаході складовою частиною загального описується спосіб, що змінює рівень фенольних фенілпропаноїдного шляху, у якому утворюється сполук у насінні і, також, змінює рівень принаймні три основ ні фенольні попередники — синапінової кислоти і пов'язаних з нею кумарова, ферулова та синапінова кислоти, фенольних сполук. Спосіб базується на введенні продукти яких полімеризуються в лігнін та інші нових ферментів, що впливають на доступність фенольні сполуки. сполук, які використовуються як попередники, і Біохімія формування лігнінів з цих субстратів для ферментів у фенілпропаноїдному попередників є складною; існує безліч інших шляху. Вичерпання або зміна достатньої кількості ферментів, що беруть участь у цьому процесі, цих сполук викликає біохімічну зміну нормального наприклад, О-метилтрансфераза кофеїнової процесу та утворення іншої кількості різних кислоти/5-гідроксиферулової кислоти (КОМТ), фенілпропаноїдних продуктів. кофеоїл-КоА-редуктаза (ККоАОМТ), Прикладом застосування способу є новий дегідрогеназа цинамілового спирту (ДНЦ), фермент, холіноксидаза (ХО), що цинамоїл-КоА-редуктаза (ЦКР), пероксидаза, 4використовується для зменшення кількості холіну кумарат:КоА-лігаза (4КЛ) та специфічна до в рослинній клітині, особливо в насінні. Холін використовується, зокрема, для одержання коніферину -глюкуронідаза (КБГ). Можуть бути синапіну з синапоїлглюкози. Зменшення кількості задіяні інші ферменти, та біохімія формування холіну спричиняє зміну рівня попередників лігніну у повному обсязі ще не є цілком синапіну (холіну й синапоїлглюкози) і тому змінює зрозумілою. склад попередників, утворених на попередніх Лігнін — це складний полімер, головним ферментативних етапах фенілпропаноїдного чином складений з елементів мономерних шляху, включаючи синапінову кислоту. Результат фенольних сполук у різних пропорціях і з різними — насіння з дуже зменшеним рівнем синапіну й типами зв'язків у різних типах клітин та у різних зміненим фенольним вмістом. Відомо, що при видів рослин. Лігніни є необхідними окиснюванні холіну холіноксидазою утворюється компонентами стінки рослинної клітини, у якій перекис водню. Утворення перекису водню в тканини зазнають механічного навантаження або рослинних клітинах вважається корисним, і тому беруть участь у переносі води. Крім того, лігніни, виникає додаткова перевага дії холіноксидаз на як вважається, причетні до механізмів опору рослини. Як ілюстрація додаткового аспекту патогенам. У дводольних звичайно зустрічається способу, другий фермент, бетаїнгваяцил-сирингіллігнін, складений як з елементів альдегіддегідрогеназа (БАДГ), використовується гваяцилу, похідних ферулової кислоти, так і з для збільшення перетворення продукту залишків сирингілу, похідних синапінової кислоти. холіноксидази, бетаїнальдегіду, на гліцинбетаїн, Таким чином, для формування лігніну довільного який використовується як засіб захисту від типу потрібні як синапінова, так і ферулова стресу. Складний бетаїн є корисним як сполука кислоти. Здатність до розкладу або переробки для різного застосування у харчовій деревини, наприклад при варінні целюлози, як промисловості і як добавка для посилення росту вважається, у значній мірі залежить від складу рослин. мономерів лігніну, який базується насамперед на Таким чином, корисний ефект зміни доступності окремих мономерів лігніну. фенольного рівня в рослинних клітинах і, Припускається, що присутність групи 5-О-метилу зокрема, зменшення рівня синапіну є очевидним, в синапоїлпохідних сирингіллігнінах зменшує завдяки зменшенню єдиного попередника у перехресне зшивання, що робить лігнін, фенілпропаноїдному шляху. Фахівцеві ясно, що у складений насамперед з сирингілових елементів, межах способу для зміни різноманітних інших більш легким для переробки, ніж лігнін, кінцевих продуктів у фенілпропаноїдному шляху складений головним чином з гваяцилових можуть бути використані інші ферменти. елементів, похідних від ферулової кислоти. Інший приклад у межах представленого Таким чином, способи збільшення рівня винаходу — використання нового ферменту для сирингіллігніну можуть призвести до створення розкладення ферулової кислоти, що також більш легко перетравлюваного корму внаслідок утворюється у фенілпропаноїдному шляху. зменшення перехресного зшивання лігніну. Серед трьох головних мономерів лігніну На перетравлення зернових фуражних 21 75562 22 ферулова кислота, як вважається, забезпечує спиртів, таких як стахіоза та рафіноза. Особливо механічну твердість та міцність стінок клітини корисним для застосування у кормі є насіння зі завдяки перехресно зшитим ланцюгам пентози, зміненим рівнем фітату. арабіноксиланам та геміцелюлозам, роблячи Фітат є важливим компонентом багатьох клітинні стінки більш твердими та менш видів насіння, типово складає 2—4% маси чутливими до ферментативного розщеплення. насіння, але може у деяких видів сягати рівня Таким чином, як компонент лігніну, ферулова 10%. Високий рівень фітату в кормовому раціоні кислота відіграє важливу роль у механічній пов'язаний з втратою апетиту, зменшеним міцності тканин рослини. Зменшення рівня розміром приплоду та іншими негативними ферулової кислоти у відповідний спосіб може факторами. Ці ефекти, можливо, виникають призвести до багатьох корисних наслідків. через здатність фітату зв'язувати цинк. Ферулова кислота синтезується у межах Комплекси фітинової кислоти з іншими загального фенілпропаноїдного шляху, як компонентами насіння взагалі позначаються як описано вище, і служить попередником для фітин. Високий рівень фітину також пов'язаний з різних продуктів процесу [див. JPN Rosazza et. негативними ефектами. al., Journal of Industrial Microbiology 15: 457-471, Окрім шкідливого впливу на ефективність 1995]; [R. Whetten and R. Sederoff, Plant Cell 7: корму, присутність фітинової кислоти в 1001-1013, 1995]; [RA Dixon and NL Paiva, 1995, кормовому раціоні також викликає велику Plant Cell 7: 1085-1097, 1995]. кількість небажаних наслідків у довкіллі. У Представлений спосіб забезпечує засіб зміни моношлункових тварин фосфор, зв'язаний з рівня ферулової кислоти і за рахунок цієї зміни фітиновою кислотою, взагалі недоступний, тому вироблення різних інших сполук у до раціону треба додавати фосфор, що фенілпропаноїдному шляху, зокрема синапіну. У спричиняє додаткові витрати. Фосфор, зв'язаний одному аспекті представленого винаходу з фітиновою кислотою, виділяється описується спосіб, завдяки якому змінюється моношлунковими тваринами, та наступне рівень ферулової кислоти в рослинних клітинах. розкладення фекалій мікроорганізмами Спосіб базується на сторонніх ферментах, що призводить до потрапляння в навколишнє розкладають ферулову кислоту. Деякі ферменти середовище фосфору, що міститься в фітиновій також можуть виробляти сполуки, що кислоті. Високий рівень фітинової кислоти в застосовуються економічно. Наприклад, багатьох зернових кормах спричиняє значну використовується фермент декарбоксилаза кількість фосфору, що виділяється. Тривале ферулової кислоти, що виробляє сполуку збільшення поголів'я худоби часто викликало вінілгваякол, яка може використовуватися як заростання водойм та інші проблеми промислова сировина та може накопичуватися в навколишнього середовища, пов'язані з рослинних клітинах без шкідливого ефекту. фосфорним забрудненням. Як очікується, ці Вичерпання або зміна достатньої кількості проблеми будуть ставати значнішими й можуть ферулової кислоти викликає біохімічну зміну стати головним обмеженням для збільшення нормального фенілпропаноїдного шляху та поголів'я худоби в майбутньому. Таким чином, утворення іншої кількості різних способи зменшення рівня виділення фітинової фенілпропаноїдних продуктів. кислоти суттєво вплинуть на вирішення проблем Спосіб згідно з винаходом не обмежується навколишнього середовища. фенілпропаноїдним процесом. Як приклад Хоча фактичні витрати, пов'язані з застосування цього винаходу наводиться додаванням фосфору до раціону, не складають модифікація вторинного метаболічного шляху, в істотної частини витрат на корми, наслідки для якому утворюються цукрові спирти. довкілля внаслідок забруднення фосфором, що (Б) Вторинний метаболічний шлях цукрових виділяється, викликають значні додаткові спиртів витрати, яких можна було б уникнути завдяки Цей винахід також пропонує способи та виробництву борошна з низьким рівнем фітату. композиції ДНК для зміни рівня цукрових спиртів У жуйних тварин присутність мікробної фауни в рослинних клітинах. В результаті застосування в рубці може викликати вивільнення фосфору, способу згідно з цим винаходом у рослинних що міститься у фітиновій кислоті, і тому фосфор клітинах змінюється рівень сполук, похідних від стає більш доступним. У результаті кількість цукрових спиртів, наприклад фітинової кислоти, доданого фосфору в раціоні значно зменшується стахіози, рафінози, цукрозилглікозидів, уронідів в порівнянні з моношлунковими тваринами. та пентоз, фосфоїнозитидів та Проте, кількість фітинової кислоти в більшості глікофосфокерамідів. У результаті, в деяких насіння рослин перевищує фактично необхідну, реалізаціях винаходу одержують насіння зі тому навіть у жуйних тварин фосфорне зменшеним рівнем фітинової кислоти. У винаході забруднення є головною проблемою. також пропонується насіння зі зменшеним рівнем Досі основні способи зменшення фітату були фітинової кислоти, придатне для застосування у в значній мірі спрямовані на розкладення фітату кормі, насіння зі зменшеним рівнем фітинової дією ферментів фітаз, які входять до складу кислоти, придатне для виготовлення корму. Хоча цей спосіб приводить до більшої модифікованого борошна та рослинні клітини зі доступності фосфору, він непридатний для зміненим механізмом інозитового метаболізму. виробництва зерна чи корму зі зменшеним рівнем Також цим способом змінюється рівень інших фітинової кислоти, а тільки для корму, в якому сполук, похідних від метаболізму цукрових фосфор, що міститься в фітиновій кислоті, 23 75562 24 взагалі є більш доступним. Таким чином, спосіб з засіб, який дозволив би керувати виробленням використанням ферменту фітази знаходить фітату протягом проростання насіння, міг би бути застосування тільки для надання фосфору у корисним та дозволив вирішити проблеми, фітиновій кислоті більшої доступності. пов'язані з фосфорним забрудненням та Діяльність фітази звичайно спостерігається у нехарчовими ефектами фітинової кислоти. Крім таких мікроорганізмів, як плісень (Aspergillis), того, був би особливо корисним генетичний бактерії (Bacillus, Pseudomonas) та дріжджі механізм, який можна було б застосовувати у (Saccharomyces). Видалення фітатів цими широкому діапазоні видів рослин. Представлений рослинними матеріалами за допомогою сумішей винахід надає такі рішення. ферментів, що містять мікробну фітазу, Для оцінки можливостей представленого описується наприклад, в патенті США №5554399. винаходу потрібне розуміння біохімічного Більшість мікроорганізмів синтезує велику механізму, відповідального за формування кількість різновидів фітази, що можуть включати фітинової кислоти. Хоча біосинтез фітинової саму фітазу разом з усілякими фосфатазами, що кислоти цілком не з'ясований, відома велика далі розкладають фітинову кислоту. Повне кількість ключових етапів. Фітинова кислота є вивільнення доступного фосфору з фітинової гексафосфатною похідною міоінозиту; біохімічний кислоти може залежати від ряду різних дій процес, що синтезує фітинову кислоту, ферментів. використовує міоінозит — цукровий спирт, Також описується альтернативний варіант винятково як початковий субстрат. Ця сполука перетворення рослин для вироблення мікробної (міоінозит, що також звичайно позначається як фітази. У патенті США №5593963 описується дія інозит) є також ключовою у виробленні інших фітази у трансгенних рослинах під контролем похідних та епімерів міоінозиту. Деякі з цих регулюючих послідовностей, які здатні похідних, наприклад глікозиди сахарози, також є спрямовувати експресію ферменту або постійно, нехарчовими сполуками, тому зменшення їхнього або специфічно до етапу процесу чи тканинорівня також є бажаним. специфічно. Можуть бути створені рослинні Міоінозит являє собою цукровий спирт, що клітини або, конкретніше, клітини насіння рослин, зустрічається скрізь у рослинних клітинах. Однак які містять фермент фітазу, що може вивільнити простий захист кожної з гідроксильних груп частину фосфору, який міститься в фітиновій міоінозиту робить його непридатним для кислоті. біосинтезу фітинової кислоти та інших процесів. Однак, просте вивільнення фосфору з Захист міоінозиту можна здійснити in vivo шляхом фітинової кислоти не повністю вирішує проблему метилування окремих місць різними метилскорочення відходів фосфору й потенційних трансферазами. Наприклад, міоінозит нехарчових ефектів фітинової кислоти. Більш перетворюється на ононітол шляхом важлива присутність комплексної фітинової монометилування у положенні 6. Метилування у кислоти або фітату не зменшується. У літературі положенні 5 утворює секвоїтол, що відомі засоби вивільнення фосфору з фітинової епимеризується у пінітол. Пінітол не може кислоти, але не існує засобу керування рівнем використовуватися для біосинтезу фітинової фітинової кислоти, що виробляється. кислоти. Метильовані похідні міоінозиту, як Будь-який засіб, за допомогою якого можна відомо, надають рослині корисних властивостей, було б зручно керувати рівнем фітинової кислоти, як наприклад, стійкість до стресів, та беруть був би дуже корисним при виробництві кормів. участь у перенесенні розчинів та стабілізації Наприклад, насіння рослин із зменшеним рівнем білків мембрани. Таким чином, модифікація фітинової кислоти дало б можливість створити інозиту за допомогою неспецифічних корм з більшою засвоюваністю мінералів. ферментативних дій, звичайно не пов'язаних з Насіння зі зменшеним рівнем фітинової кислоти метаболізмом цукрових спиртів, розглядається в також дало б зерновий корм зі зменшеним рівнем межах цього винаходу. фітину, що завдяки цьому був би більш поживним Біохімія формування фітату ще не цілком та легкотравним через зниження рівня комплексів зрозуміла, але відомі принаймні два потенційних фітинової кислоти. процеси формування, та, скоріш за все, існує Окрім борошна з підвищеною цінністю, велика кількість різних ферментів, що беруть борошно зі зменшеним рівнем фітинової кислоти участь у біосинтезі фітинової кислоти. Фітат спричинили б зменшення потрапляння фосфору знайдено у більшості рослинних тканин, однак він у навколишнє середовище й менше забруднення. особливо поширений в насінні й пилку, що грає Хоча засоби вивільнення фосфору з фітинової передбачену роль у збереженні фосфору. Тому кислоти можуть знизити рівень доданого й важко винайти засіб для зміни біосинтезу фітату виділеного фосфору, фактичний рівень фітинової звичайним шляхом, зокрема з тої причини, що кислоти та, отже, потенційно доступного біохімія його формування ще не з'ясована. фосфору перевищують потреби фосфору в їжі Для мінімізації вироблення фітинової кислоти для більшості тварин. у цьому винаході описуються способи й Таким чином, способи керування рівнем композиції ДНК, що кодують фермент(и), які фітинової кислоти знайдуть використання у модифікують міоінозит, запобігаючи його застосуванні кормів і, крім того, дозволять використанню у біосинтезі фітинової кислоти. У створити нове та корисне борошно і харчові цьому винаході передбачається використання композиції. стороннього гена метилтрансферази для З урахуванням цих обставин очевидно, що вибіркового метилування міоінозиту в насінні, 25 75562 26 зокрема в тканинах насіння, відповідальних за притаманних рослинним клітинам, як засіб біосинтез фітинової кислоти (під стороннім надання рослинним клітинам стійкості до солі. розуміється фермент, звичайно не пов'язаний з Проте патент США №5563324 не містить біосинтезом фітату в цій рослинній клітині). У ніяких пропозицій щодо використання гена, винаході використовують сторонній фермент, здатного до модифікації міоінозиту, щоб отриманий від галофітної рослини, який не запобігти його використанню як попередника для знайдено в звичайних сільськогосподарських інших сполук, що включають його власні похідні. рослинах, таких як зернові, соя, бавовник, Однак патент США №5563324 ясно показує, що люцерна, пшениця, ячмінь, жито, сорго, модифікація міоінозиту не призводить до будьсоняшник, олійні культури Brassica та інші яких негативних ефектів для рослини, і тому традиційно вирощувані культури. маніпуляції з рівнем міоінозиту, як очікується, не Вироблення метилового інозиту з міоінозиту призведуть до шкідливих ефектів. також становить додаткову вигоду утворення Відповідно, можливість модифікації нешкідливої сполуки без шкідливого ефекту для міоінозиту геном метил-трансферази, ймовірно, рослинної клітини. Таким чином, завдяки не буде шкідливою для рослинних клітин та зменшенню кількості доступного міоінозиту метильований продукт цієї ферментативної зменшується вироблення фітинової кислоти. реакції, як відомо, не є шкідливим для рослинних Фітат - один з головних нехарчових факторів клітин. у зерновому кормі. До нехарчових ефектів Проте міоінозит є ключовим у багатьох різних фітинової кислоти відносяться зв'язування аспектах росту та розвитку рослини. На додаток мінералів, утворення комплексних сполук з до його ролі попередника для біосинтезу білком та інші негативні ефекти, зокрема фітинової кислоти, міоінозит також пов'язані з викидом надлишку фосфору у формі використовується для біосинтезу пентози та фітинової кислоти, яка перетворюється у уронідів, він також присутній у фосфоїнозитидах навколишньому середовищі, викликаючи мембран рослинних клітин, а також в інших фосфорне забруднення. Таким чином, способи складних ліпідах рослин, включаючи зменшення рівня фітинової кислоти в рослинних глікофосфокераміди. Крім того, він також є клітинах знаходять застосування для кормів. В попередником інших природних ізомерів інозиту, аквакультурі високий рівень фітинової кислоти причому багато з них, а також міоінозит, також становить головну проблему при розповсюджені як метилові ефіри специфічним використанні білка рослинного походження як для виду способом в усьому рослинному світі. заміни борошна для риб. Тому способи Роль міоінозиту в загальному обміні речовин зменшення рівня фітинової кислоти у рослинних у рослин є значною, та модифікація рівня клітинах, особливо в клітинах тканин, що міоінозиту може мати непередбачені наслідки, використовуються для корму, є корисними та особливо в агрономічних умовах. Хоча в патенті можуть знайти широке застосування. Способи США №5563324 описується конститутивна дія зменшення рівня фітинової кислоти у насінні у гена метил-трансферази, він не дає ніяких широкому діапазоні видів рослини, що доказів, що отримані в результаті рослини будуть використовуються для корму, особливо корисні корисними. У патенті США №5563324 зазначено: для кормової промисловості. "Навіть якщо нововставлені гени не спричинять Рослинний ген, що кодує міоінозит-О-метилбільшої ефективності рослини в трансферазу (ІМТ), був виділений з сільськогосподарських умовах, трансгенні Mesembryanthemum crystallinum (кришталевої рослини, що містять такі гени, будуть трави) і було показано, що цей фермент застосовуватися для дослідження того, як зміни перетворює міоінозит на пінітол у гетерологічних внутрішніх процесів у рослині (наприклад, трансгенних рослинах [Патент США № 5 563 осморегуляція) впливатимуть на врожайність 324]. Цей рослинний ген був підданий контролю рослин." (стовпець 2, рядки 60-65). Отже, в конститутивного промотору з метою підвищення патенті США №5563324 не передбачається стійкості до стресів у рослин шляхом надмірного керування рівнем міоінозиту для зменшення вироблення метильованої похідної міоінозиту, рівня фітинової кислоти та не очікується ононітолу, що згодом може епімеризуватися у безумовно, що результатом описаних в ньому пінітол. У цьому винаході рослинний ген досліджень будуть рослини з корисними піддається контролю селективного до насіння агрономічними характеристиками. Також в промотору для зміни метаболізму інозиту в патенті США №5563324 описується дія гена, насінні. модифікуючого міоінозит у всій рослині, з метою Вироблення пінітолу, описане в патенті США підвищення стійкості до стресів або для №5563324, як було показано, збільшувало подальших наукових досліджень. стійкість до солі при конститутивній дії на Таким чином, можна з впевненістю трансгенний тютюн. Подібно до цього, зазначити, що в представленому винаході конститутивна дія бактеріальної 1-Р дегідрази пропонується зовсім новий підхід до зменшення манітолу на рослинну клітину викликає утворення рівня фітинової кислоти. Використання гена манітолу, цукрового спирту, або поліолу, та надає метил-трансферази є специфічним для клітині стійкості до солі. Отже, в патенті США зменшення рівня фітинової кислоти. №5563324 описується вироблення цукрових Представлений винахід не стосується вже спиртів за допомогою ферменту, здатного до відомих способів, таких як дія ферментів фітази, утворення цукрових спиртів з цукрів, які не вирішують проблему надлишку фітинової 27 75562 28 кислоти в насінні та/або зерновому борошні. У насіння промотор, щоб гарантувати, що ході виконаної роботи було встановлено, що агрономічна ефективність рослини не ставиться рівнем фітинової кислоти можна керувати, під загрозу та отримана в результаті рослина змінюючи рівень міоінозиту, доступного для буде нормальною з будь-якого погляду, за біосинтезу фітинової кислоти. Було виявлено, що винятком зменшеного рівня фітату в насінні. дія гена метил-трансферази на тканину насіння Тому, на відміну від патенту США №5563324, призводить до зменшення рівня фітинової представлений винахід не передбачає отримання кислоти в насінні без будь-яких помітних змін в ані рослин з підвищеною стійкістю до стресів, ані інших характеристиках рослини. Очевидно, що рослин для дослідних цілей. обмеження вираження дії гена метилОписаний спосіб пропонує багато переваг трансферази на тканини насіння, відповідальні за над відомими способами, пов'язаними зі біосинтез фітату, значно зменшує рівень зменшенням рівня фітинової кислоти завдяки дії фітинової кислоти в стиглому насінні без будьферментів фітази. До цього відносяться рослини яких додаткових впливів на рослину, навіть зі зміненим рівнем фітинової кислоти в окремих вирощену в екстремальних польових умовах. тканинах, рослина з насінням зі зменшеним Використання селективного до тканини рівнем фітинової кислоти та зерновий корм зі промотору пропонує багато переваг щодо зменшеним рівнем фітинової кислоти. Переваги відомих способів, включаючи обмеження дії таких рослин, насіння та борошна включають ферменту на тканину насіння при збереженні краще використання корму та харчову метаболізму міоінозиту в інших тканинах. ефективність, виготовлення борошна та корму зі Мета представленого винаходу полягає в зниженим рівнем фосфору і, отже, кращі тому, щоб запобігти використанню міоінозиту як екологічними показниками, та здатність до вихідного матеріалу для біосинтезу фітинової використання в кормовій промисловості, що кислоти шляхом переведення його до раніше було обмежено кількістю нехарчової метаболічного процесу, у якому він фітинової кислоти в борошні чи кормі. перстворюється на нешкідливі для рослини Описаний спосіб є корисним для багатьох сполуки. Цей спосіб базується на нових діях видів рослин, включаючи однодольні та ферментів, включаючи, в одному втіленні, ген дводольні рослини, а також як зернові, так і олійні метил-трансферази, який вичерпує чи змінює культури. Особливу застосовуваність він являє кількість міоінозиту, що використовується для для олійного насіння та хрестоцвітих рослин. вироблення фітинової кислоти. Вичерпання або Результатом цієї генетичної модифікації є зміна рівня цього попередника викликає рослинні клітини зі зміненим метаболізмом біохімічну зміну нормального процесу біосинтезу цукрових спиртів, зокрема метаболізмом інозиту, фітинової кислоти та зменшення кількості та рослинні клітини зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, що утворюється. фітинової кислоти, зокрема насіння зі зменшеним Біохімічна основа цього винаходу виходить з рівнем фітату. Таким чином, спосіб згідно з даним концепції регулювання активності ферменту винаходом пропонує корисний засіб зміни завдяки доступності субстратів. Взагалі, на вторинного метаболізму стосовно цукрових ефективність ферментів впливає доступність спиртів. субстратів. Інакше кажучи, фермент виробляє Хоча втілення цього винаходу, що заподіює продукт у кількості, пропорційній до кількості зміну метаболізму цукрових спиртів, наприклад, доступного субстрату. Зменшення концентрації рослинні клітини зі зменшеним рівнем фітинової субстрату викликає менший темп утворення кислоти, продемонстровано на рослинних продукту. клітинах рапсу, зернові рослини також мають Таким чином, в представленому винаході високу концентрацію фітинової кислоти і використовується перевага цього підходу шляхом зменшення рівня фітинової кислоти в клітинах застосування нового ферменту, метилзерна може бути досягнуто подібним шляхом. трансферази, який вичерпує доступність інозиту У представленому винаході пропонуються субстрату, що використовується для формування способи, генетичні конструкції та вектори, що фітинової кислоти. Будь-які ферменти, здатні застосовуються для модифікації рівня фітату в впливати на кількість міоінозиту в насінні рослин, рослинних клітинах та насінні, особливо для можуть використовуватися в рамках зменшення рівня фітату в рослинних клітинах. представленого винаходу. Спосіб базується на дії Винахід також пропонує способи і композиції ферменту, що в будь-якій кількості випадків ДНК, що застосовуються для зменшення рівня змінює рівень міоінозиту, використовуваного для фітату в насінні рослини. Крім того, винахід біосинтезу фітинової кислоти. стосується модифікованого борошна з насіння та На відміну від патенту США №5563324, корму для тварин, що містить модифіковане представлений винахід передбачає модифікацію борошно, особливо борошно зі зменшеним вироблення фітату у насінно-селективний спосіб рівнем фітату. шляхом дії гена, здатного до модифікації Зменшення рівня фітинової кислоти міоінозиту, роблячи його непридатним для здійснюється з використанням недавно описаних вироблення фітинової кислоти. Дивно, але навіть методів і сумішей ДНК. Спосіб включає розробку некерована дія гена, що змінює міоінозит, "метаболічного обхідного шляху" або нового викликає зменшення рівня фітату в насінні. Проте біохімічного процесу, здатного до відведення в найбільш прийнятній реалізації представленого попередника в процесі біосинтезу фітинової винаходу використовується селективний до кислоти до нового та нововведеного "тупикового 29 75562 30 шляху", який зменшує вироблення фітинової сукупності доступних субстратів для біосинтезу кислоти. У результаті однієї реалізації цього фітинової кислоти. способу "тупиковий шлях" виробляє сполуки, які, Як приклад представленого винаходу як відомо, нешкідливі для цієї рослинної клітини. застосовується ген, що кодує метил-трансферазу Таким чином, можна з впевненістю зазначити, що міоінозиту. Цей фермент, під контролем обхідний процес перетворення сполукпромотору, селективного до дії в клітинах насіння попередників міоінозиту в ці сполуки не є рослини, здатен до вичерпання кількості загрозою життєдіяльності рослини. міоінозиту, доступного для вироблення фітату в Згідно з іншою реалізацією винаходу цьому насінні. В іншому аспекті представленого пропонуються вектори та конструкції винаходу, ця метил-трансфераза здатна до рекомбінантних ДНК для створення рослинного перетворення міоінозиту на нешкідливу насіння зі зміненим рівнем фітинової кислоти, речовину. зокрема рослинного насіння зі зменшеним рівнем Отже, взагалі рослинні клітини, створені фітинової кислоти. Крім того, в іншому втіленні способом згідно з представленим винаходом, винаходу пропонується рослинне насіння, зберігають незмінний основний метаболізм та корисне для виробництва зернового борошна зі мають фенотипи, що не відрізняються від зменшеним рівнем фітату. Це борошно містить немодифікованих рослин, за винятком зміни зменшений рівень фітату і, отже, є корисним для продукту чи продуктів в окремому процесі застосування для тварин, особливо для тих вторинного метаболізму. галузей, де рівень фітинової кислоти пов'язаний з Щоб гарантувати, що основний метаболізм забрудненням довкілля або визначений як залишається незмінним, у цьому винаході нехарчовий фактор. У винаході також описується спосіб, специфічно для тканини пропонується модифіковане борошно, отримане спрямований на формування вторинного з генетично зміненого насіння, що може метаболіту шляхом зміни доступності субстрату, використовуватися в різних тваринних раціонах, у специфічного для вторинного метаболічного тому числі для свійської птиці, свиней, рогатої процесу та важливого для утворення кінцевого худоби та риби. продукту цього процесу, зокрема субстратів у Спосіб включає додання нового ферменту, одному-п'яти біохімічних етапах формування який може змінювати рівень міоінозиту в насінні і кінцевого продукту. Завдяки цьому досягається може безпосередньо застосовуватися для всіх зменшення кількості окремих продуктів у процесі видів та різновидів рослин. Один і той самий ген вторинного метаболізму. може використовуватися для будь-якого виду В контексті представленого винаходу до рослини, тому що зміна міоінозиту сполук, що використовуються як попередники відбуватиметься в однаковий спосіб у будь-якій продуктів вторинного процесу рослині. Спосіб не базується на використанні фенілпропаноїдного метаболізму, відносяться, технологій супресії гена, які залежать від але не обмежені ними, корична кислота, ппослідовності ДНК і тому вимагають конкретно кумарова кислота, кофеїнова кислота, ферулова пристосованих генів для кожного окремого гена кислота, 5-гідроксиферулова кислота, синапінова чи виду рослини. Таким чином застосування кислота, холін, різні сполуки синапоїлу, що представленого винаходу для всіх культур є включають, але не обмежені ними, синапоїлочевидним. У рамках способу можуть глюкозу та синапоїл-малат, а також холін використовуватися численні придатні ферменти синапоїлу. У контексті представленого винаходу мікробного, рослинного чи тваринного до продуктів фенілпропаноїдного шляху походження. В різноманітних видах рослин відносяться, але не обмежені ними, флавоноїди, можуть використовуватися одні і ті самі генетичні лігніни, різні мономерні та полімеризовані конструкції. фенольні сполуки і синапін. Шляхом вибору Таким чином, беручи до уваги широкий специфічного ферменту можна досягти будь-якої аспект представленого винаходу, в ньому кількості змін рівня продуктів в пропонується спосіб зменшення рівня фітату в фенілпропаноїдному шляху. Ферменти, що насінні рослин, що складається з побудови використовуються для модифікації сполуквектора перетворення рослини, який, на додаток попередників, можуть мати мікробне, тваринне до маркера з можливістю перемикання, що або рослинне походження. Ферменти можуть дозволяє ідентифікувати рослинні клітини, бути природними або отриманими за допомогою перетворені цим вектором, містить фермент, мутації відомих ферментів, щоб змінити їхню здатний до метаболізації міоінозиту, що робить специфічну дію на субстрат, а отже, створити його непридатним для утворення фітинової новий фермент. кислоти. Ферменти, що використовують в У контексті представленого винаходу, представленому винаході, можуть бути здатні до метаболізація інозиту включає гідроксилювання, модифікації сполук, що використовуються як ізомеризацію, метилування, розщеплення або попередники продуктів, які утворюються в будь-яку іншу біохімічну модифікацію, яка робить фенілпропаноїдному шляху, шляхом міоінозит нечутливим до впливу відповідних ізомеризації, сполучення, фосфорилування, ферментів, які звичайно діють на міоінозит з гідроксилювання, окиснення, дегідрогенізації, метою одержання фітинової кислоти. Отже, до метилування або будь-якої іншої подібної метаболізації відноситься будь-яка модифікація, біохімічної операції (включаючи зв'язування або що ефективно зменшує доступність міоінозиту з секвестрацію), або можуть включати ферменти, 31 75562 32 здатні до руйнування сполук, що можуть накопичуватися до високого рівня без використовуються як попередники у зміни властивостей рослинної клітини. Ферменти фенілпропаноїдному шляху, наприклад, можуть також утворювати речовини, що корисно гідролази, декарбоксилази, оксидази, естерази впливають на рослинну клітину, наприклад, або будь-які інші ферменти, здатні до виробляють з цих сполук-попередників продуктів розкладання коричної кислоти, п-кумарової вторинного метаболізму речовини, що кислоти, кофеїнової кислоти, ферулової кислоти, захищають від стресів. Використовувані 5-гідроксиферулової кислоти, синапінової ферменти можуть також утворювати речовини, кислоти, синапоїл-глюкози, синапоїл-малату або що застосовуються, наприклад, як промислова холіну (що використовується для утворення сировина, фармацевтичні чи лікувально-харчові синапіну з синапоїл-глюкози). В одному аспекті речовини. У рамках представленого винаходу способу використовуються ферменти, що можуть застосовуватися один або кілька виробляють речовини, що захищають від стресу, ферментів та кілька різних властивостей може зі сполук, що використовуються як попередники використовуватися для зменшення рівня окремих звичайних продуктів фенілпропаноїдного шляху. сполук-попередників продукту у процесі Подібно цьому, фермент для специфічного вторинного метаболізму. зменшення кількості додаткового субстрату, що Ферменти, що використовуються в контексті не виробляється як частина фенілпропаноїдного представленого винаходу, можуть бути отримані шляху, але потрібен для утворення продукту з багатьох джерел або багатьма методами. фенілпропаноїдного шляху, може Наприклад, можна ідентифікувати сполукувикористовуватися для зменшення рівня цього попередник продукту у процесі вторинного продукту. Відповідно, як сполуки, що метаболізму, на яку повинен бути спрямований використовуються як попередники у представлений винахід. Хімічна структура цих фенілпропаноїдному шляху, так і будь-яка інша сполук добре відома або може бути визначена, сполука, потрібна у фенілпропаноїдному шляху отже, можна проаналізувати літературу щодо для утворення продуктів, може розглядатися в ферментів, щоб визначити фермент з відомою рамках представленого способу. дією на хімічно подібних субстратах. Відповідно, В контексті представленого винаходу до можна ідентифікувати придатний фермент та сполук, що використовуються як попередники виділити ген і використати його в контексті продуктів вторинного процесу метаболізму представленого винаходу. Додатково для цукрових спиртів, відносяться, але не обмежені отримання синтетичного гену може ними, міоінозит, галактинол та УДФ-похідні використовуватися комбінаторна хімія або подібні цукрів. До продуктів метаболізму цукрових схеми, що відшукують штучні білки з бажаною спиртів, відносяться, але не обмежені ними, властивістю. Ферменти, що використовуються в фітинова кислота, стахіоза, рафіноза, цукрозилрамках представленого винаходу, можна змінити глікозиди, уроніди та пентози, фосфоїнозитиди та за допомогою загальноприйнятних в даній галузі глікофосфокераміди. У контексті представленого методів. винаходу ферменти, що використовуються для Як приклад модифікації ферменту, ген, що зміни сполук метаболізму цукрових спиртів, кодує фермент, здатний до дії на хімічно подібні можуть бути здатні до гідроксилювання, сполуки, які використовуються як попередники у ізомеризації, метилування, розщеплення або процесі вторинного метаболізму, можна будь-якої іншої біохімічної модифікації (такої як модифікувати та/або вибрати для підвищеної зв'язування або секвестрація), яка робить активності, використовуючи такі способи, як сайтцукровий спирт нечутливим до впливу специфічна модифікація, мутація та селекція відповідних ферментів, які звичайно діють на змінених особливостей у неспецифічних нього. У прикладі представленого винаходу в системах, наприклад бактеріальних чи грибних рамках вторинного процесу метаболізму клітинах. Це може включати експресію гена, що цукрових спиртів показано метилування інозиту, кодує цей змінений фермент у бактеріальних який є попередником фітинової кислоти, з метою клітинах, щоб зробити його нездатним зменшення доступності інозиту для біосинтезу перетворювати вищезазначені речовини, фітинової кислоти. селекцію бактерій, що виробляють цей фермент Таким чином, фахівцеві очевидно, що та здатні рости на вищезазначених сполуках, попередники кінцевого продукту в процесі використовуючи їх як єдине живильне вторинного метаболізму є тими біохімічними середовище або джерело вуглецю, та речовинами, що використовуються відновлення активності ферменту, здатного до дії безпосередньо для формування вторинного на окрему сполуку-попередник у процесі метаболіту, або тими біохімічними речовинами, вторинного метаболізму. Таким чином, можливо що використовуються в біохімічній реакції, яка створити фермент зі специфічною дією на окрему веде до формування окремого вторинного сполуку, що використовується як попередник у метаболіту, та що ці біохімічні речовини не є конкретному процесі вторинного метаболізму. основним и метаболітами. Також можна вивести бактерії, які будуть рости Ферменти, що діють на сполуки, які на різних сполуках, що використовуються як функціонують як попередники продуктів у попередники у процесі вторинного метаболізму. вторинному метаболічному процесі, переважно Фахівець може легко здійснити селекцію утворюють з вищезгаданих сполук речовини, що мутованих бактерій або інших клітин на окремих є безпечними для рослинної клітини і тому сполуках, що використовуються як попередники у 33 75562 34 процесі вторинного метаболізму, та засіб В іншому втіленні винаходу спосіб включає визначення специфічних ферментів, здатних до етап вирощування вищезазначеної рослинної перетворення цих сполук у нешкідливі речовини. клітини та регенерації рослини зі зміненими Цей підхід може включати прямий відбір продуктами фенілпропаноїдного шляху. специфічних ферментів або поетапну Ще в одному втіленні винахід включає модифікацію та відбір ферментів з бажаною дією. використання вищезгаданої рослини для Подібно цьому, використання відомих ферментів, промислового процесу, такого як виробництво що находять зараз комерційне застосування, корисних сполук, корму для тварин чи целюлози. наприклад, ферментативних препаратів з Гени, що кодують ферменти, здатні до дії на екстрактів грибків Trichoderma, здатних до сполуки-попередники продуктів у розкладення лігніну при операціях варення фенілпропаноїдному шляху, можуть бути целюлози, може дати джерело придатного природними, синтетичними чи їхньою ферменту, наприклад, для виділення ферментів, комбінацією. Фахівець може легко усвідомити, що задіяних в розкладенні фенольних сполук. Для кодуючу послідовність гена можна змінити для фахівців очевидно, що гени, які кодують більш ефективної дії в рослинних клітинах. Це ферменти, використовувані в целюлозній можна здійснити, змінивши послідовності кодонів, промисловості для обробки лігніну, можуть щоб вони були більш схожими на використання використовуватися в рамках способу, або кодонів при звичайній дії гена в рослинній клітині. безпосередньо, або після модифікації для Крім того, очевидно, що можна визначити окремі специфічної дії на одну зі сполук-попередників у ділянки рестрикцій для зручної маніпуляції фенілпропаноїдному шляху. Також кодуючою послідовністю. Також передбачається, передбачається, що в рамках представленого що для забезпечення відповідної дії кодуючої винаходу може використовуватися велика послідовності може використовуватися додання кількість різних ферментів. Таким чином, спосіб різних послідовностей, наприклад енхансерів не обмежується джерелом або специфікою трансляції, інтронів тощо. Ферменти можуть використовуваного ферменту. також бути модифіковані шляхом зміни ділянок Наприклад, в одному аспекті способу зв'язування субстратів або іншої модифікації фермент, який експресується в клітині рослини, початкової послідовності амінокислот, що діє на сполуку-попередник або субстрат продукту підвищує активність ферменту. Усі ці маніпуляції в фенілпропаноїдному шляху та утворює відомі в цій галузі і легко будуть усвідомлені речовину, на яку вже не впливає фермент, що фахівцем. звичайно використовує цю сполуку як попередник В іншому аспекті представленого винаходу у фенілпропаноїдному шляху. Відповідно, рівень фермент знаходиться під контролем окремого продукту цього процесу зменшується селективного до тканини промотору, зокрема завдяки зменшенню попередників, необхідних селективного до насіння промотору. Селективний для його формування. Отримана в результаті до насіння промотор - це промотор, що обмежує рослинна клітина може використовуватися дію послідовностей виключно або переважно безпосередньо або для регенерації цілої рослини тканинами насіння рослини. Тому рівень зі зміненим рівнем продуктів фенілпропаноїдного окремого продукту фенілпропаноїдного шляху шляху, яка буде корисною в будь-яких змінюється у вибірковий до тканини спосіб, а інші промислових процесах, не тільки для рослинні тканини зберігають нормальний рівень виробництва кормів, целюлози або створення продуктів фенілпропаноїдного шляху. Тканина, в рослин з новими складами фенольних сполук, якій вибірково діє фермент, використовується в включаючи надмірне вироблення окремих приготуванні кормів або в будь-якому іншому продуктів у фенілпропаноїдному шляху. Дерева зі промисловому процесі. зміненим рівнем фенілпропаноїдних продуктів Фахівцеві очевидно, що у межах будуть корисними в целюлозно-паперовій представленого винаходу може бути використана промисловості. Рослини зі зміненим рівнем будь-яка кількість селективних до тканини фенілпропаноїдних продуктів будуть корисними в промоторів. Зокрема, селективний до насіння кормовій промисловості. промотор використовується для зміни рівня Спосіб також базується на відновленні та продуктів фенілпропаноїдного шляху в культурах, використанні рослинних клітин або тканини зі зерно або борошно яких використовуються для зміненими властивостями, зокрема рослинної кормів. В інших культурах можуть тканини, що використовується для виготовлення використовуватися різні селективні до тканин кормів або в інших промислових процесах. промотори в залежності від частини рослини, в Можливо, що зміни фенілпропаноїдного шляху, якій бажана зміна фенольного вмісту. Наприклад, передбачені в рамках представленого винаходу, селективний до коріння або до бульби промотор можуть також спричинити позитивні зміни може використовуватися для зміни рівня фенолів агрономічної ефективності рослин, отриманих або лігніну в корінні або в коренеплодах, таких як цими методами, особливо тими аспектами картопля, турнепс, касава тощо. У тих випадках, винаходу, в яких дія доданих ферментів де листя чи стебла використовуються як корм, призводить до утворення речовин, що захищають може застосовуватися промотор, селективний до від стресів. Можна очікувати інших ефектів, що листя або стеблин, щоб обмежити дію ферментів застосовуються, наприклад, підвищену стійкість на сполуки-попередники у фенілпропаноїдному до захворювань та ультрафіолетового шляху. Інші селективні до тканини промотори випромінювання, механічну міцність і т.п. можуть використовуватися, наприклад, у 35 75562 36 деревах, що вирощуються для целюлози. Отже, В іншій специфічній реалізації промотор, який обмежує дію ферменту на представленого винаходу ген ХО деревину, буде корисним в рамках використовувався під контролем селективного до представленого способу. насіння промотору, та використовувався другий В одному специфічному аспекті фермент, БАДГ, для збільшення утворення представленого винаходу передбачається дія бетаїну з альдегіду бетаїну. У цій реалізації кодуючої послідовності ферменту, що [Boyd, L.A., L. Adam, L.E. Pelcher, A. McHughen, R. перетворює холін в рослинних клітинах. Дія цього Hirji, and G. Selvaraj., 1990, Gene 103:45-52.] холін-метаболізуючого ферменту вичерпує БАДГ діяв під контролем селективного до насіння кількість доступного холіну, що використовується промотору. при утворенні синапіну з синапоїл-глюкози. Деякі Бетаїн - це сполука, знайдена в їстівних види рослин, особливо родини Cruciferae, частинах багатьох харчових та кормових рослин; виробляють нехарчову сполуку синапін. Синапін, вона також використовується в деяких випадках як вважається, синтезується шляхом зміни як харчова та кормова добавка. Бетаїн також має складової глюкози в синапоїл-глюкозі (sin-glu) на стресозахисну функцію. холін. Зменшення рівня нехарчової сполуки В іншій специфічній реалізації синапіну збільшує цінність насіння і отриманого з представленого винаходу ген ХО нього корму. Використання ферменту, що змінює використовується в клітині хрестоцвітої рослини холін, наприклад, холіноксидази, є корисним в (виду Brassica) під контролем селективного до представленому винаході. насіння промотору, та використовувався другий Відомо, що холін окиснюється до бетаїну в фермент БАДГ, також під контролем таких харчових рослинах, як пшениця, шпинат, селективного до насіння промотору, для цукровий буряк та ячмінь [Rhodes and Hanson, забезпечення утворення бетаїну з альдегіду 1993, Annual Review of Plant Physiology and Plant бетаїну. Molecular Biology, 44: 357-384]. Цей Зміна рівня холіну в насінні хрестоцвітих окиснювальний процес каталізується двома передбачає зменшення рівня синапіну і ферментами (в термінах генетики відомими як подальшу зміну кількості різних продуктів "система окиснювання холіну "); продукти цього фенілпропаноїдного шляху. Можна з впевненістю процесу показані нижче: зазначити, що зміна рівня холіну в насінні Холін - альдегід бетаїну - гліцинбетаїн призводить до збільшення рівня синапоїлглюкози (бетаїн) або інших синапоїлових сполук, наприклад Реакція на першому етапі каталізується малату синапоїлу, що у свою чергу змінює рівень дегідрогеназою холіну (CDH) або холіноксидазою синапінової кислоти, попередника лігніну. Отже, (ХО) у бактеріях та тваринах [Rozwadowski, активізується механізм біохімічної регуляції, що Khachatourians and Selvaraj, 1991, Journal of звичайно позначається як стримування кінцевого Bacteriology, 173: 472-478] і монооксигеназою продукту, спричинюючи зміну рівня різних холіну (СМО) в рослинах (Rhodes and Hanson, продуктів у фенілпропаноїдному шляху. 1993). Реакція на другому етапі каталізується Відповідно, запобігання утворенню синапіну дегідрогеназою альдегіду бетаїну (БАДГ) (Rhodes призводить до зміни рівня великої кількості різних and Hanson, 1993). Відповідно, використання продуктів, що утворюються на етапах ферменту, що перетворює холін, може призвести фенілпропаноїдного шляху перед заключним до зменшення кількості доступного холіну в етапом формування синапіну. загальний чи специфічний спосіб за допомогою На вторинний процес фенілпропаноїдного конститутивних, адаптованих чи специфічних до метаболізму також може впливати фермент, який тканини промоторів. Зменшення доступності діє на ферулову кислоту. Ферулова кислота є холіну скорочує вироблення синапіну. Додатково, іншим попередником у фенілпропаноїдному зменшення рівня синапіну може викликати зміни шляху. Відповідно, рівень ферулової кислоти кількості інших продуктів фенілпропаноїдного зменшується. Зменшення доступності ферулової шляху, що призводить до утворення рослинної кислоти викликає зміну кількості фенольних тканини зі зміненим фенольним змістом. сполук, включаючи зменшення рівня синапіну у В іншій специфічній реалізації хрестоцвітих рослинах. представленого винаходу мікробний ген Гени, що кодують ферменти, здатні впливати холіноксидаз (ХО) [Rozwadowski, Khachatourians на ферулову кислоту, можуть бути природними, and Selvaraj, 1991, Journal of Bacteriology, 173: синтетичними або їхньою комбінацією. Фахівець 472-478] розміщався під контролем селективного може легко усвідомити, що кодуючу послідовність до насіння промотору. Дія холіноксидаз в насінні гена можна змінити для більш ефективної дії в переводить холін, один з попередників у рослинних клітинах. біосинтезі синапіну в насінні рапсу, у нешкідливу Згідно з іншим аспектом винаходу, ген, що речовину бетаїн, шляхом формування альдегіду кодує фермент, здатний впливати на ферулову бетаїну, що повільно перетворюється на бетаїн кислоту, розміщується під контролем під дією ферменту ХО. У насінні з селективного до тканини промотору. Тому рівень рекомбінантною ДНК зменшився рівень синапіну ферулової кислоти змінюється у вибірковий до та змінився рівень інших продуктів тканини спосіб, зберігаючи нормальний рівень фенілпропаноїдного шляху. Борошно, отримане з ферулової кислоти в інших тканинах рослини. такого насіння, є корисним для застосування у Тканина, в якій вибірково діє фермент, кормі. використовується в приготуванні кормів, їжі або в 37 75562 38 будь-якому іншому промисловому процесі. або частково розмеленим зерном, існує багато До ферментів, що передбачаються для способів приготування зернового борошна. використання в цих втіленнях представленого Особливе значення для насіння хрестоцвітих має винаходу, відносяться ферменти, здатні спосіб виготовлення борошна шляхом екстракції модифікувати ферулову кислоту й особливо ті, олії з насіння олійних хрестоцвітих культур. що, як відомо, виробляють з ферулової кислоти Взагалі кажучи, олію одержують з насіння олійних сполуки, що застосовуються. Фахівцеві ясно, що культур за допомогою розчинника або без нього. в рамках способу метаболізації ферулової Макуха або віджаті тверді залишки, отримані кислоти можна використовувати інші ферменти. протягом цього процесу, використовуються для Відомі джерела ферментів, що метаболізують приготування корму та звичайно містять більшу ферулову кислоту, знайдені в таких частину фенольних сполук з насіння мікроорганізмах, як [Aerobacter sp, Bacillus хрестоцвітих. Способом виробництва борошна з megaterium, В. subtilis, Corynebacterium меншим фенольним рівнем створюють новий glutamicum, Enterobacter sp., Psuedomonas sp., склад, на цей час не виявлений у борошні з Streptomyces sp., Aspergillis sp., Candida sp., насіння хрестоцвітих. Fusarium sp., Hansenula sp., Penicillum sp., Представлений винахід передбачає Rhodotorula sp., Saccharomyces sp]. Цей список використання генетично зміненого насіння, не вичерпний, але показує багато відомих створеного згідно зі способом отримання джерел ферментів метаболізму ферулатів. Таким кормового продукту зі зміненим рівнем фенолів. чином, цей спосіб не обмежується джерелами Описаний спосіб надає багато переваг щодо ферментів, використовуваних для метаболізму зміни фенотипу рослини. Додатково спосіб ферулової кислоти. У рамках представленого дозволяє виробництвво різних сполук з відомим винаходу передбачено зміну гена, що кодується промисловим використанням. Описаний спосіб мікробами, для забезпечення оптимальної дії в знаходить застосування у будь-яких видах рослинних клітинах. Такі способи добре відомі в рослин або рослинних тканин. цій галузі. Описаний спосіб надає багато переваг у Як приклад таких ферментів, порівнянні з відомими методами керування використовується декарбоксилаза ферулової фенілпропаноїдним процесом. Цей спосіб не кислоти від В. pumulis. Ген для цього ферменту базується на мутаціях, таких як мутація SIN1, що був виділений та вивчена його послідовність. виявляється в усій рослині та пов'язана з [Zago et. al., Applied and Environmental чутливістю до ультрафіолету. Спосіб не Microbiology 61:4484-4486, 1995]. Послідовність використовує генетичні механізми, розроблені гена можна змінити, щоб він був більш схожим на для блокування експресії гена, наприклад, рослинний ген, зберігаючи при цьому антизмістовну РНК або косупресію, які вимагають передбачувану послідовність амінокислот. Цей клонування генів рослини з фенілпропаноїдного фермент здатний до створення вінілгваяколу з шляху. Спосіб не змінює жодного гена, ферулової кислоти шляхом декарбоксилювання. притаманного рослині. Відповідно, різні функції Відповідно, в одному прикладі способу процесу, такі як вироблення флавоноїдів, утворюється корисна сполука (вінілгваякол, VG) речовин, що захищають від ультрафіолету, шляхом діяльності введеного гена, що може участь у реакції на захворювання та інші впливати на ферулову кислоту. Фермент не біохімічні функції процесу не зазнають шкідливої вимагає додаткових факторів і має ймовірну зміни. За допомогою селективних до тканини молекулярну масу приблизно 22 т.п.н. промоторів можна змінити фенольний рівень у В іншій специфічній реалізації будь-якій тканині, зберігаючи інші тканини представленого винаходу фермент рослини без змін. декарбоксилаза ферулату розміщується під Описаний спосіб знаходить застосування для контролем селективного до тканини промотору, багатьох видів рослин, але найбільш корисним призводячи до створення рослини, що містить він є для хрестоцвітих. У результаті застосування тканини зі специфічно зміненим метаболізмом способу виникає додаткова перевага завдяки ферулової кислоти. виробленню стресозахисної або промислово Зміна рівня ферулової кислоти передбачає корисної сполуки, як результату дії доданого зменшення рівня ферулової кислоти та наступну ферменту. Очевидно, що спосіб може бути зміну кількості різних продуктів спрямований на будь-яку кількість етапів у фенілпропаноїдного шляху. фенілпропаноїдному шляху, та інші біохімічні У цьому винаході також передбачається процеси також можуть бути змінені подібним створення рослинної тканини, зокрема зерна, підходом. корисного для застосування у харчових Представлений винахід також знаходить продуктах та кормах. Як безпосереднє вживання застосування для зміни інших процесів зерна, так і використання модифікованої муки з вторинного метаболізму. Наприклад, в одному отриманого зерна входять у об'єм втіленні представленого винаходу пропонуються представленого винаходу. Зменшення рівня способи і конструкції ДНК для створення рослин фенолів у зерні є бажаним у кормах та генетично зі зміненим метаболізмом цукрових спиртів, змінене насіння зі зміненим фенольним вмістом, зокрема шляхом зміни рівня фітату в клітинах зокрема з меншою кількістю нехарчових фенолів, насіння. Фітат утворюється з цукрового спирту є дуже корисним у виробництві кормів. міоінозиту, який також є попередником або На додаток до безпосередньої годівлі цілим проміжною ланкою для формування інших 39 75562 40 сполук, таких як стахіоза, рафіноза, цукрозилрамках представленого винаходу, можна змінити глікозиди, уроніди та пентози, фосфоїнозитиди та звичайними методами, відомими в цій галузі. глікофосфокераміди. Крім того, винахід пропонує Спосіб також базується на використанні способи і композиції ДНК для зменшення рівня трансформації для введення в рослинні клітини фітату в насінні хрестоцвітих. У винаході також гена, що кодує фермент. Трансформацію пропонується насіння рослини зі зменшеним рослинної клітини можна здійснити за допомогою рівнем фітинової кислоти, придатне для багатьох засобів. До способів загального застосувань у кормах, насіння рослини зі застосування відносяться системи на основі зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне Agrobacterium, з використанням бінарних і для виготовлення модифікованого корму, та коїнтегрованих плазмід A. tumifaciens та A. рослинні клітини з модифікованим метаболізмом rhyzogenes (напр., [патенти США 4940838 та інозиту. 5464763], біолістичного підходу (напр., [патенти У цьому винаході пропонуються способи та США 4945050, 5 015580 та 5149655]), мікроін'єкції конструкції ДНК для створення рослин зі (напр., патент США 4743548), прямого зміненим рівнем фітату в клітинах насіння. Також поглинання ДНК протопластами (напр., [патенти у винаході пропонуються способи та композиції США №5231019 та 5453367]) чи введення ДНК для зменшення рівня фітату в насінні ін'єкцією (напр., [патент США 5302523]). У однодольних, дводольних, олійних культур та у контексті представленого винаходу може насінні хрестоцвітих. У винаході також застосовуватися будь-який спосіб генетичної пропонується насіння рослини зі зменшеним трансформації рослинної клітини. рівнем фітинової кислоти, придатне для Спосіб також базується на регенерації та виготовлення модифікованого борошна, та використанні рослинних клітин або тканини зі рослинні клітини з модифікованим метаболізмом зміненими властивостями, зокрема тканини інозиту. насіння, що використовується для корму. У цьому винаході розглядається експресія Таким чином, одержують рослинні клітини зі генів, що кодують ферменти, які діють на зміненим метаболізмом цукрових спиртів. З цукровий спирт — попередник у біосинтезі цукрових спиртів утворюються численні сполуки, фітинової кислоти, міоінозит, викликаючи але найбільш важливою є фітинова кислота або метаболічне переведення цього попередника у фітат. Способи зменшення кількості фітату в "тупик", або погано перетворювані сполуки, що окремих рослинних клітинах активно можуть безпечно накопичуватися в рослинній застосовуються при використанні кормів. клітині. У такий спосіб досягається скорочення Гени, що кодують ферменти, здатні діяти на біосинтезу фітинової кислоти. Способи, описані в міоінозит, можуть бути природними, представленому винаході, можуть бути синтетичними або їхньою комбінацією. Фахівець спрямовані на інші цукрові спирти. Фермент, що може легко усвідомити, що кодуючу послідовність використовується для дії на міоінозит, може мати гена можна змінити для більш ефективної дії в мікробне, тваринне або рослинне походження. рослинних клітинах. Це можна здійснити, Цей фермент може бути природним або змінивши послідовності кодонів, щоб вони були отриманим за допомогою мутації відомого більш схожими на використання кодонів при ферменту, щоб змінити його специфічну дію на звичайній дії гена в рослинній клітині. Крім того, субстрат, отже, створити новий фермент. очевидно, що можна визначити окремі ділянки Фермент, що використовується для дії на рестрикцій для зручної маніпуляції кодуючою міоінозит, переважно утворює сполуки, що є послідовністю. Також передбачається, що для безпечними для рослинної клітини і тому можуть забезпечення відповідної дії кодуючої накопичуватися до високого рівня без шкідливого послідовності може використовуватися додання впливу на рослинну клітину. В об'ємі різних послідовностей, наприклад енхансерів представленого винаходу можуть трансляції, інтронів тощо. Усі ці маніпуляції відомі застосовуватися один або кілька ферментів, та в цій галузі і легко будуть усвідомлені фахівцем. кілька різних властивостей може Також очевидно, що можна застосовувати використовуватися для зменшення рівня селективний до тканини промотор, щоб обмежити міоінозиту. дію ферменту, здатного до модифікації В об'ємі представленого винаходу міоінозиту, тими тканинами, в яких виробляється використовуються ферменти, здатні до фітинова кислота, наприклад, тканиною насіння. модифікації міоінозиту шляхом ізомеризації, До придатних селективних до насіння промоторів сполучення, фосфорилування, гідроксилювання, відносяться промотор напіну з Brassica napus, метилування або будь-якої іншої подібної промотор фазеоліну з Phaseolis, або будь-який біохімічної операції, або ферменти, здатні до інший селективний до насіння промотор. видалення міоінозиту чи інших цукрових спиртів. Зокрема, в рамках представленого винаходу Ферменти, що використовуються в контексті передбачається використання О-метилпредставленого винаходу, можуть бути отримані трансферази міоінозиту з Mesembryanthemum з багатьох джерел або багатьма методами. crystallinum. Наприклад, можна ідентифікувати фермент з У цьому винаході передбачається відомою дією на хімічно подібні субстрати. використання генетично зміненого насіння, Відповідно, можна визначити фермент, виділити отриманого шляхом дії ферментів, що впливають ген і використати його в контексті представленого на міоінозит, під контролем селективного до винаходу. Ферменти, що використовуються в насіння промотору. Відповідно зменшується 41 75562 42 рівень фітинової кислоти. Після обробки насіння досягається модифікація як фенілпропаноїдного отримують кормовий продукт зі зменшеним метаболізму, так і метаболізму цукрових спиртів, рівнем фітинової кислоти. Таким чином, з наведенням окремих прикладів щодо того, як виготовлення борошна зі зменшеним рівнем надійно та передбачувано, згідно зі способом фітинової кислоти також розгляддається як представленого винаходу досягається результат застосування способу. зменшення рівня окремих метаболічних сполук, У представленому винаході пропонують зокрема нехарчових сполук. засоби створення насіння хрестоцвітих зі Для фахівця очевидно, що в рамках зменшеним рівнем фітинової кислоти. Зокрема, в представленого винаходу можна змінити будьоб'ємі винаходу передбачається використання Оякий вторинний метаболічний процес. Винахід метил-трансферази міоінозиту, наприклад, з було продемонстровано на двох незалежних Mesembryanthemum crystallinum, для зменшення вторинних метаболічних процесах та отримано кількості фітинової кислоти в хрестоцвітих передбачені та реальні результати. При культурах. Фахівець може легко усвідомити, що детальних дослідженнях винаходу досягнуто виробництво борошна зі зменшеним рівнем зменшення рівня нехарчових факторів, фітинової кислоти з насіння хрестоцвітих також наприклад, в клітинах насіння рапсу, клітинах може бути здійснене в результаті застосування зернових, рису та бавовни. представленого винаходу. Наприклад, увага фахівця спрямовується на Відомо, що присутність фітинової кислоти в оцінку вироблення окремого вторинного зерновому борошні є шкідливим для риби, метаболіту як частину способу представленого вирощуваної в аквакультурі. Однак деякі зернові винаходу. Отже, фахівець може легко борошна, наприклад, борошно з насіння рапсу, усвідомити, що потрібно базове вивчення тканин, мають білковий склад, корисний для годівлі риб. в яких синтезується вторинний метаболіт або Висока концентрація фітинової кислоти в борошні сполука, яка застосовується як його попередник, з рапсу обмежує кількість корму, що може на додаток до експериментально визначеного використовуватися в раціоні риби. Тому борошно часового інтервалу, в якому це відбувається. зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, Така інформація надасть напрямок для вибору отримане з насіння хрестоцвітих, є дуже промотору, який буде контролювати дію корисним в аквакультурі. ферменту на вторинний метаболіт або його Відповідно, представлений винахід знаходить попередник. У такий спосіб фахівець легко застосування у виробництві насіння зі зміненим усвідомить, що спрямування на вторинний рівнем фітинової кислоти та зернового корму зі метаболіт потребує ферменту, здатного до дії на зменшеним рівнем фітинової кислоти. попередник цього вторинного метаболіту в Модифіковані насіння та корм знаходять широке тканині, де вторинний метаболіт утворюється, та застосування, наприклад, для свійських птахів, в той часовий інтервал, в якому він утворюється. свиней, риби, жуйних та нежуйних тварин. 3 Таким чином, фермент, що діє на попередник попереднього опису також ясно, що в рамках вищезазначеного вторинного метаболіту, представленого винаходу для модифікації повинен бути введений у момент або під час міоінозиту можна використовувати будь-яку синтезу цього попередника. кількість різних ферментів. Також очевидно, що Далі, фахівець повинен виконати біохімічний для специфічного зменшення рівня фітинової аналіз тканини, в якій буде здійснюватися спосіб. кислоти можна використовувати різноманітні Цей аналіз може включати визначення рівня комбінації цих ферментів під контролем різних сполук у тканині протягом процесу, будьселективних до насіння промоторів. якої компартменталізації або субклітинної Використання винаходу у процесі вторинного локалізації біосинтезу, часового періоду, в який метаболізму цукрових спиртів не обмежується сполука починає або закінчує синтезуватися, та наведеними видами рослин. Фактично будь-який будь-якої іншої доречної біохімічної інформації. вид рослини, що виробляє фітинову кислоту, При виконанні цього аналізу фахівець можна модифікувати способом представленого спроможний вибрати промотор, який забезпечує винаходу. Спосіб є корисним для будь-якої інтенсивність дії, придатну для здійснення сільськогосподарської культури, оскільки бажаних змін вмісту вторинного метаболіту в фермент, що використовується, О-метилрослинній тканині. Передбачається, що навіть трансфераза, є неспецифічним до усіх головних маленька зміна рівня сполуки, що економічно важливих культур. Таким чином, використовується як попередник, може дати будь-яка культура, що використовується для бажаний ефект. фуражу або виробництва зерна, яке повністю або Наприклад, при частковій реалізації частково використовується для фуражу, може представленого винаходу щодо фітинової бути змінена представленим способом для кислоти, фахівець легко усвідомить, що базове створення рослин зі зменшеним рівнем фітату. вивчення тканин, в яких синтезується фітинова Відповідно, спосіб може застосовуватися для кислота, на додаток до експериментально будь-яких сільськогосподарських культур, визначеного часового інтервалу, в якому це включаючи однодольні (наприклад, зернові, рис, відбувається, дасть напрямок для вибору пшеницю, ячмінь, жито) та дводольні (наприклад, промотору, який буде контролювати дію сою, бавовну, люцерну, Brassica, льон, соняшник ферменту на міоінозит. У такий спосіб фахівець тощо.). легко усвідомить, що спрямування на міоінозит За допомогою представленого способу потребує ферменту, здатного діяти на міоінозит у 43 75562 44 тканині, де утворюється фітинова кислота, та в забезпечення оптимальної дії в клітині той часовий інтервал, в якому вона утворюється. конкретного виду рослини. Все це знаходиться в Таким чином, фермент, що діє на міоінозит, межах можливостей кваліфікованого фахівця. повинен бути введений у момент або під час Таким чином, можна з упевненістю передбачити, синтезу фітинової кислоти. Інтенсивність дії що цей винахід може бути здійснений для будьферменту можна змінити, щоб досягти якого виду рослин, здатних до генетичної визначеного скорочення вироблення фітинової трансформації, включаючи ті рослини, зерно яких кислоти. Це скорочення може сягати від кількох використовується безпосередньо для одержання відсотків до майже повного видалення фітинової корму, або ті рослини, зерно яких спочатку кислоти. Фахівець може легко усвідомити, що піддають обробці перед використанням як корм. зменшення рівня фітинової кислоти, особливо в Таким чином, у результаті застосування деяких культурах з високим рівнем фітинової цього способу одержують кормове насіння зі кислоти, може потребувати більш інтенсивної дії зменшеним рівнем фітинової кислоти. гена, що змінює міоінозит, ніж у тій культурі, де Окрім прямого згодовування цілого або фітинова кислота присутня в меншій кількості. частково пошкодженого насіння існують багато Керування інтенсивністю дії різними засобами способів одержання насіннєвого борошна. Серед добре відоме. Воно може включати додання інших продуктів — мокрий помел зерна послідовностей ДНК, що посилюють трансляцію, використовують для одержання борошна з сильні промотори, що забезпечують високий клейковини зерна. Окрім продуктів обробленого рівень транскрипції, або додання послідовностей зерна, може бути одержане ціле зерно зі ДНК, таких як області додатку матриксу або зменшеним рівнем фітинової кислоти згідно зі додатку клітинного каркасу, що, як вважається, способом цього винаходу. Цей винахід також забезпечує надійні рівні транскрипції трансгенам. пропонує одержання борошна з клейковини Ця реалізація представленого винаходу зерна зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. також передбачає створення рослинної тканини, Окрім основних сільськогосподарських зокрема насіння рослини, що знаходить культур, таких як кукурудза, олійне насіння застосування для кормів. Як безпосереднє забезпечує велику кількість рослинного борошна, вживання насіння, так і використання що використовується як корм. Особливо модифікованого корму з отриманого насіння важливим у переробці олійного насіння є входять у об'єм, представленого винаходу. одержання борошна під час екстрагування олії. Зменшення рівня фітинової кислоти в насінні є Загалом, олію екстрагують з олійного насіння за бажаним для застосування у Нормах, і генетично допомогою розчинника або без нього. Макуху або змінене насіння зі зміненим рівнем фітинової віджату тверду речовину, що утворюється кислоти буде дуже корисним для виробництва внаслідок цього процесу, використовують для кормів. кормових композицій, де вони зазвичай містять У деяких застосуваннях тварин годують головну частину рівня фітинової кислоти насіння. цілим зерном або зерно піддається мінімальній Найбільш широко використовувана обробка обробці, але не подрібнюється. Наприклад, зерно олійного насіння включає екстрагування олії та зернових культур часто використовується для виділення макухи або остаточних компонентів корму з мінімальною обробкою. Однак, деякі насіння після екстрагування олії. Цей винахід зернові культури піддаються обробці та тварин пропонує використання цього процесу й кормові годують отриманими в результаті продуктами, складові, що утворилися, можуть бути більш наприклад зерновою клейковиною. Для обох цінними, ніж загальновизнаний одержаний корм, типів зернового корму може бути корисним завдяки зменшеному рівня фітинової кислоти. зменшення рівня фітинової кислоти, особливо Таким чином, спосіб одержання корму з якщо це стосується руйнування навколишнього низьким рівнем фітинової кислоти пропонує нову середовища через надлишок фосфору, що його композицію, що не міститься в кормі, одержаному виділяють тварини. Для інших видів зерна, після переробки олійного насіння. До основних наприклад пшениці, ячменя і вівса, олійних культур, що будуть корисними у цьому представлений винахід також може бути винаході, належать хрестоцвіті олійні зернові корисним. Таким чином, представлений винахід культури, такі як Brassica napus, Brassica rapa, знаходить застосування для широкого діапазону Brassica Juncea, Brassica nigra, Sinapis alba, економічно важливих зернових культур. Ген, Crambe, Eruca sativa та інше насіння хрестоцвітих представлений у даному винаході для зміни рівня олійних культур, що можуть бути комерційно міоінозиту, може виявитися здатним до дії в будьважливими й використовуватися як корм. До якій зерновій культурі, оскільки міоінозит олійного насіння нехрестоцвітих, що часто міститься в усіх зернових культурах та є єдиним використовують при одержанні корму, належить відомим попередником у біосинтезі фітинової соя, бавовна, кукурудза, сафлор, соняшник та кислоти. Таким чином, продемонстровано арахіс. безсумнівне застосування гена метилУ даному винаході розглядається трансферази для зміни рівня міоінозиту. Фахівець використання генетично модифікованого олійного може легко усвідомити, що кодуюча насіння, одержаного внаслідок експресії послідовність кодуючої ділянки, або окрема ферментів, здатних діяти на міоінозит, де послідовність ДНК промотора, або вищезгаданий фермент знаходиться під нетрансльована послідовність ділянки, контролем насіння-селективного промотору. термінатор тощо, може бути змінена для Таким чином, кількість фітинової кислоти є 45 75562 46 зменшеною. Під час обробки олійного насіння Потім використовували рідинну кормовий продукт має знижений рівень фітинової хроматографію під високим тиском (HPLC) для кислоти. підтвердження рівня синапіну. Метанолові Наступні приклади надані з метою ілюстрації екстракти рослинного матеріалу, як описано способу й жодним чином не обмежують об'єму вище, але без екстрагування хлороформ-вода, винаходу. піддавали дії HPLC, використовуючи Varian Приклад 1: Загальні способи визначення HPLC, оснащену колонкою Nucleosil C18AB. продуктів фенілпропаноїдного шляху: Об'єм ін'єкції типово складав 10мкл і рухомою Визначення рівня синапіну — кінцевого продукту фазою була суміш Розчинника А (2% оцтова фенілпропаноїдного шляху, у насінні кислота у воді) і Розчинника В (2% оцтова хрестоцвітих. кислота в ацетонітрилі). Типові умови Є очевидним той факт, що фахівець у галузі промивання включають у рухомій фазі: може виконати усі способи визначення продуктів Розчинник А, що змінюється від 90% до 80% фенілпропаноїдного шляху, звернувшись до протягом 17 хвилин, після чого ще падає до 10% багатьох публікацій з аналітичної хімії. Згідно з протягом 1 хвилини. Колонку утримували 10% першим описаним методом був виконаний Розчинником А протягом чотирьох хвилин, потім простий тест на визначення синапіну в тканині промивали й врівноважували 90% Розчинником рослин, а саме тканині насіння з хрестоцвітих А. Ці умови можуть бути змінені для підвищення рослин, згідно з опублікованими способами відокремлення речовин, що елюювали. [Chappie, C.C.S., Т. Vogt, B.E. Ellis і C.R. Наприклад, Розчинник А може бути змінений від Somerville, 1992, Plant Cell 4:1413-1424]. 90% від початку елюювання до 80% протягом 15 Протокол тонкошарової хроматографії (TLC) був хвилин до 70% протягом 15 хвилин і потім до стандартизований для визначення синапіну — 10% протягом 2 хвилин, після чого витриманий продукту фенілпропаноїдного шляху. Цей спосіб ще 2 хвилини при 10% і врівноважений на 90%. складався з відокремлення рослинних екстрактів, Діодний детектор використовували для і відому кількість синапіну наносили на пластинки виявлення УФ-поглинання. УФ-поглинання при з силікагелю (наприклад, Whatman 60A SilicaG). 330нм використовували для аналізу зразків. Синапін може бути очищений за допомогою Будували стандартну криву очищеного синапіну й опублікованих способів (наприклад, [D. Strack, використовували для підрахування синапіну у 1977, Ζ. Pflanzenphysiol. 84: 139-145]). рослинних екстрактах. Для фахівця у галузі є Відокремлення проводили за рахунок композиції очевидним той факт, що умови HPLC (наприклад, розчинників н-бутанолу, оцтової кислоти й води у співвідношення й градієнт розчинників, різні типи співвідношенні 10:2:3, відповідно, до приблизно розчинників) можуть змінюватись. Бажано 10см від початку. Насіннєві екстракти визначати відповідні умови для обладнання, і одержували із застосуванням просочування складність зразка, що наносять. В опублікованих протягом ночі попередньо зваженого зразка у даних описують багато способів HPLC для щільно зачиненій пробірці, що містить 100аналізу фенольних сполук, включаючи синапін. 500мкл розчину метанолу (98% метанол, 2% Радіоактивні дослідження використовували оцтова кислота), після чого додавали такий для того, щоб одержати більш точне виявлення самий об'єм метанолу й розтирали. Супернатант початку синтезу синапіну й визначення співвідношення заново синтезованого синапіну у одержували після центрифугування при 12000 g. різних частинах насіння. Спосіб радіоактивного Супернатант екстрагували сумішшю хлороформ: визначення може також використовуватися для вода (400мкл:100мкл), центрифугували, як визначення здатності окремих компонентів описано вище, видаляли ліпідну фазу й водну насіння (наприклад, сім'ядолей, ембріона, фазу висушували на повітрі або висушували у насінної шкірки) синтезувати синапін з вакуумі. Зразки розчиняли у воді й переносили на екзогенного надходження холіну. Радіомічені пластинки для TLC. Певну кількість зразка, що продукти можна потім перевіряти на синапін, визначали емпірично, переносили на пластинки наприклад, використовуючи протокол TLC, після для TLC перед піддаванням дії розчинника, що чого сканування Ambis4000. піднімається угору. У тих випадках, де Протокол HPLC використовували для використовували вимірювання сухої ваги, ці кількісного аналізу загального рівня синапіну в вимірювання здійснювали шляхом висушування і насіннях і компонентах насіння. TLC потім зважування відомої кількості свіжих зразків. використовували для кількісного аналізу рівня Пластинку для TLC потім роздивлялись під синапіну на різних етапах розвитку насіння, а УФ-світлом, і синапін візуалізували як блискучу радіоактивне визначення разом з TLC та пляму. Попередньо очищений зразок синапіну наступне підрахування радіоактивних плям використовували як стандарт один, а також як використовували для визначення початку й штучну суміш з насіннєвим екстрактом для того, розповсюдження синапіну в насіннях і тканині щоб переконатися, що очищений синапін насіння, такій як сім'ядолі, осі зародків і насінної мігрував з синапіном в насіннєвому екстракті, шкірки. якщо він присутній разом з компонентами При радіоактивному визначенні синтезу насіннєвих екстрактів. При спостереженні синапіну de novo з холіну використовували цілі радіоактивно міченого синапіну пластини TLC стручки, аніж виділене насіння, для того, щоб сканували за допомогою сканера Ambis4000 експериментальні умови якомога більше (Scanalytics), що кількісно зображує радіоактивне наближались до умов in vivo. Стручки з різних випромінювання. 47 75562 48 етапів розвитку одержували з рослин, що були одержували згідно зі способами, описаними у вирощені в контрольних умовах — типово 20°С Прикладі 1, і рівень синапіну візуалізували за температура вдень, 15°С температура вночі при допомогою TLC-аналізу. Синапін спостерігався з 16/8-годинному циклі день/ніч. Квітконіжкову 18 ДПЗ до моменту достигання насіння й насіння, частину стручка занурювали у розчин, що містив що вистигало, містило найбільшу кількість 14 С-мічений холін, придбаний у New England синапіну, що дозволяє припустити, що має місце Nuclear (активність маточного розчину загальне накопичення в насінні, що вистигає. 2,0ГБк/ммоль; концентрація, 7,4МБк/мл, яка є Фракція стінки стручків, з яких видаляли такою самою, як і 0,2мКі/мл; холін, 3,7мкМ/мл). насіння, не містила синапіну, синапін також був Стручки з їх ніжкою, зануреною у пробірку, що відсутній у більш молодому насінні зі зразків на 7містила 1,8мл водного середовища, такого як 0,514- і 16-ДПЗ. Цей аналіз показав, що початок сильне середовище Murashige-Skoog, і 1мМ накопичення синапіну становив приблизно 18 нерадіоактивного холіну й від 1,8 до 9мкл ДПЗ, проте, оскільки у цьому способі радіоактивного маточного розчину холіну, використовувалось визначення УФінкубували у камері для зростання рослини флуоресценції, то за присутності дуже малої протягом від 24 до 72 години з циклом день/ніч кількості, якщо таке трапляється у більш 16 годин світло/8 годин темрява за температури молодому насінні, визначення стає неможливим. 20°С. Світлові умови становили 51мк Фіг.3 показує приклад TLC-аналізу зразків до 28 Ейнштейнів/м2 за секунду, й насіння, що ДПЗ і наступна пластинка показує приклад аж до видаляли з цих стручків, використовували при моменту достигання насіння. Оскільки аналізі TLC. Ці зразки екстрагували в розчині вищезгадані результати не були кількісними, метанолу, після чого виконували екстрагування виконували HPLC-аналіз екстрактів з цілого розчином хлороформ-вода (CW), як описано насіння, одержаних при використанні розчину вище. метанолу, як описано у Прикладі 1. Результати, У тих випадках, коли аналізували більш старе наведені у Фіг.4, підтверджують початок синтезу насіння, окрім вищезгаданого способу проводили синапіну з 20 ДПЗ, зі швидким підвищенням і інфільтрацію насіння, відокремленого від тривалістю до моменту достигання. Кількість стручків. Двадцять насінин просочували 500мкл синапіну у стиглому насінні становила 0,8% на середовища з радіоактивним холіном, описаного основі сухої маси насіння і, оскільки рівень олії вище, в умовах легкого вакууму протягом 15 становить приблизно 45% насіння, цей покажчик хвилин за кімнатної температури 23°С. наближатиметься до 1,5% знежиреного Радіоактивне середовище потім видаляли й насіннєвого корму. заміщали 500мкл нерадіоактивного середовища Приклад 3: Визначення часових і вищезгаданої композиції, менше 14С-холіну й просторових аспектів синтезу продукту у інкубували при 23°С протягом 24 годин. Насіння фенілпропаноїдному шляху — синтез синапіну потім екстрагували, як описано вище. стосовно стиглості насіння. Рослинний матеріал можна також Виходячи з одержаного вище у Прикладі 2, екстрагувати сумішшю хлороформ : метанол : надалі було показано, що синапін синтезується мурашина кислота (CMF) у співвідношенні 5:12:3, насінням, що вистигає. Є також очевидним той відповідно. Типово додавали 2мкл CMF на мг факт, що руйнування синапіну є мінімальним зразка, потім зразок перетирали й залишали при протягом вистигання насіння. Для того, щоб кімнатній температурі (21—23°С) протягом ночі підтвердити цей аналіз, насіння, що вистигає, 14 (16 годин), після чого центрифугували при інкубували з С-холіном, а попередник використовували для синтезу синапіну з 12000 g протягом 5 хвилин. Супернатант синапоїл-глюкози, кінцевого етапу збирали й осад ретельно змішували з іншим фенілпропаноїдного шляху у рослин. Присутність об'ємом CMF, що додавали раніше, залишали радіоактивного попередника дала змогу протягом 20 хвилин і центрифугували, як описано одержати мічений синапін. Таким чином, вище. Збирали супернатанти й виконували можливо у цей спосіб кількісно описати біосинтез екстрагування хлороформ-вода (CW), як було синапіну. Як показано на Фіг.5, синтез синапіну описано вище, і водну фракцію перевіряли, як (включення 14С-холіну в синапін) було неможливо було описано вище. визначити на 10 ДПЗ, а стає можливим лише на Приклад 2: Визначення розташування 14 ДПЗ. Таким чином, синтез синапіну (тобто синтезу продукту фенілпропаноїдного шляху в одержання кінцевого продукту синапіну з певній тканині. попередників синапоїл-глюкози та холіну) має У цьому прикладі визначали час синтезу місце з 14 ДПЗ до приблизно моменту достигання продукту фенілпропаноїдного шляху під час насіння. Таким чином, початок накопичення вистигання. Цей приклад ілюструє синтез синапіну у насінні відбувається після 14 ДПЗ і синапіну й накопичення всередині тканин насіння насіння, що вистигає, продовжує синтезувати й хрестоцвітих. У цьому прикладі використовували накопичувати синапін до моменту достигання. насіння, що вистигає, рослини Brassiest napus. Хоча 18 ДПЗ і є моментом часу, у який Виконували TLC-аналіз екстрактів стручків, накопичення синапіну можна виявити при одержаних зі штучно запилених квіток, для нерадіоактивному аналізі, радіоактивний аналіз є визначення часу початку накопичення синапіну. більш чутливим і дозволяє виявити навіть малу Зразки збирали на 7, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, присутність біосинтезу. Таким чином, як показано 30 32 і 34 день після запилення (ДПЗ) і після за допомогою радіоактивного аналізу, синтез достигання насіння. Насіннєві екстракти 49 75562 50 синапіну спочатку починається за малої складеним геном між gus і npt (Gus : npt). Gus-npt швидкості на 14 ДПЗ. Дослідження інфільтрації вже був описаний [Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., показують, що здатність синтезувати синапін Pelcher, L.E., Crosby, W.L. і G. Selvaraj, 1991, властива також і більш дорослому насінню Gene 101; 239-245]. Він був клонований як 2,6 (Фіг.6). т.п.н. фрагмент, що містив Nos-термінатор (поліА Окрім визначення рамки часу накопичення сигнал) наприкінці послідовності npt, з pGKK14 продуктів фенілпропаноїдного шляху протягом [Datla et al., 1991] у проміжну плазміду, що вистигання, фахівець у галузі надалі має втратила повністю Т-ДНК RD400. Частково спрямувати свої зусилля на визначення подвоєний промотор CaMV35S разом з лідерною тканинної специфічності біосинтезу продукту послідовністю вірусу мозаїки люцерни з рВІ525 фенілпропаноїдного шляху. У цій частині [Datla, R.S.S., F. Bekkaoui, J.K., Hammerlindl, G., прикладу вимірювали накопичення синапіну у Pilate, D.I., Dunstan і W.L. Crosby, 1993, Plant сім'ядолях, осях зародка і насінній шкірці. Science 94; 139-149] клонували як Hindlll-BamHI Радіоактивний аналіз виконували з цілими фрагмент до 5-кінця послідовності Gus:npt. стручками від 18 до 42 ДПЗ. Ніжку вирізаних Видаляли сайти Hindlll, BamHI і прилеглий Xbal стручків занурювали у розчин, що містив 14Сзаповненням кінців фрагментом Klenow холін, на час від 24 до 72 годин, і три компоненти полімерази І з утворенням pHS722. насіння вирізали й перевіряли на синапін. Функціональну lac-alpha ділянку, що містила Результати, наведені на Фіг.7, показали, що численні сайти клонування з pTZ19R [Mead, D.A., сім'ядолі містили максимальну кількість синапіну Ε. Szczesna-Skorupa, і В. Kemper, 1986, Protein (стосовно кожного насіння), після чого йшли осі Engineering 1:67-74], одержували як 0,26 т.п.н. зародків і насінна шкірка. Екстракти синапіну з фрагмент за допомогою ланцюгової полімеразної сім'ядолей та осей зародка насіння з 25 ДПЗ до реакції. Цей фрагмент розщеплювали MunX і моменту достигання показали, що осі зародка EcoRI і уводили в EcoRI сайт або pHS722 з містили приблизно 50% синапіну сім'ядолей утворенням pHS723. Визначали нуклеотидну відносно сухої маси (Фіг.8). Проте, оскільки послідовність частини т-ДНК-вектора й унікальні сім'ядолі є відносно більшими по масі порівняно з сайти в численних сайтах клонування визначали осями зародка (у шість разів більші за масу осей рестрикційним аналізом. pHS725 — це похідна, для зародку при дозріванні), їх рівень синапіну що походить від pHS723 і містить відкриту рамку становить аж до 90% загального синапіну, що зчитування холіноксидази, що бере свій початок з зустрічається в насінні (Фіг.9). pKR11 (див. Rozwadowski et al., 1991), через серії Приклад 4: Генетична трансформація проміжних векторів, щоб забезпечили зручні рослин, що містять ген, який кодує фермент, сайти або такі властивості як полі А сигнал вірусу здатний діяти як попередник фенілпропаноїдного мозаїки кольорової капусти. pHS725 вектор шляху. забезпечує в pHS723 СОХ відкриту рамку У цьому прикладі фермент — холіноксидаза зчитування разом з поліА сигналом CaMV на 3(ХО), який діє на попередник, що кінці. 5-частину відкритої рамки зчитування, що використовується для синтезу синапіну, містить промотор CaMV35S, заміщали на napinекспресується у клітині рослини. Фермент промотор з проміжної плазміди з утворенням холіноксидазу вставляли у вектор для pHS731. Проміжна плазміда містила pUC19 трансформування рослин під контролем насіння похідну, що містила 1,1 т.п.н. napin-промотору як селективного промотору. Холін є попередником Hindlll-NapinP-BamHI касета, що одержували з J. для одержання синапіну з синапоїл-глюкози, Kohno-Murase [Kohno-Murase et al., 1994], яку таким чином, зменшення пулу холіну зменшує лігували як Hindlll-BamHI вставку в Hindlll-SamHI одержання синапіну. вікно плазміди RD400 [Datla et al., 1992]. Генетичне трансформування Brassica napus, Плазміда, що утворилась, була pHS974. BamHIвиду хрестоцвітих рослин, з конструктом, що БАДГ відкриту рамку зчитування-ПоліА-Kpnl містить насіння-селективну холіноксидазу (ХО). касети виділяли як 2,1 т.п.н. фрагмент з pRKJ6A ДНК-послідовність гена холіноксидази наведена (pRKJ6A [описана детально в R.K. Jain, 1995, на Фіг.10, тоді як передбачувана послідовність Genetic Engineering of Osmolyte Biosynthesis in амінокислот наведена на Фіг.11. Для того, щоб Plants: Manipulation of Aldehyde Betaine забезпечити насіння-специфічну експресію, Dehydrogenase Gene Expression Tobacco, Ph.D. використовували послідовність napin-промотору Thesis, University of Saskatchewan, Saskatoon, [Kohno-Hurase, J., Μ. Murase, H. Ichikawa i J. Canada]) і лігували у BamHI-Κρn І вікно плазміди Imamura, 1994, Plant Molecular Biology, 26:1115pHS974, що приводило до утворення pHS981. 1124]. Цю кінцеву плазміду pHS731 будували за pHSSBI використовували для створення похідної допомогою серій клонування та субклонування pHS731. Фіг.12 показує плазміду pHS731, що згідно зі стандартними протоколами, описаними у утворилась, яка містить відкриту рамку таких посібниках, як [Maniatis, Т., Frittsch, Ε. Ρ. і зчитування-CaMV полі А-сигналу разом з лівим і Sambrook, J. (1982; Molecular Clonning: A правим napin-промотором-ХО. З компонентів Laboratory Manual: Cold Spring Harbor, New York)]. визначали нуклеотидну послідовність сегменту Векторна побудова походить від RD400 [Datla, napin-промотора-ХО відкритої рамки зчитуванняR.S.S., Hammerlindl, J. К., Panchuk, В., Pelcher L. CaMV полі А сигналу. Додаткове підтвердження В. і Keller, W., 1992, Gene 211:383-384], що був послідовності також можливе, оскільки модифікований таким чином, що замість NosPпопередник pHS723 включав усі компоненти Nptll рослина-селективного маркера RD400, став pBIN19 [Bevan, M., 1984, Nucleic Acids Research 51 75562 52 12: 8711-8721], включаючи праві та ліві кінці й скринінгу на експресію гена gus в основному, як усю іншу ділянку. Була опублікована повна [описано у Jefferson, R.Α., 1987, Plant Моi. Biol. нуклеотидна послідовність pΒΘΝ19. Таким чином, Rep.5; 387-405]. Присутність блакитного конструкт гена ХО, описаного вище, може бути забарвлення вважали за явище трансформації. легко використано для клонування в інші вектори. Підтвердження трансформації Плазмідний вектор pHS731 в Е. coli DH5 був встановлювали за допомогою селекції на депонований 22 січня 1997 року в Американське канаміцині, Саузерн-блотингу, PCR (ланцюгової зібрання типових культур (АТСС), 12301 Parklawn полімеразної реакції) і аналізу нащадків. Drive і Rockville MD, USA 20852, під Трансгенне насіння Brassica napus, сорту Westar, реєстраційним номером АТСС 98300. що містив вектор pHS731, одержало номер Виходячи з опублікованого матеріалу [DeLisle 202622 і було депоновано 22 січня 1997 року в A.J., і Crouch, M.L., 1989, Plant Physiology 11:617Американському зібранні типових культур 623]; [Hoglund, A.-S., Т. Rodin, Ε. Larsson, і L (АТСС), [12301 Parklawn Drive, Rockville MD, USA. Rask, 1992, Plant Physiology, 98:509-515] і даних 20852, під реєстраційним номером АТСС результатів щодо napin-промотору, було №97854]. знайдено, що активність триває протягом Потім визначали експресію гена середньої частини терміну вистигання насіння В. холіноксидази у насінні Brassica napus. napus. Регенерували кілька незалежних трансгенних Вектор pHS731 вставляли в штам ліній. Активність ХО виявляли, використовуючи Agrobacterium MP90 стандартним потрійним подвійну ферментативну реакцію. ХО утворює сполученням, після чого виконували альдегід бетаїну з холіну і цей альдегід бетаїну опосередковану Agrobacterium трансформацію може бути легко виявлений за допомогою НАДBrassica. Трансформацію виконували в залежного окиснення його за допомогою БАДГ. основному, як [описано Moloney et al., 1989, Plant НАД відновлення спостерігали за допомогою Cell Reports 8:238-242]. зміни у поглинанні при 340нм. Для того, щоб Штам Agrobacterium tumifaciens стандартизувати аналіз, використовували різну GV3101/pMP90 [Koncz С & Schell; J., 1986, Мої. кількість комерційно доступного ХО (наприклад, Gen. Genet. 204:383-396], що несе бінарний Сігма) і постійну кількість БАДГ штаму Е. соli (50 вектор pHS731, використовували для одиниць; 1 одиниця=1нмоль НАД, відновленого трансформації. Культуру бактерій у стаціонарній за хвилину на мг білка) з БАДГ-надекспресуючого фазі у LB-бульйоні (Діфко, США) (100 мл) бактеріального штаму для стандартизації умов збирали за допомогою центрифугування й реакції і для побудови стандартної кривої, що ХО, ресуспендували у 10мл свіжого LB-бульйону з 1% але не БАДГ, є обмежуючим. Потім виконували DMSO (диметилсульфоксид) (Сігма, США) як аналіз з екстрактами рослин з трансгенних ліній кріопротектор. Аліквоти по 200мкл зберігали при та контролю. БАДГ може бути насиченим або 20°С, доки не використовували для очищеним за допомогою опублікованих способів трансформації, де бактеріальну аліквоту (наприклад, [Falkenberg. P. і Scrom, A.R., 1990, додавали до 2 мл бульйону Brain Heart Infusion Biochemica Biophysica Acta 1034:253-259]). (Діфко, США), що містив 2% цукрозу, 50 мкМ Екстракти рослин одержували наступним ацетосирингону, рН 5,6 й інкубували протягом чином. Листя рослин масою приблизно 100 мг ночі при 28°С. Густина бактеріальних клітин заморожували у рідкому азоті, занурювали у становила приблизно 1 × 109 клітин на мл. льодяний буфер для екстрагування по два об'єми Експлантати сім'ядолей експонували до на масу зразка. Зразки центрифугували при Agrobacterium, що містив вектор для 10000g і супернатант знову піддавали трансформації рослин згідно зі способом центрифугуванню. Центрифугування [Moloney et al., 1989, Plant Cell Rep. 8:238-242]. повторювали, доки жодної часточки не можна Поверхню з боку зрізу черешка експлантатів на було спостерігати. Стосовно насіння, відбирали короткий термін занурювали в культуру бактерій. по 20 насінин на зразок і після першого Експлантати переносили у ко-культиваційне центрифугування додавали 20мг активованого середовище так, що поверхня з боку зрізу вугілля й продовжували процедуру. Буфер для торкалася середовища. Десять експлантатів екстрагування, що мав рН8,0, яке створювали додаванням КОН, містив на 100мл 1,92г HEPES, поміщали в кожну 100 15мм чашку Петрі. Ко0,2мл 0,5мΜ EDTA, 10мл гліцерину й культиваційні чашки герметично закривали деіонізованої води, щоб довести об'єм до 100мл. пластиковою плівкою Stretch'n Seal™. Чашки Перед проведенням аналізу додавали DTT з 1Μ інкубували протягом трьох днів у камері для маточного розчину до кінцевої концентрації 25мМ зростання з умовами температури й і додавали повний набір інгібіторів протеаз фотоперіоду, як описано вище, стосовно етапу [Boehringer-Mannheim, Каталог №1697-498] з пророщування насіння. Експлантати потім 10мΜ маточного розчину буфера HEPES. Буфер переносили на селективне середовище. для ферментативного аналізу (буфер БАДГ) Після 3—4 тижнів у селективному середовищі містив 50мМ HEPES-KOH, рН8,0, 1мМ EDTA і регенеровані зелені паростки (вихідні свіжедоданий DTT до 1мМ кінцевої концентрації. трансформанти) вирізали й переносили на свіже Подвійний аналіз виконували в реакційній селективне середовище для тривалого росту. композиції, що містила 50мкл буфера БАДГ, Коли паростки досягали довжини 1,5-2,0см, їх 50мкл 10мМ маточного розчину НАД, 50мкл переносили на середовище для проростання зразку рослини, 30мкл або еквівалент з коренів. Вихідні трансгенні паростки піддавали 53 75562 54 утворенням 50 Одиниць БАДГ і деіонізовану воду БАДГ. для створення об'єму 450мкл. Поглинання Експресія гена бетаїн альдегіддегідрогенази спостерігали при 340нм протягом 20 хвилин, в насінні Brassica napus. Виділяли ген БАДГ Е. потім додавали 50мкл хлориду холіну й coli (betB) і готували для насіння-специфічної спектрофотометричне дослідження тривало від експресії за допомогою сполучення з napin10 до 20 хвилин. промотором В. napus [Boyd et al., Gene 103:45-52 З метою побудови стандартної кривої зразок (1990)]. Плазміду RD400 [Datla, R.S.S., рослини не використовували й замість цього Hammerlindl, J.K.. Panchuk, В., Pelcher, L.E., і додавали різну кількість очищеного ХО. Keller, W., 1992, Gene 211:383-384] Підраховували одиниці, використовуючи використовували як вектор, з якого одержували спектрофотометр з програмним управлінням типу кінцеву похідну pHS974, що містила в межах Beckman DU65. Фахівець у галузі може правих і лівих кінців Т-ДНК відкриту рамку модифікувати протоколи під наявне обладнання, зчитування betB - з його ATG-сайту під контролем використовуючи біохімічні дані, що існують в експресії napin-промотору й поліА сигналу вірусу літературі стосовно коефіцієнта екстинкції НАД. мозаїки цвітної капусти. Napin-betB-ПоліА касета Відновлення НАД саме по собі є стандартним (3,3 т.п.н.р) містила у вказаній послідовності: сайт аналізом, виконується для дегідрогеназ. Hindlll, Nарin-промотор, BamHI сайт, betB ORF, Приклад 5: Дослідження трансгеного насіння EcoRI сайт-ПоліА сигнал вірусу мозаїки цвітної на зменшений рівень фенольних сполук капусти ДНК, сайт Kpnl і сайт EcoRI. NарinУ цьому прикладі насіння досліджували на промотор був від Kohno-Murase et al. [Plant рівень синапіну. Насіння з трансгенних рослин, Molecular Biology, 26:115-1124, 1994] і ПоліА одержаних в Прикладі 4, вирощували для того, сигнал був спочатку з плазміди pJIT117 щоб одержати самозапилених нащадків, і лінії [Guerineau, F., Woolston, S., Brooks, L. і цих нащадків досліджували на сегрегацію або Mullineaux, 1988, Nucleic Acids Research 16:11380]. Кінцева плазміда pHS981 15 т.п.н. відсутність трансгенного кодування активності наведена на Фіг.14. Цю плазміду уводили в глюкуронідази (GUS). Цей ген [див. Datla, R.S.S., Agrobacterium tumefaciens GV3101 [рМР90] Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L., і G. [Koncz, С, і Schell, J., 1986, Molecular і General Selvaraj, 1991, Gene 101:239-246] присутній в Genetics 204: 383-396] і штам, що утворився, межах правого й лівого кінця т-ДНК-вектора використовували для генетичної трансформації pHS731 і, таким чином, є зручним маркером при Brassica napus. генетичному аналізові сегрегації. Відсутність Одержували кілька трансгенних ліній і генетичної сегрегації свідчило про гомозиготну насіння на різних стадіях розвитку досліджували природу рослини, з якої походять нащадки. Ті на активність БАДГ. Активність БАДГ була ліній, що виявили сегрегацію, були гемізиготами, максимальною десь на 35 ДПЗ, і стигле насіння й сегреганти, що не мали активності GUS, залишало остаточну активність. Специфічна залишали як контроль, що не містив гена ХО. активність як функція стадії вистигання показала, Таким чином, були відібрані гомозиготні лінії, що що початок активності БАДГ співпадає з синтезом містили ХО, та лінії, що не містили трансгена. Ці синапіну. лінії досліджували на рівень синапіну за Лінії, що експресують ген БАДГ, схрещували допомогою протоколу HPLC. Результати, з лініями, що несли ген ХО, що описано у представлені на Фіг.13, показують, що трансгенні Прикладі 4. Рослини, що містили ген ХО, і сегреганти мають значно зменшену кількість рослини, що містили гени БАДГ і ХО, синапіну в порівнянні з їх нетрансгенними досліджували на рівень синапіну і загальний аналогами. Нетрансгенні сегреганти краще рівень фенольних сполук. Ці результати показані піддаються контролю, оскільки вони походять від на Фіг.15 (рівень синапіну) і Фіг.16 (загальний однієї вихідної трансгенної рослини. Ці рівень фенольних сполук). Досліджене насіння результати показують використання описаного збирали з рослин та культивували у польових способу. Для фахівця у галузі є очевидним той умовах влітку 1999. Як показано на Фіг.15, факт, що різна кількість зменшення може сполучена активність ХО і БАДГ призводила до супроводжуватись зміною кількості, часу й подальшого зменшення накопичення синапіну під розташування експресії гена, а також пошуком час активності лише одного ХО. Як показано на корисних різновидів серед окремих трансгенних Фіг.16, відбувається зменшення у загальному ліній, що виявляють бажані результати завдяки вмісті фенольних сполук в трансгенних рослинах різноманітним причинам, до яких належать відносно контролю. розташування та кількість копій. Приклад 7:Нуклеотидна послідовність Приклад 6. Створення захищеного від стресу синтетичного гена декарбоксилази ферулової продукту за допомогою зміни попередника кислоти. всередині фенілпропаноїдного шляху. У цьому прикладі опубліковану послідовність У цьому прикладі синтезували бетаїн як декарбоксилази ферулової кислоти з Bacillus захист від стресу за допомогою сполучної pumilus [Zago et al., Applied і Environmental активності ХО і БАДГ, обидва під контролем Microbiology 61:4484-4486, 1995] використовували насіння-селективного промотору. Як і у першій для створення гена, оптимізованого для експресії частині цього прикладу, були створені трансгенні в клітинах рослин. Відкриту рамку зчитування Brassica napus, що несуть ген БАДГ під декарбоксилази ферулової кислоти синтезували контролем-насіння селективного промотору. за допомогою сполучення синтетичних Виконували аналіз цих рослин на експресію 55 75562 56 олігонуклеотидів, що базуються на опублікованій стандартними протоколами. послідовності. Олігонуклеотиди синтезували, Рестрикційна мапа вектора наведена на базуючись, головним чином, на переважних Фіг.19. Вектор pGS97b3, як показано на Фіг.19, кодонах надекспресованих генів Brassica napus. такий самий, як і pHS731, за винятком Синтетичні олігонуклеотиди мали довжину наступного. На такій ж самій векторній основі приблизно 60 нуклеотидів. Будова pHS731 Hindlll-napin P-BamHI касету заміщали на олігонуклеотидних дуплексів включала на 5'-кінці касету: 35S промотор вірусу мозаїки цвітної BamHI-липкий кінець (5' GATC-) і EqoRI липкий капусти-лідерна послідовність вірусу мозаїки кінець (3'-ТТАА-5') на 3'-кінці. Збирали окремі люцерни [описана в R.S.S. Datla, F. Bekkaoui, J. дуплекси і утворювалась відкрита рамка K. Hammerlindl, G. Pilate, D.I. Dunstan and W.L. зчитування на повну довжину з 5' ВатНІ і 3і EcoRI Crosby. Improved high-level constitutive foreign сайтами. Реакції зв'язування проводили згідно зі gene expression in plants using an AMV RNA4 стандартними протоколами. Продукти untranslated leader sequence, Plant Science 94: зв'язування, у свою чергу, зв'язували у вектор 139-149, 1993]. Ця частина промотора одержала для клонування. скорочену назву 35S на Фіг.19. Після 35S При приєднанні вищезгаданого синтетичного знаходиться відкрита рамка зчитування гена у BamHI-EcoRI розщеплювану pBluescript декарбоксилази ферулової кислоти, з'єднана за SK- (Statagene), клони з 0,5 т.п.н. вставкою допомогою ВатНІ на 5'-кінці і EcoRI на З'-кінці визначали за допомогою скринінгу плазміди ДНК замість відкритої рамки зчитування ХО pHS731. з клонів Е. соli. Потенційних кандидатів піддавали Були відкриті трансгенні рослини, що скринінгу й визначали нуклеотидну послідовність експресували ген декарбоксилази ферулової двох з клонів. Було знайдено, що кожний з клонів кислоти. Рослини досліджували на рівень мав точкову мутацію, і ці дві точкові мутації були фенольних сполук і вивільнення вінілгваяколу. різними за розташуванням в двох вибраних Використовуючи Вестерн-блот аналіз з клонах. Відстань між цими мутаціями дозволяла використанням поліклональних антитіл проти реконструювати інтактний ген, сполучаючи дві декарбоксилази ферулової кислоти, було немутовані частини гена з цих клонів. Цей клон знайдено, що незалежні трансгенні рослини одержав назву pGS97b1. Нуклеотидна тютюну, що несуть ген декарбоксилази послідовність цього синтетичного гена наведена ферулової кислоти, містять імунореактивний на Фіг.17. Передбачувана послідовність поліпептид передбачуваного розміру. амінокислот наведена на Фіг.18. Нетрансформовані рослини не мали Функціональність синтетичного гена була імунореактивного пептиду. Це підтверджує факт перевірена за допомогою простого тесту. трансгенної експресії білка декарбоксилази Декарбоксилаза ферулової кислоти перетворює ферулової кислоти в цих трансгенних рослинах. ферулову кислоту на 4-вінілгваякол (4-VG). 4-VG Приклад 9: Генетична трансформація має певний запах гвоздик і вважається за єдину рослини, що містить ген, який кодує найважливішу сполуку, що передає натуральний декарбоксилазу ферулової кислоти під аромат гвоздик. Штам Escherichia coli з pGS97b1 контролем тканино-селективного промотору. при вирощуванні у присутності 1мМ ферулової У цьому прикладі фермент — кислоти у середовищі для зростання дає чіткий декарбоксилазу ферулової кислоти, клоновану в запах гвоздики, тоді як культура без ферулової pGS97b1, вставляли у вектор RD400 для кислоти або культура штаму лише з вектором не трансформації рослин. Ген декарбоксилази мала запаху. HPLC аналіз культур, що поглинали ферулової кислоти розміщували під контролем ферулову кислоту, підтвердив зникнення насіння-специфічного napin-промотору з В. napus ферулової кислоти. Виходячи з вищезгаданих і потім плазміду використовували для результатів, можна зробити висновок, що трансформування рослин тютюну згідно зі функціональний ген клонований в pGS97b1. стандартними протоколами. Рестрикційна мала Приклад 8: Генетична трансформація вектора наведена на Фіг.20. Вектор pGS97b2, як рослини, що несе ген, який кодує декарбоксилазу показано на Фіг.20, такий самий як і pGS97b3, за ферулової кислоти під контролем винятком того, що на тому ж самому векторі конститутивного промотору Hindlll-35S-BamHI касета була заміщена на У цьому прикладі фермент — Hindlll-napin промотор-ВатНІ касету, показану на декарбоксилазу ферулової кислоти, клоновану в Фіг.12 для pHS731. Були відкриті трансгенні pGS97b1, вставляли у вектор для трансформації рослини, що експресували ген декарбоксилази рослин RD400 [Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., ферулової кислоти. Рослини досліджували на Panchuk, В., Pelcher, L.E., and Keller, W., 1992, рівень фенольних сполук і вивільнення Gene 211:383-384], який був модифікований вінілгваяколу. таким чином, щоб замість NosP-Mptll рослинаПриклад 10. Визначення тканинної селективний маркер RD400 містився злитий ген специфічності й накопичення в насінні фітинової між gus і npt (Gus:npt). Gus-npt був описаний кислоти під час вистигання насіння хрестоцвітої попередньо [Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., рослини, Brassica napus. Pelcher, L.E., Crosby, W.L. і G. Selvaraj, 1991, Біосинтез фітинової кислоти. Gene 211: 239-246]. Ген декарбоксилази У цьому прикладі дані стосовно ферулової кислоти розміщували під контролем біосинтетичного шляху фітинової кислоти 35S промотору й плазміду використовували для визначали у насінні Brassica. Оскільки фітинова трансформування рослин тютюну згідно з кислота є гексафосфатною похідною міоінозиту 57 75562 58 (фітинова кислота позначається як ІР6), (Фіг.22). Сім'ядолі містять майже 90% фітинової визначали співвідношення окремих кислоти насіння і 10% присутні в осі зародків. Ці фосфорилованих похідних міоінозиту (наприклад дослідження дозволяють припустити, що різні ІP1, ІР2, ІР3, ІР4 і IP5) із загальних похідних ембріональні тканини є найбільш переважними фосфорилованого інозиту. Чисту фітинову тканинами-мішенями для зменшення рівня кислоту, частково зруйновану за допомогою фітинової кислоти за допомогою генетичної аутоклавування для одержання різних модифікації біосинтезу фітинової кислоти. фосфорилованих похідних, використовували як Приклад 11. Визначення метаболізму стандарт для аналізу HPLC, проведеного згідно з міоінозиту в тканинах насіння, що вистигає. Vernon і Bohnert [1992. The EMBO Journal Цей приклад ілюструє частину пулу 11:2077-2085) і Vernon DM, Tarczynski MC і міоінозиту, що використовується для біосинтезу Jensen RG і Bohnert HJ, (1993. The Plant Journal фітинової кислоти. Хоча міоінозит є 4: 199-205]. попередником синтезу фітинової кислоти у Різні форми фосфорилованого інозиту рослин, він також використовується в інших (наприклад ІР1, ІР2, ІР3, ІР4 і IP5) і фітинової анаболічних шляхах для одержання кислоти легко розрізнялися за допомогою цього фосфатидилінозиту й компонентів клітинної аналізу. Лише один пік був знайдений, і стінки. Цей приклад ілюструє частину загального відповідав ІР6 (тобто, фітиновій кислоті), коли пулу міоінозиту, що використовується для аналізували зразки інозитфосфату, біосинтезу фітинової кислоти в насінні, що екстрагованого з насіння Brassica, що вистигало. вистигає. Мічення насіння Brassica in vivo, Цей результат показав, що ІР6 є головною використовуючи 3Н-міоінозит, застосовували для формою інозитфосфату в насінні, що вистигає, і спостерігання розповсюдження інозиту в різних що інші проміжні фосфориловані форми інозиту фракціях, що екстрагували різними не можна було виявити за допомогою HPLC розчинниками. Спосіб, що використовували для описаними способами. Таким чином, вважається, імпульсного мічення насіння in vivo, що вистигає, 3 що біосинтез фітинової кислоти з міоінозиту Н-міоінозитом, описаний наступним чином. відбувається швидко й головним чином кількісно. Видаляли стручки на різних стадіях розвитку, і Біосинтез фітинової кислоти під час кінець із розрізом відразу ж переносили у 10 мл вистигання. стерильного культурального середовища, що У цій частині прикладу визначали містило 5мкКі 3Н-міоінозиту у 50-мл пробірці, і накопичення фітинової кислоти протягом культивували за стандартних умов для росту вистигання насіння. Способи визначення рівня (20°С протягом 16 годин у світлі, 15°С протягом 8 фітинової кислоти в насінні були наступними: годин без світла) протягом двох днів. Насіння Насіння перетирали у ступці в присутності збирали для екстрагування ліпідів, фітинових рідкого азоту і порошок переносили у 15-мл кислот, компонентів трифтороцтової кислоти стерильну пробірку, що містила 5мл 0,5Μ НСІ. (ТРА)-розчинної клітинної стінки й уламків Після видалення ліпідів за допомогою клітинної стінки. Радіоактивність визначали в екстрагування гексаном фазу, що залишилась кожній фракції за допомогою рідинного (водну фазу із залишками тканини) обробляли сцинтиляційного лічильника. ультразвуком протягом 90 секунд на рівні 3 Виконували чотири типи екстракцій з насіння ультразвуковим рідинним процесором [Model з імпульсним міченням для відокремлення XL2020, Heat Systems, Inc., Фармінгдаль, штат водорозчинних клітинних компонентів (для Нью-Йорк, США]. Після центрифугування рідину аналізу фітинової кислоти), гексанрозчинних переносили у свіжу пробірку для аналізу (аналізу ліпідів), трифтороцтова кислота (TFA)фітинової кислоти за допомогою HPLC. Цей розчинних компонентів клітинної стінки й уламків спосіб застосовували до насіння на різних стадіях клітин. На Фіг.23 представлено середню стиглості. радіоактивність в кожній фракції на різних стадіях Накопичення фітинової кислоти протягом розвитку насіння. Дані свідчать, що більш ніж вистигання насіння наведено на Фіг.21. Хоча 20% загального рівня мітки в насінні знаходиться фітинову кислоту спочатку можна спостерігати в в ліпідній фракції на 25-30 днях після запилення насінні на дуже ранніх стадіях (тобто 12 днів (ДПЗ). Радіоактивність у фракціях клітинної стінки після запилення), рівень її значно не (TFA-розчинної клітинної стінки й уламків клітин) підвищується до 22 днів після запилення. становить приблизно 5% загального рівня мітки, Протягом 10-добового періоду після її першої включеної протягом розвитку насіння. появи фітинова кислота досягає максимального Радіоактивність у водорозчинній фракції надалі рівня приблизно 240мкг/насіння. Рівень фітинової аналізували за допомогою HPLC для визначення кислоти відносно сухої маси стиглого насіння частини фітинової кислоти. Було знайдено, що становив приблизно 3,2%. Ці результати приблизно 10% мітки у водорозчинному екстракті вказують, що зменшення кількості фітинової знаходиться у піці фітинової кислоти й приблизно кислоти через взаємодію з біосинтезом фітинової 30% мітки знаходилось у піці ін'єкції зразка, який кислоти потребує промотору, що здатний є вільним міоінозитом. Інший мічений матеріал, експресувати ген приблизно з 12 ДПЗ до присутній у водорозчинному екстракті, виділяли у достигання насіння. пре- і пост-піках фітинової кислоти, що Подальшій аналіз показав, що фітинова представляють невизначені сполуки. кислота головним чином накопичується в Відсоток метаболізованої мітки, знайденої у ембріональній тканині більш ніж в насінній шкірці фракціях фітинової кислоти, ліпідів, TFA 59 75562 60 розчинної клітинної стінки й уламків клітин, відповідні сайти вектора pSPORT з утворенням наведений на Фіг.3. Приблизно 30% мітки з 3НpSportlMT. На Фіг.24 (Послідовність I.D. No.5) міоінозит-похідних метаболітів знаходиться в показано послідовність ампліфікованого фітиновій кислоті на 20—30 ДПЗ. Одночасно, фрагменту ДНК, який є ідентичним опублікованій приблизно 60% мітки були присутні в ліпідах послідовності ІМТ ДНК за винятком двох основ у (інозитвмісних фосфоліпідах) і менш, ніж 10% у 3'-нетрансльованій ділянці. Передбачувана фракції клітинної стінки. послідовність білка є ідентичною опублікованим Таким чином, частина загального пулу даним від GeneBank. міоінозиту, що використовується для біосинтезу Приклад 13: Створення векторів для фітинової кислоти, становить приблизно 30% у трансформації рослин, що містить ген, який кодує період розвитку насіння, коли біосинтез фітинової фермент, здатний діяти на міоінозит: кислоти є максимальним. використання гена міоінозит ОПриклад 12. Клонування гену, що кодує метилтрансФерази Aizoaceae. фермент, здатний діяти на міоінозит. Цей приклад ілюструє створення вектора для У цьому прикладі виділяли ген, здатний діяти трансформації рослин, що містить ген, здатний на міоінозит. Геном був ген інозит О-метилдіяти на міоінозит під контролем промотору, трансферази із звичайних рослин родини активного в клітинах рослин. Наведений вектор Aizoaceae. Клонування з використанням для трансформації рослин містить ген міоінозит зворотної транскриптази використовували для О-метилтрансферази під контролем промотору, виділення гена, як описано нижче. Стандартні активного у клітин насіння, тобто 35S промотор. процедури з ДНК виконували згідно з [Maniatis Вектор створювали наступним чином: pSportlMT et.al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold розщеплювали Barn НІ і Eco RI для вивільнення Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]. гена ІМТ. Фрагмент гена ІМТ клонували в Загальну РНК екстрагували з оброблених відповідні сайти pBluescript SK(-), [Strategene, La 500мМ NaCI тканин листя Aizoaceae і очищали Jolla, CA.] і плазміда, що утворилася, одержала полі (А)+РНК. Цю мРНК використовували для назву pBluelMT. рВІиеІМТ розщеплювали Spe І і зворотної транскрипції за допомогою Superscript клонували у вектор рВІ 221 (ClonTech), II Reverse Trancriptase (Promega, Madison, Wl.) за попередньо розрізаний Хbа І. Вибирали плазміду, наступних умов: три мкг мРНК, розчинені в 20мкл що містила ген ІМТ у правильній орієнтації води, використовували як матрицю. РНК відносно 35S промотору в рВІ 221, і денатурували за допомогою нагрівання при 65°С розщеплювали Hind III і Eco RI. Фрагмент 35Sпротягом 5 хвилин, потім охолоджували на льоді. ІМТ - Nos термінатор переносили у pRD 400, що До композиції додавали 3мкл оліго-дТ привело до створення вектора для (500мкг/мл), 8мкл 5X буфера зворотної трансформації рослин p35SIMT. транскриптази, 4мкл 0,1Μ DTT, 2мкл 10мМ Конструкт, що утворився, p35SIMT, містить дНТФатів. Суміш нагрівали до 42°С, потім касету: 35S промотор-ІМТ-GUS-Nos термінатор у додавали 3мкл (60 одиниць) зворотної pRD400 і показаний на Фіг.25. транскриптази Supertranscript II. Реакцію Приклад 14: Створення векторів для виконували протягом однієї години при 42°С. трансформації рослин, що містять ген, який кодує Після цього періоду часу, додавали 1мкл РНКази фермент, здатний діяти на міоінозит під Η (1,5О/мкл) і реакцію виконували протягом 30 контролем насіння селективного промотору. хвилин при 37°С. КДНК, що утворилася, У цьому прикладі створювали ген, що кодує використовували як матрицю для PCR за фермент, здатний діяти на міоінозит під допомогою Vent полімерази за наступних умов: контролем насіння-селективного промотора, у реакцію PCR виконували у 100мкл об'єму з векторі для трансформації рослин. Геном, що циклами, що складаються з 94°С протягом використовували, був ген міоінозит Охвилини, 55°С протягом хвилини, 72°С протягом метилтрансферази й промотором був насінняхвилини з 2-секундними подовженнями протягом селективний napin-промотор. Вектор одержав кожного циклу в загальних 30 циклах. Праймери, назву pNIMT. що використовували в цій реакції, були основані Вектор pNIMT будували наступним чином: на опублікованій послідовності ІМТ ДНК Spe І-розщеплений фрагмент IМГДНК (Приклад (GenBank реєстраційний номер М87340). 4) лігували у pDHI [napin-промотор, як [описано Переднім праймером, що використовували, була Kohno-Murase et al., 1994, Plant Molecular Biology, послідовність I.D. No.6: 26:1115-1124]) у Xbet I сайт, що привело до 5 'TTTTTGGATCCATGACTACTTACACAATGG утворення касети napin-промотор-IMT-Nos CAACTACA3' термінатор. Цю експресійну касету далі яка містить сайт BamHI на 5'-кінці переносили у pRD400. Вектор, що утворився, (підкреслено). Заднім праймером, що наведений на Фіг.26. використовували, була послідовність I.D. No.7: Приклад 15: Трансформація Brassica napus 5 'TTTTTTTTGCGGCCGCATAAAGGCAAATCA (Westar) за допомогою P35SIMT. TACACTG3' Вектор p35SIMT вставляли в штам яка містить сайт Notl на 5'-кінці (підкреслено). Agrobacterium MP90 за допомогою стандартного Ампліфікований фрагмент ДНК потрійного сполучення, після чого виконували розщеплювали ВатН І і Not І і потім субклонували опосередковану Agrobacterium трансформацію в pSPORT 1 (BRL, Bethesda, MD). Розщеплений Brassica. Трансформацію виконували, як описано Bam HI, Mot I фрагмент PCR клонували у у Прикладі 4. Одержували рослини,