Номер патенту: 113493

Опубліковано: 10.02.2017

Автори: Расел Шон, Петоліно Джозеф Ф.

Формула / Реферат

1. Спосіб видалення ділянки ДНК в рослині, згідно з яким:

надають першу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК і першу послідовність розпізнавання, що фланкує 3'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'-кінець ділянки ДНК, де перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання ідентичні;

вводять ДНК, яка кодує нуклеазу "цинкові пальці" у другу життєздатну рослину, в якій нуклеаза ″цинкові пальці" сконструйована таким чином, щоби розщепити геномну ДНК в послідовності розпізнавання, і де нуклеаза ″цинкові пальці″ функціонально зв′язана з тканиноспецифічним промотором, специфічним для стадії розвитку;

схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що насінина F1 продукується або на першій, або на другій життєздатній рослині, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК насінини F1; і

вирощують одержувану рослину F1, що містить геномну ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК пилку і/або насінини рослини F1.

2. Трансгенна рослина, отримана способом за п. 1, де трансгенна рослина містить ділянку ДНК в тканині, відмінній від пилку і/або насінини.

3. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить:

промотор; і

послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу "цинкові пальці", де промотор функціонально пов'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу "цинкові пальці", де промотор вибраний з групи, яка складається з: промотору, специфічного для пилку, промотору, специфічного для насіння, і промотору, специфічного для стадії розвитку, і де послідовність нуклеїнової кислоти фланкована сайтами розщеплення нуклеази "цинкові пальці", де молекула являє собою вектор.

4. Спосіб одержання трансгенної рослини, за яким:

трансформують рослинну клітину або рослинну тканину виділеною молекулою нуклеїнової кислоти за п. 3; і

регенерують цілу рослину.

5. Спосіб видалення ділянки ДНК в рослині, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, за яким:

надають першу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнаваної нуклеазою "цинкові пальці";

надають касету експресії гену селектованого маркера;

надають другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка розпізнається нуклеазою "цинкові пальці", де селектований маркер фланкований першою і другою послідовностями нуклеїнової кислоти, які розпізнаються нуклеазою "цинкові пальці", і де перша послідовність нуклеїнової кислоти і друга послідовність нуклеїнової кислоти фланковані гомологічними послідовностями;

вводять нуклеазу "цинкові пальці" у життєздатну рослинну клітину, де нуклеаза "цинкові пальці" сконструйована для розщеплення геномної ДНК в першій та другій послідовностях нуклеїнових кислот;

експресують нуклеазу "цинкові пальці" тканиноспецифічним або специфічним для стадії розвитку чином; і

застосовують нуклеазу "цинкові пальці" для видалення ділянки ДНК в пилку і/або насінині рослини,

в результаті чого селектований маркер відсутній в геномній ДНК в пилку і/або насінині рослини.

6. Спосіб за п. 5, в якому кожну половину мономера нуклеази "цинкові пальці" експресують окремо, і при з'єднанні одна з одною вони разом утворюють функціональний комплекс.

Текст

Реферат: Винахід стосується способу видалення ділянки ДНК в рослині згідно з яким: надають першу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК і першу послідовність розпізнавання, що фланкує 3'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'-кінець ділянки ДНК, де перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання ідентичні; вводять ДНК, яка кодує нуклеазу "цинкові пальці" у другу життєздатну рослину, в якій нуклеаза "цинкові пальці" сконструйована таким чином, щоби розщепити геномну ДНК в послідовності розпізнавання, і де нуклеаза "цинкові пальці" функціонально зв′язана з тканиноспецифічним промотором, специфічним для стадії розвитку; схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що насінина F1 продукується або на першій, або на другій життєздатній рослині, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК насінини F1; і вирощують одержувану рослину F 1, що містить геномну ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК пилку і/або насінини рослини F1. UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДОМАГАННЯ НА ПРІОРИТЕТ Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою патентною заявкою США, № 61/297628, зареєстрованою 22 січня 2010 року, що має назву «Вирізання трансгенів в генетично модифікованих організмах». ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Винахід загалом стосується композицій і способів створення трансгенних рослин. У певних варіантах здійснення трансгенні рослини містять один або більше трансгенів, що представляють інтерес. У певних варіантах здійснення управляють вирізанням трансгену (трансгенів) в пилку і/або насінні, так що пилок і/або насіння, вироблене трансгенною рослиною винаходу, в основному не містить трансгену (трансгенів). У деяких варіантах здійснення трансгенні рослини винаходу корисні, наприклад, для досягнення біоутримання трансгену (трансгенів), що представляють інтерес, в трансгенній рослині. В інших варіантах здійснення вирізання трансгену направлене на специфічну касету експресії, наприклад, на селектований маркер, так що тільки вказана касета експресії видаляється з трансгенної рослини і/або потомства трансгенної рослини. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Багато які рослини генетично трансформують за допомогою генів інших видів для надання їм бажаних властивостей, а саме, щоб збільшити сільськогосподарську цінність завдяки, наприклад, поліпшенню якості харчової цінності, збільшенню врожайності, наданню стійкості до шкідників або захворювань, збільшенню стійкості до засухи і стресу, поліпшення плодових якостей, таких як пігментація і ріст, і/або наданню стійкості до гербіцидів; забезпеченню можливості продукції промислово застосовних сполук і/або матеріалів з рослин и; і/або забезпеченню можливості продукції лікарських засобів. Введення клонованих генів в рослинні клітини і відновлення стабільно плодоносних трансгенних рослин може бути використане д ля отримання таких модифікацій рослини, і забезпечує бажані ознаки або якості, які представляють інтерес, які повинні бути включені в рослини за допомогою генної інженерії (наприклад, поліпшення культури). У вказаних способах чужорідну ДНК звичайно вводять в ядерну або пластидну ДНК еукаріотичної рослинної клітини з подальшим виділенням клітин, що містять чужорідну ДНК, інтегровану в клітинну ДНК, для отримання стабільно трансформованих рослинних клітин. Один недолік, який виникає в зв'язку із застосуванням трансгенних рослин, полягає в можливості витоку трансгенів до диких видів і нетрансформованих видів. Вказані ознаки можуть збільшувати ризик ауткросингу, персистенції і інтрогресії трансгенів в сусідній популяції. Витік трансгенів з генетично модифікованих (GM) сільськогосподарських культур звичайно відбувається завдяки потоку генів, головним чином за допомогою перехресного запилення (Lu (2003) Eviron. Biosafety Res. 2:3-8), але також може відбуватися в результаті інтрогресії. Stewart Jr. et al. (2003) Nat. Reviews Gen. 4:806-17. Потік генів від культури до культури буде приводити до контамінації не-GM сортів, впливаючи на стратегічне розставляння трансгенних і нетрансгенних сортів сільськогосподарських культур в даній сільськогосподарській системі. Значна контамінація не-GM культур трансгенним матеріалом викликає складності в міжнародній торгівлі в зв'язку з юридичними обмеженнями на імпорт трансгенних продуктів багатьма країнами. Потік генів від культури до культури може спричинити накопичення трансгенів в гібридах, які потенційно можуть стати самозасівними бур'янами, якщо трансгени надають множинну стійкість (наприклад, до гербіцидів, шкідників і/або захворювань). Крім того, потік генів від культури до культури може привести до витоку трансгенів в популяції бур'янів або споріднених диких видів, що може являти собою серйозні проблеми з бур'янами і інші екологічні ризики, якщо трансгени зберігаються і фіксуються в бур’янових/диких популяціях внаслідок статевого розмноження і/або вегетативного розмноження. Це має особливо велике значення, якщо «гени, що вислизнули» посилюють екологічну пристосованість бур’янових/дикий видів. Інтрогресія трансгену сільськогосподарської культури відбувається під час стадій, що залучають декілька послідовних гібридних поколінь. Інтрогресія є динамічним процесом, який відбувається протягом багато років і поколінь, перш ніж трансген закріпиться в спадковості отримуваних видів і, таким чином, викликає складності у визначенні і моніторингу. Однак якщо відбір є суворим і/або розмір популяції є невеликим, закріплення інтрогресивного гену може відбуватися стрімко. Обмеження специфічної касети експресії в межах генетично модифікованих рослин, особливо касети експресії селектованого маркера є важкодосяжною метою. Гени селектованого маркера звичайно являють собою гени стійкості до антибіотиків або до гербіцидів, але можуть включати репортерні гени (тобто β-глюкуронідаза (Graham et al. (1989) Plant Cell Tiss. Org. 20(l):35-39). Селектовані маркери, які спільно переносять в геном рослини, забезпечують селективну перевагу і дозволяють провести ідентифікацію стабільно трансформованих 1 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансгенних рослин. Доступність функціональних генів селектованих маркерів, які можуть бути використані для трансформації рослин, до деякої міри обмежена. Огляд опублікованої наукової літератури по трансгенних сільськогосподарських культурах показує, що селективні агенти стійкості до антибіотиків, що найбільш широко застосовуються, являють собою агент стійкості до канаміцину (що кодується геном неоміцин-фосфотрансферази типу II (Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-187)) або до гігроміцину (що кодується геном гігроміцин-фосфотрансферази (Waldron et al, Plant Mol. Biol. 5: 103-108)), і стійкість до гербіцидів є стійкістю до фосфінотрицину (що кодується генами pat (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37) або bar (DeBlock et al. (1987), EMBO J. 6 (9):2513-2518)). Див. Sundar et al. (2008) J. Plant Physiol. 165: 1698-1716. Беручи до уваги обмежене число генів селектованих маркерів, і практичне використання ряду параметрів цих ознак, рішення, яке дозволяє вирізання і повторне застосування селектованих маркерів, в трансгенній рослині усувало б потребу в додаткових селектованих маркерах в послідовних раундах перенесення генів або стекінгу генів в тій же самій рослині. Крім того, можливість вирізати селектований маркер може подолати непередбачені зміни транскриптому рослини, які викликаються експресією маркера (Abdeen et al. (2009) Plant Biotechnol. J. 7(3):211-218). Сучасні стратегії запобігання або мінімізації потоку генів між GM-культурами і іншими видами і сортами включають: (1) фізичну ізоляцію трансгенної культури; (2) хлоропластний інжиніринг трансгенів; (3) до-інжиніринг гену ослаблення разом з трансгеном; (4) генетичне використання рестрикційних технологій (GURT); (5) CRE/loxP і FLP/FRT рекомбіназаопосередковану делецію гену. Див., наприклад, Lee and Natesan (2006) TRENDS Biotech. 24(3): 109-14; Lu (2003), вище; і Luo et al. (2007), Plant Biotech. J. 5:263-74; і (6) мегануклеазаопосередковану делецію генів. Див., наприклад, патентну заявку США № 11/910515; і патентну заявку США № 12/600902. Рекомбінази CRE, FLP і R використовували для видалення небажаного генетичного матеріалу з рослин. Hare і Chua (2002) Nat. Biotech. 20:575-80. Luo et al. (2007), вище описали специфічну до пилка і насіння систему "GM-gene-deletor", в якій застосування гібридних послідовностей oxP-FRT як сайтів розпізнавання для видалення трансгенів рекомбіназою CRE або FLP приводило до делеції трансгенів з пилка, або пилка і з насіння трансгенних рослин тютюну. Всі ці сайт-специфічні рекомбіназні системи, що виявили функціональність в рослинах, є членами сімейства інтеграз. Вказані системи вибрані для застосування, щонайменше частково, внаслідок того, що інші рекомбінази можуть мати потребу у допоміжних білках і більш складних сайтах розпізнавання, що може накласти топологічні обмеження на ефективність рекомбінації. Id. Вказані системи мають декілька істотних недоліків: рекомбінази типу інтеграз також можуть розпізнавати "псевдопослідовності", які можуть сильно відрізнятися від специфічної послідовності-мішені і в наслідок цього викликати небажані неспецифічні делеції ДНК; і при вирізанні послідовності-мішені залишається залишкова послідовність розпізнавання, яка може являти собою сайти хромосомних реаранжирувань після послідовної обробки рекомбіназою, або активувати механізми сайленсингу генів. Id. Крім того, вказані системи додатково обмежені, оскільки функціональна рекомбіназа повинна бути представлена і експресована в одній з батьківських рослин, присутність якої вимагає додаткових стратегій делеції при наявності в пилку і/або насіння. Незважаючи на вказані обмеження, система CRE/loxP вважається найбільш прийнятною стратегією оптимізації делеції генів в рослинах. Id. Сконструйовані на замовлення нуклеази «цинкові пальці» (ZFN) являють собою білки, розроблені для внесення направленого сайт-специфічного дволанцюжкового розриву в ДНК, з подальшою рекомбінацією розщеплених кінців. ZFN об'єднують в собі домен неспецифічного розщеплення ендонуклеази рестрикції FokI з ДНК-зв'язувальними білками "цинкові пальці". Див., наприклад, Huang et al. (1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-60; Kim et al. (1994) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12875-9; Kim et al. (1997c) Gene 203:43-9; Kim et al. (1998) Biol. Chem. 379:489-95; Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26: 1233-9; Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81. Індивідуальні мотиви «цинкові пальці» можуть бути розроблені для виявлення і зв’язування з великим набором сайтів ДНК. Білки «цинкові пальці» Cys 2His2 зв'язують ДНК шляхом введення -спіралі у велику борозенку подвійної спіралі. Розпізнавання ДНК «цинковими пальцями» є модулярним: кожний палець спочатку контактує з трьома парами основ в мішені, що йдуть підряд, і декілька ключових остатків в білку опосередковують розпізнавання. Показано, що ендонуклеаза рестрикції FokI повинна димеризуватися через нуклеазний домен для розщеплення ДНК, викликаючи дволанцюжковий розрив. Аналогічним чином, ZFN також мають потребу в димеризації нуклеазного домену для розрізання ДНК. Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334: 1191-7; Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9. Димеризації ZFN 2 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сприяють два прилеглих, протилежно орієнтованих сайти зв’язування. Крім того, дволанцюжкові розриви, викликані нуклеазами «цинкові пальці» усуваються репараційним апаратом ДНК рослин за допомогою з'єднання негомологічних кінців (NHEJ) або за допомогою гомологічної рекомбінації (HD), приводячи, таким чином, до утворення рослин, які не містять залишкових послідовностей розпізнавання. ОПИС ВИНАХОДУ Згідно з варіантом здійснення винаходу, надається спосіб видалення ділянки ДНК в рослині, в якій жива рослина містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК; і нуклеаза «цинкові пальці», сконструйована для розщеплення геномної ДНК в послідовності розпізнавання, експресується або вводиться в живу рослину, що містить геномну ДНК; приводячи тим самим до розщеплення геномної ДНК в послідовностях розпізнавання, що приводить до вирізання геномної ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК. В іншому варіанті здійснення спосіб видалення ділянки ДНК в рослині включає надання першої життєздатної рослини, що містить геномну ДНК, що містить ділянку ДНК, і першу послідовність розпізнавання, що фланкує 3'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'-кінець ділянки ДНК. Надають другу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ДНК, що кодує нуклеазу «цинкові пальці», сконструйовану для розщеплення геномної ДНК в послідовностях розпізнавання. Схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що нащадок F1 виробляється на першій або на другій життєздатній рослині. Вирощують отриману рослину F1, що містить геномну ДНК, в якій відсутня ділянка ДНК з геномної ДНК. У певних варіантах здійснення перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання можуть бути однаковими. У конкретному варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти включає: першу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці»; ген, що представляє інтерес; і другу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці», де ген, що представляє інтерес, фланкований першою і другою послідовностями нуклеїнової кислоти, розпізнавані нуклеазою «цинкові пальці». В іншому варіанті здійснення перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання можуть бути фланковані гомологічними послідовностями. У ще одному варіанті здійснення спосіб отримання трансгенної рослини включає трансформування рослинної клітини або рослинної тканини виділеною молекулою нуклеїнової кислоти і регенерацію цілої рослини. У додатковому варіанті здійснення спосіб зменшення передачі гену, що представляє інтерес, іншим рослинам включає схрещування цілої рослини з рослиною, регенерованою з рослинної клітини або тканини, трансформованої виділеною молекулою нуклеїнової кислоти, що містить специфічний для пилка промотор, функціонально зв'язаний з нуклеазою «цинкові пальці», де ген, що представляє інтерес, специфічно вирізають в пилку потомства, отриманого в результаті схрещування. Потомство, отримане в результаті схрещування, культивують. У такому варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти містить промотор і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу «цинкові пальці», де промотор функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу «цинкові пальці», і спосіб отримання трансгенної рослини, який включає трансформацію рослинної клітини або рослинної тканини виділеною молекулою нуклеїнової кислоти і регенерацію цілої рослини. У варіанті здійснення спосіб видалення ділянки ДНК в рослині містить молекулу нуклеїнової кислоти, що включає: першу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці»; касету експресії гену селектованого маркера; і другу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці», де селектований маркер фланкований першою і другою послідовностями нуклеїнової кислоти, розпізнаваними нуклеазою «цинкові пальці». В іншому варіанті здійснення перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання фланковані гомологічними послідовностями. Крім того, нуклеаза «цинкові пальці», сконструйована для розщеплення геномної ДНК в послідовності розпізнавання, експресується або вводиться в життєздатну рослинну клітину; приводячи тим самим до розщеплення геномної ДНК в послідовностях розпізнавання, що приводить до вирізання геномної ДНК, де селектований маркер відсутній в геномній ДНК. В іншому варіанті здійснення кожна половина мономеру нуклеази «цинкові пальці» експресується окремо і при з'єднанні разом одна з одною вони утворюють функціональний комплекс. Наприклад, одиниця транскрипції рослини, яка експресує один мономер нуклеази «цинкові пальці» (що складається із зв'язувального мотиву «цинкові пальці», функціонально зв'язаного з нуклеазою FokI) стабільно інтегрується в одного батька, PI, і одиниця транскрипції рослини, яка експресує другий мономер, стабільно інтегрується в другого батька, P2. Статеве схрещування PI × P2 дає в результаті рослини-нащадки, які містять обидва мономери 3 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 «цинкових пальців». Отримуваний димер нуклеази «цинкові пальці» здатний до зв’язування з сайтом зв’язування «цинкових пальців» і до формування комплексу, який має розщеплювальну активність. Враховуючи, що ендонуклеаза FokI активна як димер (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575), розщеплювальна активність здатна виявитися тільки у потомства, яке містить обидва функціонально експресуючих мономери. В іншому варіанті здійснення вирізання нуклеазою «цинкові пальці» в послідовності розпізнавання приводить до утворення сполуки на місці розщеплення, яка не містить залишкової послідовності розпізнавання. Сполука розриву не може зв'язуватися і розщеплюватися вихідною нуклеазою (нуклеазами) «цинкові пальці». Крім того, сполука розриву може бути результатом негомологічного з'єднання кінців (NHEJ) або результатом гомологічної рекомбінації між двома гомологічними областями ДНК, які розташовані вище за 5'послідовність розпізнавання і нижче за 3'-послідовність розпізнавання, або результатом іншого неописаного механізму репарації ДНК. Гомологічна послідовність може розташовуватися за межами сайтів зв’язування, так що після розщеплення може відбуватися гомологічна рекомбінація. Це є удосконаленням в порівнянні з рекомбіназними системами, які завжди залишають після себе залишок сайту, використаного для проведення ексцизії. У ще одному варіанті здійснення спосіб вирізання нативного гену, що представляє інтерес, в рослині включає трансформацію рослинної клітини або тканини, що містить ген, що представляє інтерес, виділеною молекулою нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу «цинкові пальці» або послідовність ізольованого білка, яка кодує нуклеазу «цинкові пальці», де нуклеаза «цинкові пальці» розпізнає послідовність нуклеїнової кислоти, яка фланкує нативний ген, що представляє інтерес, і нативний ген, що представляєінтерес, специфічно вирізається. Потім регенерують цілу рослину. В альтернативному варіанті здійснення вирізування ендогенного гену може здійснюватися схрещуванням рослини, що експресує нуклеазу «цинкові пальці», з рослиною-мішенню. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фіг. 1 включає карту плазміди pDAS5380. Фіг. 2 включає карту плазміди pDAS5381. Фіг. 3a являє собою схематичну діаграму і рестрикційну карту вставки Т-ДНК. Фіг. 3b включає декілька панелей, що зображають аналіз Саузерн-блотинг T0, використаний для ідентифікації «подій», які містили повнорозмірні інтактні PTU з плазміди pDAS5380 згідно з варіантом здійснення винаходу. Саузерн-блотинг T0 зображає ферменти рестрикції Mfel і Nsil, що використовуються для розщеплення «подій pDAS5380», що показують інтактні вставки ТДНК при спільній гібридизації GUS і PAT. Фіг. 4A являє собою схематичну діаграму і рестрикційну карту вставки Т-ДНК. Фіг. 4b включає декілька панелей, що зображають Саузерн-блотинг T0, використаний для ідентифікації «подій», які містили повнорозмірні інтактні PTU з плазміди pDAS5381 згідно з варіантом здійснення винаходу. Саузерн-блотинг T0 зображає ферменти рестрикції Mfel і Nsil, що використовуються для розщеплення «подій» pDAS5381, що показують інтактні вставки Т-ДНК при гібридизації HptII. Фіг. 5 включає Саузерн-блотинг вибраної групи «подій», які відповідають більш великому зразку згідно з варіантом здійснення винаходу. Вказані зразки вибирали для ілюстрації вирізаного фрагмента (тобто більш короткого молекулярного фрагмента), невирізаного фрагмента (тобто фрагмента з більш високою молекулярною вагою), і химерних «подій», які містили вирізані і невирізані фрагменти. Крім того, включали контролі геномної ДНК дикого типу і 100 пг плазміди pDAS5380. Результати корелювали з результатами експресії GUS. «Події», які не давали позитивної реакції при гістохімічному фарбуванні на GUS, не містили повнорозмірної, інтактної касети експресії PTU GUS. Фіг. 6 включає зображення агарозного гелю, що містить зразки РС-ампліфікованих фрагментів геномної ДНК, використаних в експериментах Саузерн-блотингу згідно з варіантом здійснення винаходу. Вказані амплікони ПЛР ілюструють вирізаний фрагмент (тобто фрагмент з меншою молекулярною вагою), невирізаний фрагмент (тобто фрагмент з великою молекулярною вагою), і химерні «події», які містили вирізаний і невирізаний фрагменти. Крім того, включені контролі диких рослин T 0; більш велику касету експресії інтактного PTU GUS ампліфікували у вказаних реакціях. Негативні контролі також включені в тих випадках, коли для реакцій ПЛР використовували геномну ДНК дикого типу і не використовували ДНК (H 2О). Результати корелювали з результатами експресії GUS і з результатами Саузерн-блотингу. Фіг. 7a і 7b включають аналіз вирівнювання послідовності смуги 2,4 т.н., що свідчить про делеції касети експресії GUS згідно з варіантом здійснення винаходу. Послідовність, виділена напівжирним шрифтом, показує промотор актину At і елементи гену MAR. Сайти зв’язування 4 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CCR5 виділені підкресленням і курсивом. Хоч декілька ампліконів отримували і секвенували на подію, тільки один амплікон вирівнювали в фігурах. Фіг. 8 включає аналіз ПЛР нащадків F2 «інтактних» гібридів F1 згідно з варіантом здійснення винаходу. Фіг. 9 включає Саузерн-блотинг нащадків F2 «інтактних» гібридів F1 згідно з варіантом здійснення винаходу. Фіг. 10 включає аналіз ПЛР нащадків F2 «вирізаних» гібридів F1 згідно з варіантом здійснення винаходу. Фіг. 11 включає аналіз Саузерн-блотинг нащадків F2 «вирізаних» гібридів F1 згідно з варіантом здійснення винаходу. Фіг. 12 включає аналіз ПЛР нащадків F 2 «химерних» гібридів F1 згідно з варіантом здійснення винаходу. Фіг. 13 включає аналіз Саузерн-блотинг нащадків F2 «химерних» гібридів F1 згідно з варіантом здійснення винаходу. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Послідовності нуклеїнової кислоти, перераховані в прикладеному списку послідовностей, представлені з використанням стандартних буквених скорочень нуклеотидних основ. Показаний тільки один ланцюг кожної послідовності нуклеїнової кислоти, але комплементарний ланцюг зрозумілий, оскільки він включений за допомогою посилання на представлений ланцюг. У прикладеному списку послідовностей: SEQ ID NO: 1 показує сайт зв’язування ZFN CCR5. SEQ ID NO: 2 показує послідовність гену нуклеази «цинкові пальці» CCR5. SEQ ID NO: 3 показує праймер TQPATS. SEQ ID NO: 4 показує праймер TQPATA. SEQ ID NO: 5 показує праймер TQPATFQ. SEQ ID NO: 6 показує праймер TQPALS. SEQ ID NO: 7 показує праймер TQPALA. SEQ ID NO: 8 показує праймер TQPALFQ. SEQ ID NO: 9 показує праймер HPT2S. SEQ ID NO: 10 показує праймер HPT2A. SEQ ID NO: 11показує праймер HPTFQ. SEQ ID NO: 12 показує праймер Fok1_UPL_F. SEQ ID NO: 13 показує праймер Fok1_UPL_R. SEQ ID NO: 14 показує праймер BY2ACT89S. SEQ ID NO: 15 показує праймер BY2ACT89A. SEQ ID NO: 16 показує прямий праймер ПЛР для аналізу ПЛР PTU. SEQ ID NO: 17 показує зворотний праймер ПЛР для аналізу ПЛР PTU. SEQ ID NO: 18 показує праймер BYACTFQ. СПОСІБ(И) ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ Розкривається спосіб вирізання генів зі специфічної рослинної тканини в генетично модифікованих організмах. У деяких варіантах здійснення використовують одну або більше ZFN (нуклеаза «цинкові пальці») для видалення трансгенів зі специфічної рослинної тканини як засіб зменшення потоку генів в не-GM культури. У деяких варіантах здійснення трансген, що видаляється, являє собою касету гену селектованого маркера. У певних варіантах здійснення специфічна рослинна тканина являє собою пилок. У деяких варіантах здійснення одна або більше ZFN можуть бути функціонально зв'язані з різними тканиноспецифічними промоторами. У вказаних і в інших варіантах здійснення одна ZFN з однієї або більше ZFN, функціонально зв'язана з тканиноспецифічним промотором, може бути трансформована в одну лінію батьківської рослини, і іншої ZFN з однієї або більше ZFN, функціонально зв'язану з іншим тканиноспецифічним промотором, може бути трансформована у другу лінію батьківської рослини. Схрещування батьківських ліній, що містять кожну з однієї або більше ZFN, може дати лінію F1, яка містить функціональну ZFN, яка розщеплює ДНК в послідовності розпізнавання. Послідовності розпізнавання можуть фланкувати трансгени в ДНК рослини. Вирізання тканиноспецифічного гену може бути досягнуте шляхом функціонального зв’язування промоторів, специфічних для тканин рослини, з ZFN. У деяких варіантах здійснення функціональне зв’язування тканиноспецифічного промотору з однією або більше ZFN приводить до тканиноспецифічної експресії однієї або більше ZFN, і в зв'язку з цим до вирізання ZFN, селектованих маркерів, і/або будь-яких генів або послідовностей нуклеїнової кислоти, розташованих між послідовностями розпізнавання в специфічній тканині. 5 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У конкретних варіантах здійснення одна або більше ZFN експресуються в одній і тій же рослині. ZFN можуть бути функціонально зв'язані з промоторами, які запускають експресію ZFN під час більш пізніх стадій розвитку рослини. У вказаних і в інших варіантах здійснення одна або більше функціональних ZFN можуть розщеплювати специфічні послідовності розпізнавання, які фланкують один або більше трансген(и), видаляючи тим самим один або більше трансгенів з тканини рослини під час більш пізніх стадій розвитку рослини. СКОРОЧЕННЯ GM - генетично модифікований PTU - одиниця транскрипції рослини ZF - цинковий палець ZFN - нуклеаза «цинкові пальці» ZFP - білок «цинкові пальці» ТЕРМІНИ Експресія гену. Процес, за допомогою якого кодована інформація одиниці транскрипції нуклеїнової кислоти (включаючи, наприклад, геномну ДНК або кДНК) перетворюється в функціональну, нефункціональну або структурну частину клітини, часто включає в себе синтез білка. Експресія гену може знаходитись під впливом зовнішніх сигналів; наприклад, вплив на клітину, тканину або організм агента, який збільшує або зменшує експресію гену. Експресія гену також може регулюватися всюди в каскаді реакцій від ДНК до РНК і до білка. Регуляція експресії гену відбувається, наприклад, за допомогою контролів, що впливають на транскрипцію, трансляцію, транспорт і процесинг РНК, деградацію допоміжних молекул, таких як мРНК, або за допомогою активації, інактивації, компартменталізації або деградації специфічних білкових молекул, після того, як вони були зроблені, або за допомогою їх комбінацій. Експресію гену можна розрахувати з розрахунку рівня РНК або рівня білка будь-яким методом, відомим в даній галузі техніки, включаючи, але без обмеження, нозерн-блотинг, ЗТ-ПЛР, вестерн-блотинг, або тест(и) визначення активності білка in vitro, in situ або in vivo. Гібридизація. Олігонуклеотиди і їх аналоги гібридизуються шляхом утворення водневих зв'язків, які можуть бути водневими зв'язками по моделі Уотсона-Крика, хугстинівськими або зворотними хугстинівськими, між комплементарними основами. Загалом, молекули нуклеїнової кислоти складаються з азотистих основ, які являють собою піримідини (цитозин (С), урацил (U), і тимін (Т)) або пурини (аденін (А) і гуанін (G)). Вказані азотисті основи утворюють водневі зв'язки між піримідином і пурином, і зв’язування піримідину з пурином позначається як «спаровування основ». Більш детально, А буде утворювати водневий зв'язок зТ або U, і G буде зв'язуватися з С. «Комплементарний» стосується спаровування основ, яке відбувається між двома окремими послідовностями нуклеїнової кислоти або двома окремими областями тієї ж самої послідовності нуклеїнової кислоти. «Той, що специфічно гібридизується» і «комплементарний» є термінами, які вказують достатній ступінь комплементарності, таким чином, що відбувається стабільне і специфічне зв’язування між олігомерною сполукою і ДНК- або РНК-мішенню. Олігонуклеотид не повинен бути на 100% комплементарний своїй послідовності-мішені для специфічної гібридизації. Олігонуклеотид специфічно гібридизиується, якщо зв’язування олігонуклеотиду з молекулою-мішенню ДНК або РНК перешкоджає нормальному функціонуванню мішені ДНК або РНК, і є достатній ступінь комплементарності, щоб уникнути неспецифічного зв’язування олігонуклеотиду з нецільовими послідовностями в умовах, коли бажане специфічне зв’язування, наприклад, в фізіологічних умовах у разі тестів або систем in vivo. Таке зв’язування називають специфічною гібридизацєю. Умови гібридизації, що дають в результаті різні ступені жорсткості, будуть варіювати в залежності від природи вибраного методу гібридизації і складу і довжини послідовностей нуклеїнової кислоти, що гібридизуються. Загалом, температура гібридизації і іонна сила + 2+ (особливо концентрація Na і/або Mg ) буфера гібридизації будуть забезпечувати суворість гібридизації, хоч час відмивання також впливає на суворість. Розрахунки, що стосуються умов гібридизації, необхідних для досягнення певних ступенів суворості, обговорюються в Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 і 11. У контексті даного розкриття «Суворі умови» охоплюють умови, в яких гібридизація буде відбуватися, якщо є менше, ніж 25% невідповідності між молекулою гібридизації і послідовністюмішенню. «Суворі умови» можна додатково описати в певних рівнях суворості. Таким чином, умови «помірної суворості», що використовуються в описі, являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 25% невідповідності не будуть гібридизуватися; умови «середньої суворості» являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 15% невідповідності не будуть 6 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гібридизуватися, і умови «високої суворості» являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 10% невідповідності не будуть гібридизуватися. Умови «дуже високої суворості» являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 6% невідповідності не будуть гібридизуватися. У конкретних варіантах здійснення, суворі умови являють собою гібридизацію при 65С, з подальшим послідовним відмиванням при 65С 0,1SSC/0,1% SDS протягом 40 хвилин. Ізольований. «Ізольований» біологічний компонент (такий як нуклеїнова кислота або білок) по суті відділений, зроблений окремо від або очищений від інших біологічних компонентів клітини організму, в якій компонент присутній природним чином, тобто від інших хромосомних і екстра-хромосомних ДНК і РНК і білків. Молекули нуклеїнової кислоти і білки, які «ізолювали», включають молекули нуклеїнової кислоти і білки, очищені стандартними методами очищення. Термін також охоплює нуклеїнові кислоти і білки, отримані за допомогою рекомбінантної експресії в клітині-хазяїни, а також хімічно синтезовані молекули нуклеїнової кислоти, білки і пептиди. Молекула нуклеїнової кислоти. Полімерна форма нуклеотидів, яка може включати смисловий і антисмисловий ланцюг РНК, кДНК і геномної ДНК, і їх синтетичні форми і змішані полімери. Термін «нуклеотид» означає рибонуклеотид, дезоксинуклеотид або модифіковану форму нуклеотидів будь-якого типу. Термін «молекула нуклеїнової кислоти», що використовується в даному винаході, є синонімом термінів «нуклеїнова кислота» і «полінуклеотид». Термін також включає одноланцюжкову і дволанцюжкову форми ДНК. Молекула нуклеїнової кислоти може включати природні або модифіковані нуклеотиди або ті й інші нуклеотиди, зв'язані один з одним природними і/або неприродними нуклеотидними зв'язками. Молекули нуклеїнової кислоти можуть бути модифіковані хімічно або біохімічно, або вони можуть містити неприродні або дериватизовані нуклеотидні основи, як може бути легко визначено фахівцем. Такі модифікації включають, наприклад, мітки, метилування, заміну одного або декількох природних нуклеотидів їх аналогами, міжнуклеотидні модифікації, такі як введення незаряджених зв'язків (наприклад, метилфосфонатів, фосфотриефірів, фосфорамідитів, карбаматів і т.п.), заряджених зв'язків (наприклад, фосфортіоатів, фосфордитіоатів і т.п.), бокових груп (наприклад, поліпептидів), інтеркалюючих агентів (наприклад, акридину, псоралену і т.п.), хелатоутворювальних агентів, алкілуючих агентів і модифікованих зв'язків (наприклад, α-аномерних нуклеїнових кислот і т.п.). Термін «молекула нуклеїнової кислоти» також охоплює будь-які топологічні конформації, включаючи одноланцюжкову, дволанцюжкову, частково дуплексні і триплексні конформації, а також конформації типу «шпильки», кільцеві конформації і конформації типу «висячий замок». Функціонально зв'язаний. Перша послідовність нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, якщо перша послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться в функціональній залежності з другою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо промотор впливає на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності. При рекомбінантному отриманні функціонально зв'язані послідовності нуклеїнової кислоти звичайно межують одна з одною і, при необхідності з'єднують дві області, що кодують білок, в одній і тій же рамці зчитування. Однак елементи не обов'язково повинні межувати, щоб бути функціонально зв'язаними. Промотор. Область ДНК, яка звичайно розташовується в 3'-5' напрямі (відносно 5'-області гену), яка необхідна для транскрипції. Промотори забезпечують відповідну активацію або репресію гену, який вони контролюють. Промотор містить специфічні послідовності, які розпізнаються факторами транскрипції. Вказані фактори зв'язуються з промоторними послідовностями ДНК і приводять до рекрутування РНК-полімерази, ферменту, який синтезує РНК з кодуючої області гену. У деяких варіантах здійснення тканиноспецифічні промотори використовують в способах винаходу, наприклад, промотор, специфічний для пилка. Тканиноспецифічний промотор являє собою послідовність ДНК, яка забезпечує більш високий рівень транскрипції асоційованого гену в тканині, для якої промотор є специфічним, в порівнянні з іншими тканинами організму. Приклади тканиноспецифічних промоторів включають тапетумспецифічні промотори; промотори, специфічні для пильника; промотори, специфічні для пилка (див., наприклад, патент США № 7141424, і міжнародну публікацію PCT № WO 99/042587); промотори, специфічні для сім’язародка; (див., наприклад, патентну заявку США № 2001/047525 Al); промотори, специфічні для плодів (див., наприклад, патенти США № 4943674 і № 5753475); і промотори, специфічні для насіння (див., наприклад, патенти США № 5420034, і № 5608152). У деяких варіантах здійснення промотори, специфічні для стадії розвитку, використовують в способах винаходу, наприклад, промотор, активний на пізній стадії розвитку. 7 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Трансформований. Вірус або вектор «трансформує» або «трансдукує» клітину, якщо він переносить молекули нуклеїнової кислоти в клітину. Клітина «трансформується» молекулою нуклеїнової кислоти, трансдукованою в клітину, якщо молекула нуклеїнової кислоти стабільно реплікується клітиною, за допомогою включення молекули нуклеїнової кислоти в клітинний геном або за допомогою епісомальної реплікації. Застосовуваний в описі термін «трансформація» охоплює всі технології, за допомогою яких молекула нуклеїнової кислоти може бути введена в таку клітину. Приклади включають, але без обмеження трансфекцію вірусними векторами, трансформацію плазмідними векторами, електропорацію (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3), ліпофекцію (Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7), мікроін’єкцію (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85), Agrobacterium-mediated transfer (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7), пряме захоплення ДНК і бомбардування мікрочастинками (Klein et al. (1987) Nature 327:70). Трансген. Екзогенна послідовність нуклеїнової кислоти. В одному прикладі трансген являє собою нуклеотидну послідовність гену (наприклад, гену стійкості до гербіциду), гену, що кодує промислово або фармацевтично застосовну сполуку, або гену, що кодує бажану сільськогосподарську ознаку. У ще одному прикладі трансген являє собою антисмислову послідовність нуклеїнової кислоти, де експресія антисмислової послідовності нуклеїнової кислоти інгібує експресію послідовності-мішені нуклеїнової кислоти. Трансген може містити регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з трансгеном (наприклад, промотор). Вектор. Молекула нуклеїнової кислоти, яку вводять в клітину, отримуючи таким чином трансформовану клітину. Вектор може включати в себе послідовності нуклеїнової кислоти, які дозволяють йому реплікуватися в клітині-хазяїні, наприклад, точка початку реплікації. Приклади включають, але без обмеження? плазміду, косміду, бактеріофаг або вірус, який переносить екзогенну ДНК в клітину. Вектор також може включати один або більше генів, антисмислові молекули і/або гени селектованого маркера, і інші генетичні елементи, відомі в даній галузі техніки. Вектор може трансдукувати, трансформувати або інфікувати клітину, при цьому примушуючи клітину експресувати молекули нуклеїнової кислоти і/або білки, що кодуються вектором. Вектор необов'язково включає матеріали, що сприяють досягненню проникнення молекули нуклеїнової кислоти в клітину (наприклад, ліпосома, кодування білка і т.д.). Опосередковуване Zn-пальцевою нуклеазою вирізання трансгенів з рослин Розкриваються способи отримання рослини, що має знижений витік трансгенів, а також рослини, отримані такими способами, і рослинні матеріали, зроблені з них, наприклад, насіння. В одному варіанті здійснення спосіб включає взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше нуклеазу (нуклеази) «цинкові пальці» (ZFN) функціонально зв'язану з одним або більше тканиноспецифічним промотором (промоторами) (наприклад, промотор, специфічний для пилка). Експресія вказаного вектора приводить до продукції ZFN в певній тканині, в якій її функціонально зв'язаний промотор є активним. ZFN може бути розроблена або сконструйована для розпізнавання послідовності, що розщеплюється, яка фланкує послідовність нуклеїнової кислоти, вирізання якої є бажаним. Продукція ZFN, в такому випадку, в певній тканині, в якій промотор є активним, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними ZFN, утворюючи при цьому послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить сполуку розщеплення, яка не містить залишкової послідовності розпізнавання. В іншому варіанті здійснення спосіб включає: взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше ZFN функціонально зв'язану з тканиноспецифічним промотором; ген, що представляє інтерес; необов'язково один або більше регуляторний елемент(и), який може бути функціонально зв'язаний з геном, що представляє інтерес; і одну або більше послідовностей, що розщеплюються, розпізнаваних ZFN, що фланкують ген, що представляє інтерес, і один або більше регуляторний елемент(и). Експресія вказаного вектора приводить до продукції ZFN в певній тканині, де її функціонально зв'язаний промотор є активним. Продукція ZFN, в такому випадку, в певній тканині, де промотор є активним, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними ZFN, яка включає в себе ген, що представляє інтерес і, необов'язково, один або більше регуляторний елемент(и). В інших варіантах здійснення спосіб включає взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше нуклеаз цинкові пальці (ZFN), функціонально зв'язаних з одним або більше промотором (промоторами), активну в певний період розвитку рослини (наприклад, промотор, який запускає експресію на відносно пізній стадії розвитку). Експресія вказаного вектора приводить до продукції ZFN в певний період розвитку, під час якого її функціонально зв'язаний промотор є активним. ZFN можуть бути розроблені або сконструйовані для 8 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпізнавання послідовності, що розщеплюється, яка фланкує послідовність нуклеїнової кислоти, вирізання якої бажане. Продукція ZFN на стадії розвитку, під час якої промотор активний, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними ZFN. В інших варіантах здійснення спосіб включає: взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше ZFN, функціонально зв'язану з промотором, активним в певний період розвитку рослини; ген, що представляє інтерес; необов'язково один або більше регуляторний елемент(и), який може бути функціонально зв'язаний з геном, що представляє інтерес; і одну або більше послідовностей, що розщеплюються, розпізнаваних ZFN, що фланкують ген, що представляє інтерес, і один або більше регуляторний елемент(и). Експресія вказаного вектора приводить до продукції ZFN в певний період розвитку, під час якого її функціонально зв'язаний промотор активний. Продукція ZFN в певний період розвитку, під час якого активний його функціонально зв'язаний промотор, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними ZFN, яка включає в себе ген,що представляє інтерес, і один або більше регуляторний елемент(и). Нуклеази ZFN У конкретних варіантах здійснення ZFN експресуються з молекул нуклеїнової кислоти в трансформованих рослинах, щоб управляти вирізанням послідовностей нуклеїнової кислоти в трансформованих рослинах. Можуть бути використані ZFN, які впливають на послідовність розпізнавання, сконструйовану для фланкування певної послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, трансген, ген, що представляє інтерес, або ген селектованого маркера) або можуть бути розроблені ZFN, які впливають на послідовність нуклеїнової кислоти, що зустрічається в природі, яка фланкує певну послідовність нуклеїнової кислоти, яку треба вирізати. Виняткова гнучкість і специфічність ZFN-системи забезпечує рівень контролю, недосяжний раніше за допомогою відомих раніше стратегій вирізання гену, опосередковуваних рекомбіназами. Специфічності розпізнавання ZFN можна легко регулювати експериментальним шляхом. Wu et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44. Рандомізація кодонів залишків, що відповідають за розпізнавання цинкових пальців, забезпечує відбір нових пальців, які мають високу афінність до довільно вибраних послідовностей ДНК. Крім того, цинкові пальці є природними ДНКзв'язувальними молекулами, і показано, що сконструйовані цинкові пальці діють на задані мішені в живих клітинах. Таким чином, нуклеази на основі «цинкових пальців» можна направити на специфічні, але довільні сайти розпізнавання. Потреба в димеризації доменів розщеплення химерних нуклеаз «цинкові пальці» забезпечує високий рівень специфічності до послідовності. Оскільки кожний набір з трьох пальців зв'язується з дев'ятьма послідовними парами основ, дві химерні нуклеази фактично вимагають мішені з 18 п.н., якщо кожний домен цинковий палець має ідеальну специфічність. Передбачається, що встановлена послідовність такої довжини є унікальною в межах одного 9 геному (приймаючи приблизно 10 п.о.). Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(1):289-97; Wu et al. (2007), вище. Крім того, додаткові пальці забезпечують підвищену специфічність, Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14628-33; Kim and Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7; Liu et al. (1997) Proc, Natl. Acad, Sci. USA 94:5525-30, так що число цинкових пальців в кожному ДНК-зв'язувальному домені може бути збільшене для забезпечення додаткової специфічності. Наприклад, специфічність може бути додатково збільшена при використанні пари 4-пальцевих ZFN, які розпізнають послідовність з 24 п.о. Urnov et al. (2005) Nature 435:64651. Ключові амінокислоти ZFN, в положеннях -1, 2, 3 і 6 відносно початку α-спіралі, роблять найбільший внесок в специфічні взаємодії мотивів «цинкових пальців». Pavletich and Pabo (1991) Science 252:809-17; Shi and Berg (1995) Chem. Biol. 2:83-9. Вказані амінокислоти можуть бути змінені, при збереженні амінокислот, що залишилися, як консенсусний основний ланцюг, для утворення ZFPs з різною і/або новою специфічністю до послідовностей. Див., наприклад, Choo and Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-7; Desjarlais and Berg (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:7345-9; Desjarlais and Berg (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2256-60; Greisman and Pabo (1997) Science 275:657-61; Isalan et al. (1998) Biochemistry 37: 12026-33; Jamieson et al. (1994) Biochemistry 33:5689-95; Rebar and Pabo (1994) Science 263: 671-3; Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-63; Wolfe et al. (1999) J. Mol. Biol. 285: 1917-34; Wu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:344-8. Крім того, можуть бути сконструйовані щонайменше дві 3-пальцеві ZFN з різною специфічністю послідовностей, так що вони діють спільно при проведенні розщеплення. Smith et al. (2000), вище. Підходи до дизайну і відбору при створенні ZFN винаходу можуть починатися з визначення одного або більше прийнятних мотивів ZF для розпізнавання специфічної послідовності 9 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнової кислоти. Альтернативно ZFN, яка розпізнає специфічну послідовність нуклеїнової кислоти, може бути використана для побудови молекули нуклеїнової кислоти, що містить специфічну послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, в якій специфічна послідовність нуклеїнової кислоти фланкує ген, що представляє інтерес) і інші елементи з потреби. Розглядалися дизайн і різні підходи при відборі ZFP, включаючи метод фагового дисплею. Mani et al. (2005), вище; Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:5978-90; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-60; Kandavelou et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:686-87; Pabo et al. (2001) Annu. Rev. Biochem. 70:313-40; Segal et al. (2003) Biochemistry 42:2137-48. Будь-який дизайн і/або метод відбору, відомий в даній галузі, може бути використаний для отримання ZFN для застосування у варіантах здійснення даного винаходу. Наприклад, клітинні стратегії відбору з використанням бактерійних одногібридних і двогібридних систем можуть бути використані для отримання високоспецифічних ZFP. Durai et al. (2006) Comb. Chem. High Throughput Screen. 9:301-11; Hurt et al. (2003) roc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 12271-6; Jomg et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7382-7. Високоспецифічні ZFP також можуть бути отримані прямим перетасовуванням доменів і клітинною селекцією, яка пропонує загальний підхід до оптимізації багатопальцевих ZFP. Hurt et al. (2003), вище. Множина даних, основаних на дизайні і методологіях фагового дисплею, доступні відносно модулів ZF, які специфічно розпізнають триплети 5' GNN 3' і 5' ANN 3', і в меншій мірі, відомі переваги мотиву ZF відносно триплетів 5' CNN 3' і 5' TNN 3'. Див., наприклад, Durai et al. (2005), вище; Dreier et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:29466-78; Dreier (2005) J Biol. Chem. 280:35588-97; Dreier et al. (2000) J. Mol. Biol. 303:489-502; Liu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:3850-6. В даний час доступні два пакети програм по дизайну ZF на основі Web-технології (наприклад, на zincfingertools.org). Вищевикладене представляє практично всі гени, що кодуються в геномі, сприйнятливі до ZFN-опосередкованого таргетування генів. Katada and Komiyama (2009) Chembiochem. 10(8): 1279-88. У конкретних варіантах здійснення використовують ZFN, яка зв'язується з корецептором HIV CCR5. Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:808-16. Вказану ZFN називають "CCR5 ZFN". У конкретних варіантах здійснення кодуюча область CCR5 ZFN включає: послідовність opaque-2 з внутрішньоядерною локалізацією (Maddaloni et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17(18):7532); 1 домен зв’язування цинкових пальців rl62yl, домен нуклеази FokI (Looney et al. (1989) Gene 80: 193-208); статтерну послідовність T2A (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-7), отриману з вірусу Thesoa assigna; другу послідовність opaque-2 з внутрішньоядерною локалізацією, домен зв’язування цинкових пальців 168FA vE; і другий домен нуклеази FokI. Молекули нуклеїнової кислоти У деяких варіантах здійснення спосіб включає схрещування першої рослини, що містить один або більше генів, що представляють інтерес (які можуть надавати бажану властивість або фенотип), а саме два або більш генів, що представляють інтерес, з другою рослиною. Друга рослина також може мати один або більше генів, що представляють інтерес. Перша рослина може містити вектор, де вектор включає промотор, функціонально зв'язаний з одним або більш геном (генами), що представляє інтерес. Промотор може бути конститутивним або індуцибельним промотором. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ген(и), що представляє інтерес, може бути фланкована сайтами розпізнавання ZFN. Необов'язково, промотор, функціонально зв'язаних генів (генами), що представляє інтерес, і будь-які додаткові послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, регуляторні послідовності), також можуть бути фланковані сайтами розпізнавання ZFN. Друга рослина може містити інший вектор, який може включати в себе тканиноспецифічний промотор або специфічний для стадії розвитку промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує ZFN. Вектори можуть бути стабільно інтегровані в геноми обох рослин. Після схрещування першої і другої рослин, тканиноспецифічний промотор або специфічний для стадії розвитку промотор специфічно запускає експресію ZFN в потомстві такого схрещування, що отримується. Експресія ZFN в цьому потомстві приводить до вирізання послідовностей нуклеїнової кислоти, фланкованих сайтами розпізнавання ZFN, тим самим ослабляючи або виключаючи ген, що представляє інтерес, і необов'язково додаткові послідовності (такі як гени селектованого маркера) в специфічних тканинах і/або стадіях розвитку потомства. У деяких варіантах здійснення сайти розпізнавання ZFN можуть бути додатково фланковані гомологічними послідовностями нуклеїнової кислоти, щоб надалі сприяти гомологічній рекомбінації ДНК. Ген, що представляє інтерес, звичайно буде функціонально зв'язаний з одним або більше промоторами рослини, що запускають експресію гену в кількості, достатній, щоб забезпечити бажану властивість або фенотип. Промотори, що підходять для цього і для інших застосувань, добре відомі в даній галузі техніки. Необмежувальні приклади, що описують такі промотори, 10 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають патенти США № 6437217 (промотор кукурудзи RS81); № 5641876 (промотор актину рису); № 6426446 (промотор кукурудзи RS324); 6429362 (промотор кукурудзи PR-1); 6232526 (промотор кукурудзи A3); 6177611 (конститутивні промотори кукурудзи); 5322938, 5352605, 5359142 і 5530196 (промотор 35S); 6433252 (промотор олеозину L3 кукурудзи); 6429357 (промотор актину 2 рису, і інтрон актину 2 рису); 5837848 (промотор, специфічний для коріння); 6294714 (промотори, що індукуються світлом); 6140078 (промотори, що індукуються солями); 6252138 (промотори, що індукуються патогеном); 6175060 (промотори, що індукуються дефіцитом фосфору); 6388170 (двонаправлені промотори); 6635806 (промотор гамма-коіксину); і патентну заявку США, серійну № 09/757089 (промотор альдолази хлоропластів кукурудзи). Додаткові промотори включають промотор нопалінсинтази (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); промотор октопінсинтази (OCS) (які містяться в пухлиніндукуючих плазмідах Agrobacterium tumefaciens); промотори колімовірусу, такі як промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) 19S (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2; промотор вірусу мозаїки ранника 35S (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84(19):6624-8); промотор сахарозосинтази (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); промотор комплексу гену R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1: 1175-83); промотор гену, що кодує білок, що зв'язується з хлорофілом а/b; CaMV35S (патенти США № 5322938, № 5352605, № 5359142 і № 5530196); FMV35S (патенти США № 6051753 і № 5378619); промотор PC1SV (патент США № 5850019); промотор SCP1 (патент США № 6677503); і промотори AGRtu.nos (номер доступу GenBank V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-7) і т.п. Додаткові генетичні елементи, які необов'язково можуть бути функціонально зв'язані з геном, що представляє інтерес, включають послідовності, що кодують транзитні пептиди. Наприклад, показано, що включення прийнятного транзитного пептиду хлоропласта, такого як А. thaliana EPSPS CTP (Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42), і Petunia hybrida EPSPS CTP (della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7) направляє гетерологічні послідовності білків EPSPS в хлоропласти в трансгенних рослинах. Дикамба-монооксигеназа (DMO) також може бути націлена на хлоропласти, як описано в міжнародній PCT публікації № WO 2008/105890. Додаткові генетичні елементи, які необов'язково можуть бути функціонально зв'язані з геном, що представляє інтерес, також включають 5'-UTR, розташовану між промоторною послідовністю і кодуючою послідовністю, яка працює як лідерна послідовність при трансляції. Лідерна послідовність трансляції в повністю процесованій мРНК в 3'-5' напрямку від стартової послідовності трансляції. Лідерна послідовність трансляції може впливати на процесинг первинного транскрипту мРНК, на стабільність мРНК, і/або ефективність трансляції. Приклади лідерних послідовностей трансляції включають лідерів білків теплового шоку кукурудзи і петунії (патент США № 5362865), лідери білків оболонки рослинних вірусів, лідери рослинного ферменту rubisco, і інші. Див., наприклад, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Необмежувальні приклади 5' UTR включають GmHsp (патент США № 5659122); PhDnaK (патент США № 5362865); AtAntl; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64: 1590-7); і AGRtunos (номер доступу GenBank V00087; і Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7). Додаткові генетичні елементи, які необов'язково можуть бути функціонально зв'язані з геном, що представляє інтерес, також включають 3'-нетрансльовані послідовності, 3'-області термінації транскрипції або області поліаденілювання. Вони являють собою генетичні елементи, розташовані в 5'-3' напрямі полінуклеотидної молекули, і включають полінуклеотиди, які забезпечують сигнал поліаденілювання, і/або інші регуляторні сигнали, здатні впливати на транскрипцію, процесинг мРНК або експресію генів. Сигнал поліаденілювання функціонує в рослинах для надання аденілатнуклеотидів до 3'-кінця попередника мРНК. Послідовність поліаденілювання може бути отримана з природного гену, з безлічі рослинних генів з генів ТДНК. Необмежувальним прикладом 3'-області термінації транскрипції є 3'-область нопалінсинтази (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Приклад застосування різних 3'-нетрансльованих областей наводиться в Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Необмежувальні приклади сигналів поліаденілювання включають сигнал з гену aPisum sativum RbcS2 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) і AGRtu.nos (Номер доступу GenBank E01312). Трансформація рослин Будь-який з методів, відомих в даній галузі, для введення трансгенів в рослини може бути використаний для отримання трансформованої рослини згідно з винаходом. Передбачається, що прийнятні методи трансформації рослин включають практично будь-який метод, з допомогою якого ДНК може бути введена в клітину, наприклад: з допомогою електропорації, як 11 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проілюстровано в патенті США № 5384253; за допомогою бомбардування мікрочастинками, як проілюстровано в патентах США №№ 5015580, 5550318, 5538880, 6160208, 6399861, і 6403865; опосередковану Agrobacterium трансформацію, як проілюстровано в патентах США №№ 5635055, 5824877, 5591616; 5981840 і 6384301; і трансформацію протопластів, як описано в патенті США № 5508184 і т.д. Завдяки застосуванню технологій, таким як вказані, клітини практично будь-яких видів рослин можуть бути стабільно трансформовані, і вказані клітини можуть розвиватися в трансгенні рослини за допомогою технологій, відомих фахівцям в даній галузі. Технології, які можуть бути особливо корисні в контексті трансформації бавовни, розкриваються в патенті США №№ 5846797, 5159135, 5004863 і 6624344; технології трансформації рослин роду Brassica зокрема розкриваються, наприклад, в патенті США № 5750871; технології трансформації soybean розкриваються, наприклад, в патенті США № 6384301; і технології трансформації кукурудзи розкриваються, наприклад, в патенті США № 7060876, патенті США № 5591616, і в міжнародній публікації PCT WO 95/06722. Після здійснення доставки екзогенної ДНК реципієнтним клітинам, наступні стадії звичайно стосуються ідентифікації трансформованих клітин для подальшого культивування і регенерації рослин. З метою збільшення здатності ідентифікувати трансформанти, може бути бажане застосування гену селектованого або скринованого маркера з вектором трансформації, що використовується для створення трансформанту. У такому випадку потенційно трансформована клітинна популяція може бути перевірена шляхом впливу на клітини селективного агента або агентів, або може бути проведений скринінг клітин відносно бажаної ознаки маркерного гену. Клітини, які пережили вплив селективного агента, або клітини, які вважали позитивними в скринінговому тесті, можуть бути культивовані в середовищі, яке підтримує регенерацію рослин. У деяких варіантах здійснення, будь-яке культуральне середовище, що підходить для рослинної тканини (наприклад, середовища MS і N6) може бути модифікована включенням інших речовин, таких як регулятори росту. Тканину можна підтримувати на основному середовищі з регуляторами росту доти, поки доступна достатня кількість тканини для початку спроб по регенерації рослини, або для подальших повторних раундів ручної селекції, доти, поки морфологія тканини підходить для регенерації (наприклад, щонайменше 2 тижні), потім переносять на середовище, що сприяє утворенню паростка. Культури переносять періодично, доти, поки не станеться достатнього формування паростків. Після того, як паростки сформуються, їх переносять на середовище, сприятливе для утворення коріння. Після формування достатньої кореневої системи рослини можуть бути пересаджені в грунт для подальшого росту і розвитку. Для підтвердження присутності гену, що представляє інтерес (наприклад, трансгену), в регенерованих рослинах можуть бути проведені різні тести. Такі тести включають, наприклад: молекулярно-біологічні тести, такі як саузерн-блотинг і нозерн-блотинг і ПЛР; біохімічні тести, такі як визначення присутності білкового продукту, наприклад, імунологічними методами (ELISA і/або вестерн-блотинги) або за допомогою ферментативної функції; аналізи частин рослин, такі як аналізи листя і коріння; і аналіз фенотипу цілої регенерованої рослини. Культивування і застосування трансгенних рослин Рослина, в якій виявляється вирізання нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, може мати одну або більше бажаних властивостей, наприклад, дві або більше бажаних властивостей. Такі властивості можуть включати, наприклад: стійкість до комах і інших шкідників і хвороботворних агентів; стійкість до гербіцидів; підвищена стійкість, врожайність, або здатність до зберігання; стійкість до впливів зовнішнього середовища; фармацевтичну продукцію; виробництво промислового продукту; і поліпшені харчові якості. Бажані властивості можуть забезпечуватися генами, фланкованими послідовністю нуклеїнової кислоти, розпізнаваною ZFN, експресованої в рослині, що виявляє бажані властивості, так що експресія ZFN в рослині знижує або усуває передачу властивості, за допомогою обмеження гену, що лежить в його основі, іншим рослинам або подальшим поколінням рослини. Таким чином, в одному варіанті здійснення бажана властивість може бути присутньою завдяки наявності трансгену (трансгенів) в рослині, який може бути фланкований послідовностями розпізнавання ZFN. У додатковому варіанті здійснення бажану властивість можна отримати за допомогою відповідної селекції, будь-яка властивість може забезпечуватися одним або більше генами, фланкованими послідовностями розпізнавання ZFN. Рослина, в якій виявляється вирізання нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, може бути будь-якою рослиною, здатною до трансформації молекулою нуклеїнової кислоти винаходу. Відповідно, рослина може бути дводольною рослиною або однодольною рослиною. Необмежувальні приклади дводольних рослин, застосовних в даних способах, включають 12 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 люцерну, квасолю, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовну, огірок, баклажан, салат, диню, горох, перець, арахіс, картоплю, гарбуз, редиску, рапс, шпинат, сою, кабачок, цукровий буряк, соняшник, тютюн, томат і кавун. Необмежувальні приклади однодольних рослин застосовних в даних способах, включають кукурудзу, цибулю, рис, сорго, пшеницю, жито, пшоно, цукрову тростину, овес, тритикалє, просо лозиноподібне і газонну траву. Рослини, в яких виявляється вирізання нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, можна використати або культивувати будь-яким чином, там, де передача вирізаної послідовності нуклеїнової кислоти іншим рослинам є небажаною. Відповідно, GM рослини, які були розроблені, inter alia, таким чином, що вони мають одну або більше бажаних властивостей, можуть бути трансформовані молекулами нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, і посаджені і культивовані будь-яким методом, відомим фахівцям в даній галузі. ПРИКЛАДИ Нижченаведені приклади включені для ілюстрації варіантів здійснення винаходу. Фахівцям в даній галузі ясно, що методики, розкриті в Прикладах, являють собою методики, розкриті авторами винаходу для правильного функціонування винаходу на практиці. Однак фахівцям в даній галузі в світлі даного розкриття буде зрозуміло, що в конкретні варіанти здійснення, які розкриваються, можуть бути внесені численні зміни, і з отриманням такого ж або схожого результату без порушення об'єму винаходу. Більш детально, очевидно, що певні агенти, які зв'язані хімічно і фізіологічно, можуть використовуватися замість агентів, описаних тут, в той же час будуть отримані аналогічні або схожі результати. Всі такі схожі замісники і модифікації, очевидні для фахівців в даній галузі техніки, вважають, що входять в об'єм винаходу, як визначено прикладеною формулою винаходу. Приклад I: Розробка і створення плазмід Розробляли і створювали цільову конструкцію, що містить касету експресії цільового репортерного гену, фланковану ділянками зв’язування цинкових пальців (pDAS5380), і ексцизійну конструкцію, що містить касету експресії гену нуклеази «цинкові пальці» (pDAS5381). Розробляли конструкції, якими трансформували по окремості рослини тютюну. Вирізання цільового репортерного гену здійснювали шляхом схрещування двох ліній тютюну, де функціональна нуклеаза «цинкові пальці» розпізнавала сайти зв’язування цинкових пальців, що фланкують касету цільового репортерного гену, і розщеплювала геномну ДНК. Схрещування ліній рослин, що містять конструкцію цільового репортерного гену, з лінією рослини, що містить ексцизійну конструкцію, приводило до видалення/делеції репортерного гену геному рослини. Розробка і створення цільової конструкції pDAS5380 pDAS5380 (Фіг. 1) створювали у вигляді бінарного плазмідного вектора. Дана конструкція містила наступні касети експресії одиниці транскрипції рослини (PTU) і генетичні елементи: RB7 MAR ((ділянка прикріплення до ядерного матриксу (Thompson et al. (1991) WO9727207)): CCR5зв'язувальна ділянка, що повторюється 4x (Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:808-16): AtuORFl 3' UTR (відкрита рамка зчитування-1 Agrobacterium tumefaciens, 3'-нетрансльована область (Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-22))/GUS (β-D-глюкуронідаза (Jefferson (1989) Nature 342:837-8))/AtUbi10 (промотор Arabidopsis thatiana убіквітин-10 (Callis et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:12486-93)): CCR5-зв'язувальна ділянка, що повторюється 4x: : AtAct2 (промотор актину-2 А. thaliana (An et al. (1996) Plant J. 10: 107-21))/Turbo GFP (зелений флуоресцентний білок турбо-грин (Evdokimov et al. (2006) EMBO Rep. 7(10):1006-12))/Atu ORF23 3' UTR (відкрита рамка зчитування -23 А tumefaciens, 3' нетрансльована область (Gelvin et al (1987) EP222493)): : AtUbi10/PAT (фосфінотрицинацетилтрансфераза (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37))/Atu ORF1 3' UTR. Касету експресії PTU GUS вміщували в trans-положення по відношенню до касет експресії GFP і PTU PAT. Крім того, касету експресії PTU GUS фланкували сайтами зв’язування нуклеази «цинкові пальці» CCR5. Цю послідовність (SEQ ID NO: 1) повторювали 4x безпосередньо зліва і справа від касети експресії PTU GUS. Локалізації сайтів зв’язування цинкових пальців позначені на Фіг. 1 як "САЙТ ЗВ’ЯЗУВАННЯ CCR5". Вказані сайти розпізнаються і зв'язуються білком нуклеази «цинкові пальці», кодованим ексцизійною конструкцією pDAS5381. Збирання вказаного бінарного вектора виконували із застосуванням стандартних технологій молекулярної біології. Структуру плазміди, що отримується, підтверджували шляхом розщеплення ферментами рестрикції і секвенуванням ДНК. Розробка і створення ексцизійної конструкції pDAS5381 Бінарну плазміду, що містить ген нуклеази «цинкові пальці», яка призначена спеціально для зв’язування з сайтом зв’язування CCR5 (SEQ ID NO:2), розробляли і створювали, як описано Perez et al, (2008) Nature Biotechnol. 26:808-16. Конструкція pDAS5381 (Фіг. 2) містить наступні касети експресії PTU: CsVMV (промотор вірусу мозаїки касаві (Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. 13 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Biol. 31: 1129-39))/кодуюча область нуклеази «цинкові пальці» CCR5 (що містить: послідовність opaque-2 внутрішньоядерної локалізації (Maddaloni et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17(18):7532); 1 домен зв’язування цинкових пальців rl62yl; домен нуклеази FokI (Looney et al. (1989) Gene 80: 193-208); статерна послідовність T2A (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-7) отримана з вірусу Thesoa assigna; друга послідовність opaque-2 внутрішньоядерної локалізації; домен зв’язування цинкових пальців 168GA vE; і другий домен нуклеази FokI)/Atu ORF23 3' UTR: : промотор AtUbi3 (промотор убіквінтину-3 А. thaliana (Callis et al. (1995) Genetics 139(2):921-39))/HPTII (гігроміцин фосфотрансфераза II (Gritz et al. (1983) Gene 25(2-3): 179-88))/Atu ORF24 3' UTR (відкрита рамка зчитування-24 А. tumefaciens, 3' не трансльована область (Gelvin et al. (1987) EP222493)). Збирання вказаного бінарного вектора виконували із застосуванням стандартних технологій молекулярної біології. Структуру плазміди, що отримується, підтверджували шляхом розщеплення ферментами рестрикції і секвенуванням ДНК. Приклад II: Agrobacterium-опосередкована трансформація рослин Трансформація Agrobacterium з допомогою pDAS5380 і pDAS5381 Електрокомпетентні клітини А. tumefaciens (штам LBA4404) отримували з Invitrogen (Carlsbad, CA) і трансформували з використанням методу електропорації по матеріалах Weigel and Glazebrook (2002) "How to Transform Arabidopsis" in Arabidopsis: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A. Трансформовані колонії отримували на пептонному середовищі з дріжджовим екстрактом (YEP), що містить спектиноміцин (50 мкг/мл) і стрептоміцин (125 мкг/мл), і підтверджували їх структуру шляхом розщеплення ферментами рестрикції. Клони, які виявляли картини розподілу смуг, що відповідають дії ферментів рестрикції, зберігали у вигляді вихідних культур в гліцерині при 80С. Agrobacterium-опосередкована трансформація Nicotiana tabacum Листові диски тютюну (cv. Petit Havana) трансформували із застосуванням А. tumefaciens (штам LBA4404), що містить pDAS5381 і pDAS5380. Окремі колонії Agrobacterium, що містять вказані плазміди, інокулювали в 4 мл середовища YEP, що містить спектиноміцин (50 мкг/мл) і стрептоміцин (125 мкг/мл) і інкубували протягом ночі при 28С на шейкері при 190 об./хв. Потім 4 мл культури для посіву використовували для інокуляції 25 мл культури середовища YEP, що містить спектиноміцин (50 мкг/мл) і стрептоміцин (125 мкг/мл), що вирощується в 125 мл колбі Ерленмейєра з відведенням. Культуру інкубували при 28С з перемішуванням при 190 об./хв. до досягнення значення OD600 ~1,2. Десять мл суспензії Agrobacterium вміщували в стерильні чашки Петрі. 2 Двадцять п'ять свіжозрізаних листових дисків (0,5 см ), зрізаних з рослин, вирощених в асептичних умовах на середовищі MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS, #M524) з 30 г/л сахарози в PhytaTrays™ (Sigma, St. Louis, MO) вимочували в 10 мл добової культури Agrobacterium протягом декількох хвилин, промокали досуха стерильним фільтрувальним папером і потім вміщували на те ж саме середовище з додаванням 1 мг/л індолілоцтової кислоти і 1 мг/л бензиламінопурину. Через 48 годин спільного культивування листові диски, культивовані спільно з Agrobacterium, що містить pDAS5380, переносили на те ж саме середовище з 5 мг/л Basta і 250 мг/л цефотаксиму. Листові диски, культивовані спільно з Agrobacterium, що містить pDAS5381, переносили на те ж саме середовище з 10 мг/л гігроміцину і 250 мг/л цефотаксиму. Через 3 тижні окремі паростки T 0 переносили на середовище MS з 10 мг/л Bast і 250 мг/л цефотаксиму у випадку pDAS5380 або на середовище MS з 10 мг/л гігроміцину і 250 мг/л цефотаксиму у випадку pDAS5381, на наступні 3 тижні перед пересадкою в грунт і перенесенням в теплицю. Число піків, повнорозмірна PTU і аналіз експресії рослин T 0 Перевірка числа піків Тести Invader і тести із застосуванням гідролізних зондів здійснювали для відбору зразків Basta-стійких рослин, щоб ідентифікувати рослини, які містили в собі однокопійну інтеграцію ТДНК в pDAS5380 і pDAS5381. Проводили докладний аналіз із застосуванням праймерів і зондів, специфічних до касет експресії генів. Однокопійні «події» ідентифікували для додаткового аналізу. Зразки тканин збирали в 96-ямкові планшети і ліофілізували протягом 2 днів. Мацерацію ™ тканин виконували за допомогою подрібнювача тканин Kleco і вольфрамових гранул (Visalia, CA). Після мацерації тканин геномну ДНК виділяли у високопродуктивному форматі із ™ застосуванням набору DNeasy 96 Plant kit (Qiagen, Germantown, MD) відповідно до протоколу виробника. Визначали кількість геномної ДНК за допомогою набору реагентів Quant-IT Pico Green DNA assay kit™ (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). Кількість геномної ДНК доводили до значення 9 нг/мкл, для тесту Invader або до значення 5 нг/мкл для тесту із 14 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 застосуванням гідролізних зондів з використанням автоматичного пробовідбірника Biorobot3000™ (Qiagen, Germantown, MD). Тести Custom Invaderбули розроблені для аналізу гену PAT в тютюні компанією Hologic (Madison, WI). Зразки геномної ДНК (7,5 мкл при 9 нг/мкл) спочатку денатурували в форматі 96ямкового планшета інкубацією при 95С протягом 10 хвилин і потім охолоджували на льоду. Потім 7,5 мкл реакційної суміші (3 мкл суміші зондів для pat і внутрішнього референсного гену (фенілаланін-амоній-ліаза (palA); GenBank ID: AB008199), 3,5 мкл суміші Cleavase XI FRET і 1 мкл розчину Cleavase XI Enzyme/MgCl2) додавали в кожну ямку і зразки покривали мінеральним маслом. Планшети щільно закривали і інкубували при 63С протягом 1 години в термоциклері BioRad Tetrad. Планшети охолоджували до кімнатної температури перед зчитуванням з допомогою флуоресцентного планшетного рідера. Всі планшети містили 1копійні, 2-копійні і 4-копійні стандарти, а також контрольні зразки дикого типу і контрольну ямку, що не містять зразка. Зчитування показників проводили для каналів FAM (λ 485-528 нм) і RED (λ 560-620 нм) і з цих показників визначали перегин вище за нуль (тобто фон) кожного каналу для кожного зразка шляхом розподілу необробленого сигналу зразка на необроблений сигнал без матриці. На основі цих даних будували калібрувальну криву і визначали максимальну відповідність за допомогою лінійного регресивного аналізу. Використовуючи параметри, встановлені з вказаної відповідності, потім визначали очевидне відповідне число піків для кожного зразка. Визначення числа піків трансгену в тесті із застосуванням гідролізних зондів, аналогічному тесту TaqMan, здійснювали з допомогою ПЛР в режимі реального часу із застосуванням системи LightCyclerо480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Тести здійснювали для HPTII, PAT і внутрішнього референсного гену фенілаланін-амоній-ліази (palA) із застосуванням програмного забезпечення Probe Design Software 2.0 LightCycler. Для проведення ампліфікації готували майстер-мікс зондів LightCycler480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) в 1x кінцевій концентрації в об'ємі 10 мкл мультиплексної реакційної суміші, що містить 0,4 мкМ кожного праймера і 0,2 мкМ кожного зонду (таблиця 1). Здійснювали двостадійну реакцію ампліфікації з подовженням при 58С протягом 38 секунд з отриманням флуоресценції. Всі зразки досліджували в триплетах і середні значення порогових циклів (Ct) використовували для аналізу кожного зразка. Аналіз результатів, отриманих з допомогою ПЛР в реальному режимі часу, виконували із застосуванням програмного забезпечення LightCycler версія 1.5 із застосуванням модуля квантування відносних значень і основаного на методі ΔΔCt. З цією метою зразок геномної ДНК однокопійного калібратора і відомий двокопійний контроль включали в кожну серію вимірювань (ідентичні калібратору і контролю, які застосовували в тестах Invader вище). Таблиця 1 Інформація про праймери і зонди для проведення тесту із застосуванням гідролізних зондів для PAT, PAT, HPTII і внутрішнього референсного гену (palA) Назва праймера TQPATS TQPATA TQPATFQ TQPALS TQPALA Послідовність Виявлення SEQ ID NO:3; 5′ ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT 3′ SEQ ID NO:4; 5′ CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT 3′ Seq ID NO:5; 5′ CY5-GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG-BHQ2 3′ Cy5 SEQ ID NO:6; 5′ TACTATGACTTGATGTTGTGTGGTGACTGA 3′ SEQ ID NO:7; 5′ GAGCGGTCTAAATTCCGACCCTTATTTC 3′ SEQ ID NO:8; TQPALFQ 6FAM 5′ 6FAM-AAACGATGGCAGGAGTGCCCTTTTTCTATCAAT-BHQ1 3′ HPT2S SEQ ID NO:9; 5′ ACACTACATGGCGTGATTT 3′ HPT2A SEQ ID NO:10; 5′ AGCATCAGCTCATCGAGA 3′ HPTFQ SEQ ID NO:11; 5′ Cy5/ ACTGTGATGGACGACACCG/3BHQ2/ 3′ Cy5 40 Аналіз повнорозмірної PTU з використанням Саузерн-блотингу Саузерн-блотинг використовували для визначення патерну інтеграції фрагмента ДНК, що вставляється, і ідентифікації «подій» pDAS5380 і pDAS5381, які містили повнорозмірну PTU. Отримували результати, щоб показати інтеграцію і цілісність трансгенів, вставлених в геном тютюну. Результати Саузерн-блотингу використовували, щоб ідентифікувати просту інтеграцію 15 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтактної копії Т-ДНК з pDAS5380 і pDAS5381. Докладний Саузерн-блотинг здійснювали із застосуванням зондів, специфічних до касет експресії генів. За допомогою гібридизації вказаних зондів з геномної ДНК, яка була розщепленням специфічними ферментами рестрикції, ідентифікували фрагменти геномної ДНК з молекулярною масою, характер розподілу яких можна аналізувати з метою виявлення «подій» для просування в T 1. Вказані аналізи також показали, що фрагмент плазміди був вставлений в геномну ДНК тютюну без реаранжувань PTU. Зразки тканин збирали в 50 мл конічні пробірки (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) і ліофілізували протягом 2 днів. Мацерацію тканин здійснювали з допомогою млина для подрібнення тканин і вольфрамових кульок. Після мацерації тканини геномну ДНК виділяли з ™ використанням набору DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Germantown, MD) згідно з протоколом виробника. Очищену геномну ДНК осаджували і ресуспендували в 500 мкл буфера TE. Геномну ДНК потім очищали із застосуванням набору Qiagen Genomic Tips™. Кількість геномної ДНК визначали за допомогою набору реактивів Quant-IT Pico Green™ (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). Кількість геномної ДНК доводили до 8 мкг у відповідному об'ємі. Для кожного зразка 8 мкг геномної ДНК ретельно розщеплювали ферментами рестрикції Mfel і Nsil (New England Biolabs, Beverley, MA). Зразки інкубували при 37С протягом ночі. Розщеплену ДНК концентрували осадженням розчином Quick Precipitation Solution™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) відповідно до протоколу, що пропонується виробником. Геномну ДНК потім ресуспендували в 25 мкл води при 65С протягом 1 години. Ресуспендовані зразки вміщували в 0,8% агарозний гель, приготований в 1х TAE, і проводили електрофорез протягом ночі при 1,1 В/см в 1х TAE буфері. Гель послідовно піддавали денатурації (0,2 M NaOH/0,6 M NaCl) протягом 30 хвилин і нейтралізації (0,5 M Tris-HCl (pH 7,5)/1,5 M NaCl) протягом 30 хвилин. Перенесення фрагментів ДНК здійснювали шляхом пасивного протікання 20x розчинів ™ SSC протягом ночі через гель на оброблену Immobilon NY+ блотинг-мембрану (Millipore, Billerica, MA) з використанням гньоту з хроматографічного паперу і паперових рушників. Після перенесення мембрани швидко промивали 2x SSC, зшивали з Stratalinker™ 1800 (Stratagene, LaJolla, CA), і висушували у вакуумі при 80С протягом 3 годин. Блоти інкубували з розчином для попередньої гібридизації (Perfect Hyb plus™, Sigma, St. Louis, MO) протягом 1 години при 65С в скляних ролерних флаконах із застосуванням інкубатора для гібридизації, модель 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). Зонди готували з ПЛР-фрагменту, що містить повну кодуючу послідовність. Амплікон ПЛР очищали із 32 застосуванням набору для екстракції з гелю QIAEX II™ і мітили P-dCTP за допомогою набору ™ для мічення Random RT Prime IT (Stratagene, La Jolla, CA). Блоти гібридизували протягом ночі при 65С з денатурованим зондом, доданим безпосередньо в гібридизаційний буфер приблизно до 2 мільйонів імпульсів на блот на мл. Після проведення гібридизації блоти послідовно відмивали при 65С 0,1 х SSC/0,1% SDS протягом 40 хвилин. На закінчення блоти експонували на хемілюмінесцентну плівку, (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) і отримували зображення із ™ застосуванням системи візуалізації Molecular Dynamics Storm 860 . Очікувані і розміри фрагментів, що спостерігаються при використанні певного розщеплення і зонда, виходячи з відомих сайтів рестрикції ферментами фрагментів pDAS5380 або pDAS5381, подані на Фіг. 3 і 4. Аналізи Саузерн-блотингу, виконані в даному дослідженні, використовували для ідентифікації «подій», які містили повнорозмірні інтактні PTU з плазмід pDAS5380 або pDAS5381, які вставляли в геном тютюну (Фіг. 3 і 4 відповідно). Перевірка експресії GUS Щоб перевірити, чи містили трансгенні рослини pDAS5380 функціональну касету експресії PTU GUS, зразки листя збирали і проводили гістохімічне фарбування для визначення експресії 2 GUS. Листові диски (- 0,25 см ) різали і вміщували в 24-ямковий планшет (1 листовий диск на ямку), що містить 250 мкл реакційного розчину GUS (Jefferson (1989) Nature 342:837-8). 24ямковий планшет обгортали плівкою Nescofilm (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) і інкубували при 37С протягом 24 годин. Через 24 години реакційний розчин GUS видаляли з кожної ямки і замінювали 250 мкл 100% етанолу. Планшет обгортали плівкою Nescofilm і інкубували при кімнатній температурі протягом 2-3 годин. Етанол видаляли і замінювали свіжим етанолом. Листові диски потім оглядали під препарувальною лупою. Листові диски, які були забарвлені в блакитний колір, оцінювали, як такі, що містять функціональну касету експресії GUS PTU. Кількісний аналіз експресії GFP Аналізували експресію GFP в зразках листя тютюну з використанням ELISA. Наносили на планшети очищене кроляче антитіло проти GFP на ніч при 4С. У день проведення аналізу планшети блокували 0,5% BSA в PBST. Дубльовані зразки листя екстрагували кульовим подрібненням частин замороженого листя з 2 намистинами з нержавіючої сталі в гомогенізаторі 16 UA 113493 C2 ™ 5 10 15 20 25 Kleco протягом 3 хвилин при максимальній швидкості. Зразки центрифугували при 3000 g протягом 10 хвилин і збирали супернатанти. Виділені зразки наносили на планшети для проведення тесту ELISA в розведенні 1:5 і 1:50. На кожному планшеті будували калібрувальну криву для рекомбінантного GFP E. coli з концентраціями від 12,5 нг/мл до 0,195 нг/мл. Стандарти і зразки інкубували на планшетах для проведення тесту ELISA протягом 1 години. Планшети відмивали і додавали пероксидазу хрону, кон’юговану з кролячим антитілом проти GFP. Після 1 часу інкубації планшети відмивали і додавали субстрат. Після розвитку фарбування зупиняли реакцію додаванням H2SO4. Оптичну густину визначали з допомогою планшетного рідера при 450 нм з фільтром порівняння 650 нм. Квадратичну стандартну криву будували шляхом нанесення по точках концентрації стандарту Е. coli в залежності від OD. Концентрації в зразках, що досліджуються, визначали за допомогою лінійної регресії. Селекція рослин T0 для продукції T1-мішеней Усього регенерували 68 Basta-стійких, GUS+/GFP+ рослин і виявили, що 38 рослин містили 1-2 трансгенні копії, виходячи з результатів тесту PAT Invader. Саузерн-блотинг виявив 14 однокопійних «подій», з яких 8 показали смуги, які відповідали інтактним PTU: PAT, GUS і GFP. Три «події» pDAS5380, що демонструють однокопійну, повнорозмірну PTU, і що експресують GUS і GFP, pDAS5380-3, pDAS5380-18 і pDAS5380-46, самозапилювали для отримання насіння T1. Кількісний аналіз експресії FokI Використовували кількісну ПЛР в реальному часі (ПЛП-РЧ) для кількісного визначення рівня експресії мРНК нуклеази «цинкові пальці» в рослинах тютюну T 0, трансформованих pDAS5381. Аналіз здійснювали для кількісного визначення відносного рівня експресії мРНК FokI в зразках листя тютюну, при нормалізації вказаних рівнів відносно рівня експресії мРНК, отриманого для вхідної мРНК. Нормалізація значення мРНК FokI відносно загальної мРНК дозволяє порівняти рівень експресії FokI в різних зразках і може бути використана для виявлення «подій», які, ймовірно, є такими, що високо експресуються. Відносна експресія ZFN наводиться в Таблиці 1.1. Таблиця 1.1 Кількісне визначення рівня експресії мРНК нуклеази «цинкові пальці» в рослинах тютюну T 0, трансформованих pDAS5381. *qRT-PCR для мРНК FokI, нормалізованої по загальній РНК. Середнє значення 4 повторних проб. Подія T0 pDAS5381-14 pDAS5381-18 pDAS5381-30 pDAS5381-39 pDAS5381-49 pDAS5381-54 pDAS5381-56 30 35 40 45 Відносна експресія ZFN* 3,21 41,30 8,39 17,70 47,55 4,45 11,73 Стандартне відхилення 1,56 1,56 0,86 1,92 1,79 0,57 2,5 % CV 36,0 3,8 10,3 10,8 3,8 12,8 21,3 Матеріал листя рослин тютюну T 0, яке було трансформоване pDAS5381, збирали і вміщували на лід. Загальну РНК виділяли із застосуванням набору Qiagen's RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD). Загальну мРНК обробляли ДНКазою, що не містить РНКазу, згідно з рекомендацією виробника, щоб видалити будь-яке забруднення ДНК, яка може ампліфікуватися під час проведення кількісної ПЛР-РЧ. Синтез першого ланцюга проводили ™ згідно з інструкціями виробника ферменту зворотної транскриптази Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) і подавали із застосуванням випадкових гексамерів. Синтезовані ланцюги кДНК розводили у воді у відношеннях 1:10 і 1:50. Кожну аліквоту зберігали при -20С. Реакцію ПЛР-РЧ здійснювали таким чином: прямий праймер FokI_UPL_F (SEQ ID NO: 12), зворотний праймер FokI_UPL_R (SEQ ID NO: 13), зонд UPL#130 (каталожний #04693663001, Roche, Indianapolis, IN), 1x LC480 буфер для зондів (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), і 1,5 мкл синтезованої кДНК в 15 мкл реакційній суміші. Робили серійне розведення синтезованої кДНК, проводили аналіз в повторах. Коктельну суміш ампліфікували із застосуванням набору зондів LightCycler 480 Probes Master kit #04707494001 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Розмічали і підписували 96-ямковий мікропланшет, додавали по 13,5 мкл реакційної суміші в ямку. Плівку, що сама клеїться, обережно приклеювали до мікропланшету. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Qiagen. Плівку, що сама 17 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 клеїться, видаляли і додавали 1,5 мкл розчину розморожених, розведених синтезованих ланцюгів кДНК. Плівку, що сама клеїться, міцно прикріпляли до планшета і центрифугували як описано раніше. Програму ПС запускали таким чином: i) активація, 95С протягом 5 хвилин; ii) денатурація, 95С протягом 10 сек. (@ 4,8С/сек.); iii) відпал/подовження, 60С протягом 25 сек. (@ 2,5С/сек.); iv) отримання, 72С протягом 1 сек. (@4,8С/сек.); стадії ii-iv повторювали 45 разів; vi) охолоджування 38С протягом 5 сек.) Аналіз ПЛР-РЧ для кількісного визначення експресії мРНК внутрішнього референсного гену виконували як інший метод для нормалізації експресії мРНК нуклеази «цинкові пальці». Реакцію ПЛР-РЧ для актину здійснювали таким чином: прямий праймер BY2ACT89S (SEQ ID NO: 14), зворотний праймер BY2ACT89A (SEQ ID NO: 15), зонд BYACTFQ (SEQ ID NO: 18), 1x LC480 буфер для зондів, і 2,0 мкл синтезованої кДНК, в 10 мкл реакційної суміші. Робили серійне розведення синтезованої кДНК, проводили аналіз в повторах. Крім того, додавали 2 мкл стандартів плазмідної ДНК з відомою кількістю піків, щоб розділити ямки в серіях розведення від найбільш низької до найбільш високої концентрацій, і ці стандарти порівнювали з кДНК актину (синтезованої із загальної мРНК), щоб визначити кількість числа піків. Серії стандартів числа піків ДНК актину створювали клонуванням цільового амплікону в плазміду pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), і отриманням серій розведення, приготованих в буфері для розведення (10 мМ Tris-HCl [pH 8,0], 100 мкг/мл тРНК дріжджів), для визначення кількості числа піків. Коктельну суміш ампліфікувалиіз застосуванням набору зондів LightCycler 480 Probes Master kit #04707494001 (Roche Diagnostics, USA). Розмічали і підписували 96-ямковий мікропланшет, і додавали і по 8,0 мкл реакційної суміші в ямці. Плівку, що сама клеїться, обережно приклеювали до мікропланшету. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Qiagen. Плівку, що сама клеїться, видаляли і додавали 2,0 мкл розчину розморожених, розведених синтезованих ланцюгів кДНК або плазмідної ДНК. Плівку, що сама клеїться, міцно прикріпляли до планшету і центрифугували, як описано раніше. Програму ПС запускали таким чином: i) активація, 95С протягом 10 хвилин; ii) денатурація, 95С протягом 10 сек. (@ 4,8С/сек.); iii) відпал/подовження, 56С протягом 40 сек. (@ 2,5С/сек.); iv) отримання, 72С протягом 1 сек. (@ 4,8С/сек.); стадії ii-iv повторювали 45 разів; vi) охолоджування до 38С протягом 5 сек. Селекція рослин T0 для продукції ексцизійних T1 Всього регенерували 54 гігроміцин-стійких рослин і виявили, що 34 рослини містили 1-2 копії трансгену, на основі методу гідролізних зондів. Саузерн-блотинг ідентифікував 12 однокопійних «подій», з яких 7 демонстрували смуги, що відповідають інтактним PTU HPT і ZFN. «Події» T0 pDAS5381, що демонструють одну копію трансгену, повнорозмірну PTU, і що експресують FokI, pDAS5381-18, pDAS5381-49 і pDAS5381-56, піддавали самозапиленню для отримання насіння T1. Приклад III. Відтворення і відбір рослин T 1 Самозапилення рослин T0 для отримання гомозиготних рослин Наступні рослинні «події» T 0: pDAS5380-3; pDAS5380-18; pDAS5380-46; pDAS5381-18; pDAS5381-49; і pDAS5381-56 вирощували до дозрівання і самозапилювали для отримання насіння T1. Після проростання рослини T1, які були гомозиготними по конструкціях pDAS5380 і pDAS5381, використовували для делеції трансгену. Відповідно до менделевського успадкування, схрещування гомозиготних однокопійних рослин T 1 pDAS5381 з гомозиготними однокопійними рослинами T1 pDAS5380 дає популяцію F1, що містить гетерозиготну унікальну копію обох конструкцій pDAS5381 і pDAS5380. Передбачалося, що потомство даного схрещування містить одну копію репортерного гену GUS. По суті, рослина F 1, що не експресує GUS, показує, що касета експресії PTU GUS була вирізана. Рослини T0 вирощували при довжині світлового дня 16:8 годин, з денними і нічними температурами в діапазоні 22-24С. Коли первинне квіткове стебло починало довшати і утворювати бутони, рослину цілком накривали мішечком для самозапилення, щоб запобігти випадковому схрещуванню. Насіння, отримане в результаті самозапилення, збирали приблизно через вісім тижнів після висаджування рослин. Насіння самозапилених рослин збирали і вміщували в грунт. Отримувані популяції T 1 вирощували в теплиці в умовах, описаних вище. Молекулярний скринінг рослин T 1 Аналіз зиготності Аналіз кількісного визначення зиготності рослин T 1 виконували із застосуванням методу гідролізних зондів, описаного вище (аналіз числа піків). Проводили аналіз результатів ПЛР в режимі реального часу і число піків трансгену, що містяться в рослинах T 1, визначали шляхом порівняння з числом піків контролю. Для цього в аналіз включали зразок геномної ДНК з 18 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 батьківської рослини T0, який, як було показано раніше, містить однокопійний калібратор. Ідентифікували гомозиготні рослини T 1 pDAS5380 і pDAS5381. Перевірка експресії GUS Для просування експериментів по схрещуванню важливо було ідентифікувати експресуючі «події». Рослини T1 pDAS5380 перевіряли з використанням протоколу, описаного вище (Перевірка експресії GUS). Тестували рослини pDAS5380, які були відібрані як гомозиготні по конструкції pDAS5380, за результатами тесту на гомозиготність, описаного вище. Всі рослини давали блакитне фарбування. Кількісний аналіз експресії GFP Рослини T1 pDAS5380 тестували з використанням протоколу, описаного вище (кількісний аналіз експресії GFP). Тестували рослини pDAS5380, які були відібрані як гомозиготні по конструкції pDAS5380, внаслідок перевірки гомозиготності, як описано вище. Всі рослини, що тестуються, були позитивними по експресії GFP. Кількісний аналіз експресії FokI Використовували кількісний метод ПЛР в реальному масштабі часу PCR (ПЛР-РЧ) для кількісного визначення мРНК нуклеази «цинкові пальці» в гомозиготних рослинах тютюну T 1 pDAS5381, трансформованих pDAS5381. Протоколи, описані вище, (Кількісний аналіз експресії FokI), використовували для скринінгу рослин T 1 для підтвердження, що нуклеаза «цинкові пальці» була експресуючою, і для ідентифікації «подій», які могли б продукувати стійкі кількості нуклеази «цинкові пальці» для вирізання касети експресії PTU GUS. Селекція рослин T1 Проводили скринінг «подій» T 1 pDAS5380 на зиготність і експресію GUS і GFP. Проводили скринінг «подій» T1 pDAS5381 на зиготність і експресію FokI. Виходячи з вказаних результатів, «події» T1 відбирали для схрещування. Вказані «події» були визначені як оптимальні, оскільки вони являли собою гомозиготні, однокопійні, повнорозмірні «події», що експресують трансген. Крім того, рослини сибс-нуль pDAS5381 зберігали для застосування як контролі. Вказані «події» не містили касету експресії PTU нуклеази «цинкові пальці». Трансген не успадковувався вказаними рослинами T1 в результаті сегрегації трансгену. Відібрані «події» вирощували до зрілого стану і схрещували для отримання рослин F1, щоб тестувати вирізання трансгену з допомогою нуклеази «цинкові пальці». Стратегія схрещування викладена нижче. Схрещування гомозиготних рослин Т 1 для отримання F1 Відібрані рослини pDAS5380 схрещували з відібраними рослинами pDAS5381. Крім того, проводили зворотні схрещування, так що батьками були чоловіча і жіноча форми (Таблиця 2). Рослини схрещували вручну; пилок з пильовиків зрілої чоловічої батьківської форми вводили в рильце зрілої жіночої батьківської форми. Рослини, готові до схрещування, прибирали від інших рослин, щоб зменшити імовірність того, що жіночі форми рослин тютюну будуть запилені непередбаченим пилком. Жіночі форми рослин кастрували (пильовики видаляли перед розкриттям) використовуючи пінцет, за 15-30 хвилин до запилення чоловічою формою квітки. Квітки відбирали для кастрування, беручи до уваги пильовики і забарвлення квіток. Знову відкриті квітки мали яскраво-рожеву облямівку, і пильовики були всі ще закриті. Квітки, що містили пильовики, які були відкриті або частково відкриті, не використовували. Рясні квітки, на стеблі рослини тютюну, кастрували і запилювали. Додаткові квітки на стеблі (наприклад, вже запилені коробочки, старі квітки, дуже молоді бутони і т.д.) видаляли пінцетом, щоб гарантувати, що коробочки, що утворилися на гілці, були отримані в результаті схрещування, що контролюється. На гілку прикріпляли етикетку, в якій указано зроблене схрещування, скільки скрещувань зробили і дата запилення. Пильовики у чоловічої форми рослини повністю видаляли пінцетом, і використовували для запилення вихолощеної жіночої форми. Пильовиками чоловічої форми, що розтріскуються, торкалися клейкої рецептивної поверхні рильця жіночого особня доти, поки рильце не покривалося пилком. Рильце покривали пилком декілька разів, щоб знизити імовірність непередбаченого запилення яким-небудь пилком, що має доступ до рильця жіночої форми рослини. Насіння запліднених рослин збирали і вміщували в ґрунт. Отримувані рослини-нащадки F2 вирощували в теплиці в умовах, описаних вище. 19 UA 113493 C2 Таблиця 2 Матриця експериментального схрещування події-мішені 5380-03 5380-18 5380-46 Null Events 5 10 5381-18 5381-18-17 X 5380-3-6 5381-18-22 X 5380-18-17 5381-18-17 X 5380-46-15 5381-56-12 X 5380-3-10 и 5380-25-10 Ексцизійні події 5381-49 5381-56 5381-49-16 5381-56-5 X X 5380-3-12 5380-3-21 5381-49-16 5381-56-37 X X 5380-18-22 5380-18-22 5381-49-10 5381-56-5 X X 5380-46-15 5380-46-15 5381-56-12 5381-56-12 X X 5380-3-10 и 5380-25-10 5380-3-10 и 5380-25-10 Приклад IV: Аналіз рослин F1 у відношенні ZFN-опосередкованої делеції трансгену Тестування GUS Рослини F1 тестували у відношенні експресії GUS за допомогою гістохімічного фарбування матеріалу листя. Скринінг GUS являв собою попередній тест для ідентифікації «подій», які перенесли делецію трансгену, опосередковану ZFN. Результати скринінгу GUS не передбачалися як заключні, але, швидше, були індикатором для визначення рослин для подальшого молекулярного аналізу. Рослини F1 тестували з використанням протоколу, описаного вище (Перевірка експресії GUS). Результати представлені в Таблиці 3. Таблиця 3 Експресія GUS в гібридах F1 Події-мішені Ексцизійні Зворотне 5380-03 5380-18 5380-46 події схрещування Тестовані Тестовані Тестовані GUS- % GUS% GUSрослини рослини рослини ♀ 479 15 3,1 490 3 0,6 450 7 5381-18 ♂ 459 44 9,6 480 21 4,4 ♀ 452 157 34,7 474 32 5381-49 ♂ 465 67 14,4 467 17 3,6 485 69 ♀ 437 4 0,9 476 0 0 465 3 5381-56 ♂ 470 7 1,5 450 3 ♀ 441 8 1,8 453 11 NULL ♂ 446 4 0,9 490 11 15 20 25 % 1,6 6,8 14,2 0,7 0,7 2,4 2,2 Саузерн-блотинг Саузерн-блотинг використовували для отримання молекулярної характеристики вирізання касети експресії PTU GUS нуклеазою «цинкові пальці». Результати виявили вирізані касети експресії PTU GUS у різновиду «подій», невирізані касети експресії PTU GUS у іншого різновиду «подій», і різновид химерних «подій», які містили вирізані і невирізані касети експресії PTU GUS. Детальний Саузерн-блотинг проводили із застосуванням зонду, специфічного до касети експресії PTU GFP. Гібридизація зонда з геномної ДНК, яка була фрагментована специфічними фрагментами рестрикції, ідентифікувала фрагменти ДНК з певною молекулярною вагою. Вказані типи можуть бути аналізовані для ідентифікації «подій», які містили вирізану касету експресії PTU GUS, містили інтактну касету експресії PTU GUS, або були химерними і містили вирізану і інтактну касету експресії PTU GUS. Рестрикційне розщеплення виконували з 10 мкг кожного зразка в 1х буфері 4 і 100 одиницями Ndel (New England BioLabs, Ipswich, MA) в кінцевому об'ємі 350 мкл, при 10-кратному надлишку ферментів розщеплення. Зразки інкубували при 37С протягом ночі. Розщеплену ДНК 20 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 концентрували повторним осадженням розчином Quick Precipitation Solution™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) відповідно до протоколу, що пропонується виробником. Отримувана суміш ресуспендували в 30 мкл 1x буфера для внесення і інкубували при 65С протягом 30 хвилин. Ресуспендовані зразки наносили на 0,8% агарозний гель, приготований в буфері 1x TAE (0,8 M Трис-ацетат [pH 8,0]/0,04 мМ EDTA) і проводили електрофрез протягом ночі при 1,1 В/см в 1x TAE буфері. Гель послідовно піддавали денатурації (0,2 M NaOH/0,6 M NaCl) протягом 30 хвилин, і нейтралізації (0,5 M Tris-HCl [pH 7,5]/1,5 M NaCl) протягом 30 хвилин. Перенесення фрагментів ДНК здійснювали шляхом пасивного протікання 20x розчинів SSC протягом ночі ™ через гель на оброблену Immobilon NY+ блотинг-мембрану (Millipore, Billerica, MA) з використанням гньоту з хроматографічного паперу і паперових рушників. Після перенесення ™ мембрану швидко промивали 2x SSC, зшивали з Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) і висушували у вакуумі при 80С протягом 3 годин. Блоти інкубували з розчином для попередньої гібридизації протягом 1 години при 65С в скляних ролерних флаконах із застосуванням інкубатора для гібридизації. Зонд виготовляли з ПЛР-фрагмента, що містить кодуючу послідовність gfp, яку очищали із застосуванням набору для екстракції з гелю Qiagen і мітили 50 32 мкКі ( P-dCTP з використанням набору для мічення. Блоти гібридизували протягом ночі при 65С з денатурованим зондом, доданим безпосередньо в буфер гібридизації приблизно до 2 мільйонів імпульсів блот на мл. Після проведення гібридизації блоти послідовно відмивали при 65С 0,1 х SSC/0,1% SDS протягом 40 хвилин. Блоти експонували касети з екраном Phosphorimager screen і отримували зображення із застосуванням системи візуалізації Molecular ™ Dynamics Storm 860 . Результати блотів подані на Фіг. 5. Аналіз ПЛР одиниці транскрипції рослини Реакції ПЛР здійснювали, щоб охарактеризувати вирізання касети експресії PTU GUS. Розробляли праймери, які зв'язувалися з послідовністю MAR і з послідовністю ORF 23 3' UTR (3' UTR для касети експресії PTU GFP). Вказаний амплікон ПЛР охоплює ділянку касети експресії PTU GUS, яка, як очікується, повинна бути вирізана. По суті, застосування вказаних праймерів ПЛР може виявити «події», в яких касета експресії PTU GUS вирізана, «події», в яких вирізання не сталося і химерні об'єкти, в яких касета експресії PTU GUS нерівномірно видалена в «події». Ампліфікація фрагмента 6,7 т.н. показує, що немає вирізання, тоді як ампліфікація фрагмента 2,4 т.н. дозволяє передбачити, що касета експресії PTU GUS була вирізана. Амплікони, що містять фрагменти обох розмірів, служать ознакою того, що касета експресії GUS PTU була видалена не повністю. Геномну ДНК виділяли з тканини тютюнового листя з використанням набору Plant Maxi kit ™ ™ DNeasy , і визначали кількісно з використанням набору реактивів Pico Green DNA Quant-IT , як описано вище. ПЛР для одиниці транскрипції рослини (PCR PTU) виконували з використанням ™ термоциклера Tetrad2 (BioRad, Hercules, CA). Олігонуклеотидные праймеры розробляли для ™ ампліфікації PTU з використанням програмного забезпечення VectorNTI . Для ампліфікації Ex ™ Taq Polymerase (TaKara, Otsu, Shiga, Japan) готували в 1x кінцевій концентрації в 25 мкл об'ємі реакційної суміші Singleplex, що містить 1,2 мкМ кожного праймера (SEQ ID №№: 16 і 17), 0,2 мM dNTP, 2% DMSO, 1,25 одиниць TAQ з використанням 4 нг матриці геномної ДНК. Тристадійну реакцію ампліфікації здійснювали в наступному вигляді; 3 хвилини початкова денатурація при 94С і 33 цикли по 30 секунд при 94С, 6 хвилин при 65,5С, 30 секунд при 72С, із заключною реакцією подовження при 72С протягом 10 хвилин. Аліквоту продукту ПЛР пропускали на 1% гелі з бромідом етидію із застосуванням маркера 1Kb+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) для визначення розміру продукту. Результати реакцій ПЛР PTU подані на Фіг. 6. Секвенування продуктів ПЛР PTU Смуги 2,4 т.н., отримані внаслідок реакцій ПЛР PTU, вирізали з гелю і очищали ДНК із ™ застосуванням набору для екстракції з гелю Qiagen Qiaex II (Qiagen, Germantown, MD). ™ Очищені фрагменти лігували у вектор клонування pCR2.1 TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Присутність клонованого амплікону ПЛР всередині вектора pCR2.1 підтверджували шляхом розщеплення ферментами рестрикції. Клони, що містять смуги, що відповідають продуктам ампліфікації, секвенували. Послідовності місця з'єднання, що отримується внаслідок видалення касети експресії PTU GUS, подані на Фіг. 7a і 7b. Повну касету експресії PTU видаляли. Послідовності, що залишаються, являють собою тільки реаранжовані сайти зв’язування «цинкових пальців», які фланкували касету експресії PTU GUS. Крім того, деякі амплікони ПЛР містили делеції, які розповсюджувалися на промотор актину 2 касети експресії PTU GFP. Аналіз із застосуванням ферментів рестрикції смуги 6,7 т.н. Амплікони ПЛР більш великої смуги 6,7 т.н. аналізували за допомогою розщеплення ферментами рестрикції. Вказані фрагменти розщеплювали рестрикційними ферментами EcoRI і Ncol/Sacl (New England Biolabs, Ipswich, MA). Розміри смуг, що отримуються, аналізували, щоб 21 UA 113493 C2 5 10 15 20 25 30 підтвердити, що ампліфіковані фрагменти включали невирізану геномну вставку трансгену pDAS5380. Самозапліднення рослин F1 для отримання нащадків F2 Показову групу рослин F1, описаних вище, самозапилювали для отримання нащадків F2. У Таблиці 5 перераховані рослини, які відбирали, і фенотип і генотип F 1. Відібрані рослини F1 вирощували в теплиці при довжині світлового дня 16:8 годин, з денними і нічними температурами в діапазоні 22-24С. Коли первинне квіткове стебло починало довшати і утворювати бутони, рослину цілком накривали мішечком для самозапилення, щоб запобігти випадковому схрещуванню. Насіння, отримане в результаті самозапилення, збирали приблизно через вісім тижнів після висаджування рослин. Насіння самозапилених рослин збирали і вміщували в грунт. Отримувані популяції F2 вирощували в теплиці в умовах, описаних вище. Рослини F2 аналізували на подальшу делецію трансгену і успадковуваність делеції, яка була охарактеризована в рослинах F1. Приклад V. Отримання і відбір рослин T 1 Аналіз нащадків F2 на трансген і успадковуваність делеції Аналіз GUS Рослини F2 перевіряли на експресію GUS за допомогою гістохімічного фарбування матеріалу листя. Рослини тестували з використанням протоколу, описаного вище (Перевірка експресії GUS). Результати представлені в Таблиці 5. Результати експресії GUS, отримані в рослинах F2, відповідали очікуваним результатам. Рослини F 1, які ідентифікували, як такі, що містять вирізану касету експресії PTU GUS, виробляли рослини F2, які були 100% GUSнегативними, що підтверджували гістохімічним фарбуванням. Відсутність експресії GUS у вказаних рослинах F2 підтверджує результати, отримані з F1, що дозволяє передбачити, що касета експресії PTU GUS вирізана з допомогою делеції трансгену, опосередковуваної нуклеазою «цинкові пальці». Крім того, отримані результати є прикладом успадковуваності трансгену, що видаляється в подальшій генерації. Сибс-нуль контрольні рослини експресували GUS приблизно у 75% потомства F 2. Інші рослини (приблизно 25%), в яких GUS на виявляли за допомогою гістохімічного фарбування, були очікуваними. Передбачається, що касета експресії PTU GUS сегрегує в популяції F 2 в очікуваному відношенні 3:1. Химерні «події», які містили вирізані і невирізані касети експресії PTU GUS в F1, сегрегували в межах F2. Більшість рослин експресували GUS. Таблиця 5 Експресія GUS в нащадках F2 Схрещування # 95 307 180 83 77 310 265 93 4 214 Позначення схрещування 5380-46-1-15 (5381-49-1-10-003 5381-49-1-10 (5380-46-1-15.018 5380-3-1-6 (5381-18-1-17.002 5380-46-1-15 (5381-49-1-10-015 5380-46-1-15 (5381-49-1-10-021 5381-49-1-10 (5380-46-1-15.015 5381-49-1-16 (5380-3-1-12.017 5380-46-1-15 (5381-49-1-10-005 5380-18-1-22(5381-491-14(нуль).017 5381-56-1-6(нуль) (5380-46-1-23.010 Молекулярний/фенотипічний опис FI # рослин, # GUS # GUS що + тестуються Вирізаний/GUS 405 0 405 Вирізаний/GUS 480 0 480 Вирізаний/GUS 445 0 445 Вирізаний/GUS 375 0 375 Вирізаний/GUS 427 0 427 Вирізаний/GUS 442 0 442 Вирізаний/GUS 471 0 471 Вирізаний/GUS 386 0 386 Інтактний/GUS+ (нуль) 473 356 117 Інтактний/GUS+ (нуль) 480 377 102 22 UA 113493 C2 Таблиця 5 Експресія GUS в нащадках F2 Схрещування # 292 189 335 350 331 53 5 10 15 20 25 Позначення схрещування 5381-49-1-14(нуль) (5380-18-1-22.013 5380-46-1-15 (5381-56-1-5.001 5381-18-1-17 (5380-46-1-15.011 5381-18-1-17 (5380-18-1-22.020 5381-18-1-17 (5380-46-1-15.016 5380-46-1-15 (5381-18-1-17.014 Молекулярний/фенотипічний опис FI # рослин, # GUS # GUS що + тестуються Інтактний/GUS+ (нуль) 481 370 111 Інтактний/GUS+ 456 345 111 Химерний/GUS+ 449 326 123 Химерний/GUS+ 457 342 114 Химерний/GUS+ 452 347 104 Химерний/GUS+ 470 359 109 Аналіз ELISA з використанням зеленого флуоресцентного білка Відібрані рослини F2 тестували на експресію GFP методом ELISA з використанням протоколу, описаного вище (Кількісний аналіз експресії GFP). Результати експресії GFP в рослинах F2 відповідали очікуваним результатам. Рослини F 1 експресували GFP приблизно в 75 % потомства F2. Інші рослини (приблизно 25 %), в яких не виявляли GFP з допомогою ELISA, були очікуваними. Передбачається, що касета експресії PTU GFP сегрегує в популяції F 2 в очікуваному відношенні 3:1. Химерні "події", які містили вирізані і невирізані касети експресії PTU GFP в F1, сегрегували в F2. Більшість рослин експресувало GFP. ПЛР, Саузерн-блотинг, і аналіз GFP в потомстві F2 Шістнадцять рослин, отриманих в результаті трьох схрещувань, перерахованих в Таблиці 5 (що являють собою нащадків з вирізаним геном, інтактних нащадків і химерних нащадків) зберігали для подальшого молекулярного аналізу. Вказані шістнадцять рослин включали вісім рослин, які були GUS-позитивними, і вісім рослин, які були GUS-негативними по відношенню до контролю сибс-нуль і химерних рослин. Протоколи, описані вище (Саузерн-блотинг; і аналіз ПЛР одиниці транскрипції рослини), повторювали з геномною ДНК рослин F 2. Відібрані рослини F2 тестували на експресію GFP з допомогою ELISA з використанням протоколу, описаного вище (Кількісний аналіз експресії GFP). Молекулярні дані підтверджують, що рослини, які не експресували GUS, не містять інтактної касети експресії PTU GUS. Експресія GFP сегрегувалась, як очікувалося. Результати подані на Фіг. 8-13. Незважаючи на те, що ряд ілюстративних аспектів і варіантів здійснення обговорювався вище, фахівцям в даній галузі будуть зрозумілі їх певні модифікації, перетворення, доповнення і субкомбінації. Таким чином, потрібно розуміти, що нижченаведена формула винаходу і пункти формули винаходу, привнесені надалі, тлумачаться як такі, що включають в себе всі такі модифікації, перетворення, доповнення і субкомбінації, оскільки вони відповідають суті і об'єму винаходу. Посилання, що обговорюються в описі, надаються виключно для їх розкриття до дати реєстрації даної заявки. В описі немає нічого, що потрібно розглядати як визнання, що автори не мають права датувати заднім числом таке розкриття внаслідок попереднього винаходу. 23 UA 113493 C2 24 UA 113493 C2 25 UA 113493 C2 26 UA 113493 C2 27 UA 113493 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 1. Спосіб видалення ділянки ДНК в рослині, згідно з яким: надають першу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК і першу послідовність розпізнавання, що фланкує 3'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'-кінець ділянки ДНК, де перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання ідентичні; вводять ДНК, яка кодує нуклеазу "цинкові пальці" у другу життєздатну рослину, в якій нуклеаза "цинкові пальці" сконструйована таким чином, щоби розщепити геномну ДНК в послідовності розпізнавання, і де нуклеаза "цинкові пальці" функціонально зв'язана з тканиноспецифічним промотором, специфічним для стадії розвитку; схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що насінина F1 продукується або на першій, або на другій життєздатній рослині, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК насінини F1; і вирощують одержувану рослину F 1, що містить геномну ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК пилку і/або насінини рослини F1. 2. Трансгенна рослина, отримана способом за п. 1, де трансгенна рослина містить ділянку ДНК в тканині, відмінній від пилку і/або насінини. 28

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Excision of transgenes in genetically modified organisms

Автори англійською

Russell, Sean, Petolino, Joseph F.

Автори російською

Расселл Шон, Петолино Джозеф Ф.

МПК / Мітки

МПК: A01H 5/00, C12N 15/29, C12N 15/82, C12N 9/22, A01H 1/02

Мітки: днк, спосіб, ділянки, рослини, видалення

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/46-113493-sposib-vidalennya-dilyanki-dnk-v-roslini.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб видалення ділянки днк в рослині</a>

Подібні патенти