Антиінтегриновий імунокон’югат та способи лікування за його допомогою

1. Кон'югат антитіло-ліки формули , де антитіло являє собою альфа V інтегринове субодиничне специфічне антитіло людини, де зазначене антитіло здатне інтерналізуватись клітиною, що експресує зазначену альфа V субодиницю, де даний маутансинол підданий етерифікації по С-3: R1, R2, Х1 та Х2 являють собою, незалежно, Н, Me, С2Н5, лінійний алкіл або алкеніл, що має від 1 до 10 вуглецевих атомів, розгалужений або циклічний алкіл або алкеніл, що має від 3 до 10 вуглецевих атомів, феніл, заміщений феніл або гетероциклічну арильну складову, або гетероциклоалкільну складову; n дорівнює 1-5; р дорівнює 1-5; і m дорі (19) UA (11) 94388 (13) C2 (21) a200706239 (22) 30.11.2005 (24) 10.05.2011 (86) PCT/US2005/043250, 30.11.2005 (31) 60/634,445 (32) 09.12.2004 (33) US (46) 10.05.2011, Бюл.№ 9, 2011 р. (72) ЧЕН КІМІНГ, CN/US, ТРІХА МОХІТ, US, ЛЮТЦ РОБЕРТ ДЖ., US, СТІВС РІТА М., US, АМФЛЕТТ ГОДФРЕЙ, US (73) ЦЕНТОКОР, ІНК., US (56) WO 00/64480 A, 02.11.2000 EP 0 425 235 A, 02.05.1991 2 3 внює 1-10, та його фармацевтично прийнятні солі та ефіри. 2. Кон’югат антитіла за п. 1, який відрізняється тим, що в ньому дане антитіло конкурує за зв’язування з альфа V інтегрином людини з моноклональним антитілом CNTO 95 або його фрагментом, що має таку саму активність, як саме антитіло. 3. Кон’югат антитіла за п. 1, який відрізняється тим, що в ньому молекула антитіла являє собою моноклональне антитіло CNTO 95 або рекомбінантне антитіло, котре має принаймні одну із варіабельних ділянок (CDR) CNTO 95, як показано у SEQ ID NO: 1-6 або, як показано, консервативні заміщення принаймні однієї CDR. 4. Кон’югат антитіла за п. 2, який відрізняється тим, що в ньому дане моноклональне антитіло конкурує з Mab CNTO 95 зв’язуванням з живими клітинами, які експресують альфаVбета3 інтегрин людини. 5. Кон’югат антитіла за п. 1, який відрізняється тим, що в ньому молекула антитіла є специфічною щодо епітопу в амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 9. 6. Кон’югат антитіла за п. 1, який відрізняється тим, що в ньому дане антитіло є людським, гуманізованим або химерним антитілом. 7. Кон’югат антитіла за п. 1, де m дорівнює 3 або 4. 8. Кон’югат антитіла за п. 1, де n = 2, R1 і R2 обидва являють собою метил, р дорівнює 2 та Х1 та Х2 являють собою Н. 9. Спосіб одержання кон’югата за п. 1, що включає стадії: (а) введення однієї або кількох вільних або захищених тіольних груп в молекулу антитіла, котра є специфічною до людських альфа V субодиничних інтегринів; (b) реакції молекули антитіла зі стадії (а) зі сполукою, котра є токсичною до клітин з ЕС50 10-9 М або менше, зазначена сполука має одну або кілька дисульфідних або тіольних груп; і (с) відновлення результуючого кон’югата. 10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що в ньому дана токсична сполука являє собою маутансиноїд. 11. Спосіб за п. 9 або 10, який відрізняється тим, що в ньому для введення вільної або захищеної тіольної групи в молекулу антитіла використовуються (2-піридил)-3-дитіопропанової кислоти Nгідроксисукцинімідний ефір (SPDP), (2-піридил)-4дитіопентанової кислоти N-гідроксисукцинімідний ефір (SPP), або (2-піридил)-4-дитіобутанової кислоти N-гідроксисукцинімідний ефір (SPDB). 12. Фармацевтична композиція, що містить кон’югат за будь-яким з пп. 1-8 та фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. 13. Спосіб застосування кон’югата за будь-яким з пп. 1-8 для одержання фармацевтичної композиції для лікування раку. 14. Спосіб лікування раку у пацієнта, котрий потребує цього, що включає призначення даному пацієнту терапевтично ефективної кількості кон’югата згідно з будь-яким із пп. 1-8, де рак являє собою аденокарциному молочної залози, легеневу аденокарциному, аденокарциному підшлункової залози, аденокарциному товстої кишки, 94388 4 карциному ренальних клітин або аденокарциному шлунка. 15. Спосіб лікування раку за п. 14, де рак являє собою епідермоїдний рак голови та шиї, епідермоїдний рак стравоходу, епідермоїдний рак легень, епідермоїдний рак шкіри або нервікальний епідермоїдний рак. 16. Спосіб застосування кон’югата за будь-яким з пп. 1-8 для лікування або запобігання метастатичному поширенню раку, що включає призначення даному пацієнту терапевтично ефективної кількості кон’югата згідно з будь-яким із пп. 1-8. 17. Спосіб інгібування росту ракових клітин у ссавця, що потребує цього, який включає призначення даному ссавцю кон’югата моноклонального антитіла згідно з будь-яким з пп. 1-8, котрий запобігає зв’язуванню CNTO 95 з живими клітинами, що експресують людський альфаVбета3 інтегрин, у кількості, ефективній для інгібування росту зазначених ракових клітин у зазначеного ссавця. 18. Спосіб за п. 17, де кон’югат антитіла вводять внутрішньовенно. 19. Спосіб за п. 18, де кон’югат антитіла застосовують у кількості від 0,05 мг/кг до 12,0 мг/кг ваги тіла. 20. Спосіб за п. 17, де ссавець є людським пацієнтом. 21. Спосіб інгібування ангіогенезу у ссавця, що потребує цього, котрий включає призначення даному ссавцю з хворобою, яка залежить від ангіогенезу, кон’югата моноклонального антитіла згідно з будь-яким із пп. 1-8, котрий запобігає зв’язуванню CNTO 95 з живими клітинами, що експресують людський альфаVбета3 інтегрин, у кількості, ефективній для інгібування зазначеного ангіогенезу, де хвороби, які залежать від ангіогенезу вибираються із групи, яка складається із метастатичного раку, ангіоми, ангіофіброми, діабетичної ретинопатії, ретинопатії недоношених дітей, неоваскулярної глаукоми, корнеальної хвороби, індукованої ангіогенезом, інволюційних плям, дегенерації жовтої плями, птеригія, ретинальної дегенерації, ретролентальної фіброплазії, гранулярного кон’юктивіту, псоріазу, телеангіектазії, піогенної гранульоми, себорейної екземи, акне та артриту. 22. Спосіб послаблення запальної хвороби у ссавця, що потребує цього, який включає призначення ссавцю, що потребує цього, кон’югата моноклонального антитіла згідно з будь-яким із пп. 1-8, котрий запобігає зв’язуванню CNTO 95 з живими клітинами, які експресують людський альфаVбета3 інтегрин, у кількості, ефективній для послаблення одного або кількох симптомів зазначеної запальної хвороби, котра вибирається із групи, яка складається із ревматоїдного артриту, дегенерації жовтої плями, псоріазу, діабетичної ретинопатії. 23. Спосіб за п. 21, де моноклональне антитіло лікує ангіогенний розлад шкіри, що вибирають із групи, котра складається із псоріазу, венозних виразок, акне, рожевих вугрів, бородавок, екземи, гемангіом та лімфангіогенезу. 24. Спосіб за п. 21, де моноклональне антитіло лікує розлад, який включає корнеальну або ретинальну неоваскуляризацію. 5 94388 6 25. Спосіб за будь-яким з пп. 14-24, де антитіло вводять у комбінації з другим терапевтичним або профілактичним агентом, або засобом. 26. Виріб, що включає кон’югатну композицію за будь-яким з пп. 1-8 та контейнер. 27. Кон’югат антитіла за п. 1, де n = 2, R1 і R2 обидва являють собою метил, р дорівнює 2. 28. Кон’югат антитіла за п. 1, де антитіло включає (і) всі амінокислотні послідовності важких варіабельних ділянок (CDR) CNTO 95, як показано у SEQ ID NO: 1, 2 та 3, та (ІІ) всі амінокислотні послідовності легких варіабельних ділянок (CDR) CNTO 95, як показано у SEQ ID NO: 4, 5 та 6. 29. Кон’югат антитіла за п. 28, де принаймні одна з послідовностей важкої варіабельної ділянки включає послідовність важкої варіабельної ділянки CNTO 95, як показано у SEQ ID NO: 7. 30. Кон’югат антитіла за п. 28, де принаймні одна з послідовностей легкої варіабельної ділянки включає послідовність легкої варіабельної ділянки CNTO 95, як показано у SEQ ID NO: 8. 31. Кон’югат антитіла за п. 1, де антитіло включає важку варіабельну ділянку CNTO 95, як показано у SEQ ID NO: 7, та легку варіабельну ділянку CNTO 95, як показано у SEQ ID NO: 8. 32. Кон’югат антитіла за п. 1, де антитіло являє собою моноклональне антитіло CNTO 95. Галузь винаходу Даний винахід стосується кон'югатів пухлиноспецифічних антитіл з цитотоксичними сполуками. Кон'югати, яким віддається перевага, містять маутансиноїдні сполуки, зчеплені з анти-інтегриновим антитілом через дисульфідний зв'язок. Рівень техніки Відома множина спроб поліпшити ефективність протипухлинних ліків шляхом кон'югації цих ліків з моноклональними антитілами (Mab) проти пухлиноспецифічних антигенів з метою підвищити локальну концентрацію даних ліків шляхом цілеспрямованої доставки до даної пухлини. Навпаки, потенціал антитіл щодо фактичного руйнування пухлинних клітин обмежений тими антитілами, що націлені на блокування проліферативних стимулів, таких як фактори росту EGF та Неr-2, шляхом блокування зв'язування лігандів з рецепторами або блокування передачі сигналів до рецепторів (ErbB1 та ЕrbВ2), або тими, що викликають ефекторні функції (ADCC або CDC). Таким чином, ведуться пошуки продукту, що об'єднує специфічність Mab з вбивчим потенпіалом метаболічної отрути. Прикладами першого с Mab BR96, кон'югований з доксорубіцином (Braslawsky, et al. Cancer Immunol Immunother 33:367-374, 1991), та псевдомоновий екзотоксин, злитий з антитілами або фрагментами проти фактору росту (Kreitment, et al., Intemat. J. Immunopharm. 14(3):465-72, 1992). Ці спроби наштовхнулись на непередбачувані обмеження, такі як потреба у відносно високих внутрішньоклітинних концентраціях токсину у порівнянні з кількістю зовнішніх зв'язувальних сайтів на клітину. Якщо кількість пухлиноспецифічних антигенів на поверхні ракової клітини складає, за 5 оцінками, 10 молекул/клітину, цитотоксичні агенти, що можуть ефективно використовуватись у цих -10 -11 кон'югатах, мають мати ІС50 значення 10 -10 Μ проти ракових клітин-мішеней (Chari, R.V.J. Adv. Drug Delivery Rev. 1998, 31, 89-104). По-друге, дані ліки мають або виділятись при зв'язуванні з мішенню та проникати у клітину, або вся конструкція має транспортуватись у дану клітину, де токсин розщеплюється або іншим чином активується. Деякі із цих вад можуть бути розв'язані у більшій чи меншій мірі шляхом використання високоа ктивних ліків, кон'югованих з інтерналізованим антитілом, та використання хімічного зв'язку, який має підвищену лабільність за внутріклітинних умов. Chari et al. (Cancer Res. 52:127-131, 1992; Lu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623, 1996; US Patent No. 5208020) розробили кон'югати антитіл, де дане антитіло зчеплене з маутансиноїдом через дисульфідний зв'язок. Маутансиноїди являють собою отримані із рослин протигрибкові та протипухлинні агенти. Про виділення трьох петлеподібних мікролідів із етанольних екстрактів Maytenus ovatus та Maytenus buchananii вперше повідомив S.M. Kupchan et al., і це є предметом патенту США за номером 3896111 сумісно з демонстрацією їх протилейкозних ефектів у моделях на мишах при дозах у межах мікрограми/кг. Проте, маутансиноїди мають неприйнятну токсичність, спричинюючи як центральну, так і периферичну невропатії, і побічні ефекти, зокрема, нудоту, блювання, діарею, підсилення реакцій печінкової функції і, не так часто, слабкість та летаргію. Таким чином, протягом деякого часу дослідження фокусувались на пошуку коректної діючої складової сумісно з придатним хімічним процесом для створення кон'югату маутансин-антитіло з прийнятним періодом напіврозкладу. На відміну від високої цитотоксичності вільного маутансиноїду, кон'югат антитіла має токсичність на кілька порядків величини нижчу щодо антиген-негативних клітин, у порівнянні з антигенпозитивними клітинами. Дисульфідний зв'язок має ту перевагу, що легко розщеплюється всередині клітин-мішеней внутрішньоклітинним глутатіоном, вивільнюючи високотоксичні вільні ліки. Цей підхід застосовується до антитіл проти пухлиноспецифічних антигенів, наприклад, кон'югат C242-DM1 (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623, 1996), та HuN901-DM1 (Chari et al., 2000). Проте, застосування цих кон'югатів обмежене через обмежену експресію відповідних антигенів-мішеней. Таким чином, ще існує потреба поліпшити цей підхід шляхом використання антитіл, націлених на більш високоекспресовані пухлиноспецифічні антигени, та, при потребі, антигени, високоекспресовані підчас проліферативної та метастатичної стадій злоякісної хвороби, передбачаючи у такий 7 спосіб природну концентрацію токсину у найбільш вірулентних клітинах. Анти-інтегрин моноклональні антитіла Численні факти свідчать, що прогресуючий ріст пухлин залежить від ангіогенезу, формування нових кров'яних судин, котрі забезпечують пухлини живильними речовинами та киснем, слугують для видалення відходів і діють як канали для метастазу пухлинних клітин у віддалені сайти (Gastl et al., Oncol. 54:177-184). Недавні дослідження визначили також роль інтегринів в ангіогенному процесі. Підчас ангіогенезу ряд інтегринів, що експресовані на поверхні активованих ендотеліальних клітин, регулює критичні адгезійні взаємодії з різновидом ЕСМ протеїнів, контролюючи різні біологічні події, такі як міграція клітин, проліферація та диференціація. Конкретно, у значній мірі споріднені, але відмінні інтегрини V3 та V5, як було показано, опосередковують незалежні шляхи в ангіогенному процесі. Антитіло, генероване проти V3, блокувало ангіогенез, індукований базовим фактором росту фібробластів (bFGF), тоді як антитіло, специфічне до V5, інгібувало ангіогенез, індукований ендотеліальним фактором росту судин (VEGF) (Eliceiri, et al., J. Clin. Invest. 103:12271230 (1999); Friedlander et al., Science 270:15001502 (1995)). Таким чином, інтегрини і особливо інтегрини, що містять альфа V субодиницю, є придатними терапевтичними мішенями для хвороб, що включають ангіогенез, такий як очна хвороба та неопластична хвороба, ремоделювання тканин, таке як рестеноз, і проліферацію клітин деяких типів, зокрема, епітеліальноклітинного та плоскоклітинного раку. Кон'югати антитіло-ліки Кон'югати агентів, що зв'язують клітини, з високоцитотоксичним маутансином описані (патенти США за номерами 5208020 та 5416064; R.V.J. Chari et al., 1992 Cancer Res. 52:127-131). Були розроблені деякі реагенти або реактиви, такі як Nгідроксисукцинімідилові ефіри (NHS), для реакції з білково-амінними групами для застосування у формуванні кон'югатів ліки-білок. Реагенти цього типу, загалом, описані Carlsson et al. (Biochem J. 173:723, 1978 та у патенті США за номером 4149003). Нітро-піридилові лінкерні реагенти для кон'югації маутансину з Mab та іншими білками розкриті у WO 2004/016801. У процесах, на які посилаються вище, агенти, що зв'язують клітини, модифіковані біфункціональним агентом, таким як N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо)пропіонат (SPDP), для введення активної дисульфідної складової. Реакція з цитотоксичними ліками, що містять тіол, запроваджує кон'югат, в якому агент, що зв'язує клітини, такий як моноклональне антитіло, та ліки зчіплюються через дисульфідні зв'язки. Було знайдено, що С-3 гідроксильне положення може бути модифікованим без втрати активності, фактично, деякі ефіри, як було знайдено, мають підсилену активність щодо знищення клітин (дивись огляд у роботі Cassady, et al. Chem Pharm Bull 52(1): 1-26, 2004). У патентах США за номерами 5208020 та 5416064 конкретно розглянуто застосування активованого маутансольного ефіру N-метил-N-(3 94388 8 метилдитіопрпаноїл)-L-аланіну. Маутансоїдна складова із цієї реакції, і котра виділяється при відновлювальному розщепленні дисульфідного 2' 2' зв'язку, була позначена як DM1 [N -деацетил-N (3-меркапто-1-оксопропіл)-маутансин, регістр, номер CAS 139504-50-0]. Таким чином, усі кон'югати, одержані з використанням метилдитіольованої форми DM1, утримують незаміщений метиленовий вуглець, сусідній з дисульфідним зв'язком на лікарському боці даного кон'югату (Фіг.1). Для in vivo підсилення стабільності цього дисульфідного зв'язку важливо запровадити стерично обмежені дисульфідні зв'язки, як зазначалось раніше (Thorpe, et al. Cancer Research 47:5924-31, 1987). Це може бути досягнуто шляхом використання зшивачів, що несуть один або два метилових замісники на вуглецевому атомі, сусідньому з дисульфідним зв'язком, або використання активованих ліків, що несуть принаймні один замісник на альфа-вуглецевому атомі, сусідньому із сульфгідрильним або дисульфідним замісником. Хоча проблеми цілеспрямованої доставки тепер, без сумніву, визнані, пошук придатної комбінації специфічності та спорідненості антитіла, кон'югаційної хімії та токсину непередбачуваний. Предметом даного винаходу є запровадження нових кон'югатів антитіло-маутансин, де дане антитіло спрямоване на клітинні поверхневі антигени, при їх достатній кількості для доставки руйнуючої клітини дози маутансиноїду, і де зазначений кон'югат має відповідну хімічну та біологічну стабільність для запровадження терапевтично ефективної швидкості виділення при призначенні суб'єкту. Стислий виклад винаходу Предметом даного винаходу є запровадження нових кон'югатів антитіло-маутансин, де дане, антитіло спрямоване на клітинні поверхневі антигени, при їх достатній кількості для доставки руйнуючої клітини дози маутансиноїду, і де, як відомо, зазначене антитіло інтерналізується даною клітиною після зв'язування антигену-мішені. У специфічному варіанті, дані кон'югати включають дисульфідний зв'язок, котрий був створений шляхом заміщення сусідніх метиленових вуглеців для запровадження терапевтично ефективної швидкості виділення при призначенні суб'єкту. У специфічному варіанті, даний винахід стосується кон'югату антитіло-ліки, що містить: антитіло, яке зв'язується з альфа V інтегриновою субодиницею людини, -9 кон'югованою з цитотоксичним агентом з ІС50 10 Μ або менше, де кон'югат антитіло-ліки викликає цитотоксичний або цитостатичний ефект щодо альфа V інтегрину, котрий експресує ракову клітинну лінію. У цьому варіанті антитіла даного винаходу є специфічними щодо принаймні однієї альфа V субодиниці гетеродимерного інтегринового рецептора, такого як альфаVбета1, альфаVбета3, альфаVбета5, альфаVбета6 або альфаVбета8 гетеродимерного інтегринового білка або його фрагмента. Кон'югати, яким віддається перевага, містять маутансиноїдні сполуки, зчеплені з антитілом через дисульфідний зв'язок, і дане антитіло здатне зв'язувати вітронектин та фіброген. 9 В одному аспекті кон'югати антитіла даного винаходу представлені Формулою [C-L]m-A, де А являє собою альфа V інтегринове субодиничне специфічне антитіло людини, де зазначене антитіло здатне інтерналізуватись клітиною, що експресує зазначену альфа V субодиницю; С яв-9 ляє собою цитотоксин з ІС50 10 Μ або менше; і L являє собою зчіпну групу, котра зв'язує дане антитіло та цитотоксин, і також містить зв'язок, здатний розщеплюватись компонентами внутрішньоклітинного середовища; і m репрезентує середню кількість цитотоксинових молекул, зчеплених з даним антитілом, і є цілим числом від 1 до 10, конкретно, 3-4. Даний цитотоксин може вибиратись із групи, яка складається із маутансиноїдів, калікеаміцинів, епотилонів, дискодермоліду, елеутробінів, доластатинів, криптофіцинів,камптотецинів, ризоксину (регістрац. номер CAS 90996546), або таксанових похідних і таких інших сполук, що виявляють половинне від максимального інгібування (ІС50 або -9 GI50) росту пухлинних клітин при 10 Μ або менше. В одному аспекті першого предмету даного винаходу кон'югат антитіло проти альфа V інтегрину-маутансиноїд містить будь-яку молекулу, що включає білок або пептид, що включає антитіло, яке конкурує за зв'язування з альфа-V субодиницею гетеродимерного людського інтегринового рецептора з моноклональним антитілом CNTO 95. В одному варіанті дане антитіло включає принаймні частину гіперваріабельної ділянки (CDR) важкого або легкого ланцюга, або її частину, що зв'язує ліганд, отриману із антитіла, позначеного як CNTO 95, у комбінації з варіабельною ділянкою важкого ланцюга або легкого ланцюга, константною ділянкою важкого ланцюга або легкого ланцюга, каркасну ділянку або будь-яку її частину, котра може бути введена у дане антитіло з CDR. Описане тут антитіло CNTO 95 являє собою людське антитіло до альфа-V, отримане шляхом імунізації генів від трансгенної миші, для експресії імуноглобуліну людини. Таким чином, в одному варіанті, даний винахід спрямований на антитіла, що містять принаймні одну CDR ділянку або варіабельну ділянку, одержану із антитіла CNTO 95. У варіанті, якому віддається перевага, дане антитіло є CNTO 95. В іншому аспекті даного винаходу кон'югат антитіло-маутансиноїд включає маутансинольний ефір, котрий виділяється при розщепленні зв'язку, що зчіплює цитотоксин, С, з лінкером, L, компонентами внутрішньоклітинного середовища. В одному варіанті маутансиноїд піддається етерифікації по С-3, С-14, С-15 або С-20 ацильованою амінокислотою, де ацильна група несе захищену сульфгідрильну групу, в якій вуглецевий атом даної ацильної групи, сусідній із захищеною сульфгідрильною групою, має одного або двох замісників, зазначені замісники являють собою СН3, С2Н5, лінійний алкіл або алкеніл, що має від 1 до 10 вуглецевих атомів, розгалужений або циклічний алкіл, або алкеніл, що має від 3 до 10 вугле 94388 10 цевих атомів, феніл, заміщений феніл, або гетероциклічний ароматичний, гетероциклоалкіл радикал, або Н; і де дана ацильна група має довжину лінійного ланцюга із принаймні двох вуглецевих атомів між карбонільною функціональною групою та атомом сірки. У варіанті, якому віддається перевага, етерифікований маутансинол вибирається 2' 2' із N -деацетил-N -(3-меркапто-1-оксопропіл)маутансину (DM1, номер регістрації CAS 1395042' 2' 50-0), N -деацетил-N -(4-меркапто-1-оксопентил)2'' 2'' маутансину (DM3), та N -деацетил-N -(4-метил-4меркапто-1-оксопентил)-маутансину (DM4). Другим предметом даного винаходу є запровадження сполук кон'югатів антитіло проти інтегрину-маутансиноїд, що корисні для лікування проліферативних хвороб людини, які спричинені аномальною проліферацією і характеризуються неоваскуляризацією. У варіанті, якому віддається особлива перевага, сполуки даного винаходу використовуються у способі лікування раку, включаючи рак молочної залози, ободової кишки, прямої кишки, легень, простати, нирок, печінки, підшлункової залози, стравоходу, шлунка, матки, яєчника, цервікальний або кісток. Сполуки даного винаходу можуть використовуватись окремо або у комбінації з іншими агентами для запобігання або терапії первинного раку, або запобігання чи терапії метастатичної хвороби. Інший спосіб другого предмета даного винаходу стосується комбінованого застосування сполук кон'югатів антитіло проти інтегрину-маутансиноїд з хіміотерапевтичними агентами у способах лікування раку. Кон'югати, яким віддається перевага, містять маутансиноїдні сполуки, з'єднані з антитілом через дисульфідний зв'язок, і хіміотерапевтичними агентами, яким віддається перевага, є доксорубіцин, таксан, камптотецин, подофілотоксин, нуклеозидний аналог, або піримідиновий аналог. У третьому предметі даного винаходу кон'югат антитіло-маутансиноїд одержується за способом, де дане антитіло реагує з біспецифічним лінкерним реагентом, таким як N-сукцинімідил-(2піридилтіо)алканоат, і потім реагує з попередньо активованим маутансиноїдом, в результаті чого відбувається дисульфідний обмін з утворенням загальмованого дисульфідного зв'язку між антитілом та маутансиноїдом. В іншому аспекті даного винаходу кон'югат антитіло-маутансиноїд одержується з використанням маутансинольного ефіру, де ацильна складова несе захищену сульфгідрильну групу. В одному варіанті маутансиноїд піддається етерифікації по С-3, С-14, С-15 або С-20 ацильованою амінокислотою, де ацильна група несе захищену сульфгідрильну групу, в якій вуглецевий атом даної ацильної групи, сусідній із захищеною сульфгідрильною групою, має одного або двох замісників, зазначені замісники вибираються із СН3, С2Н5, лінійного алкілу або алкенілу, що має від 1 до 10 вуглецевих атомів, розгалуженого або циклічного алкілу, або алкенілу, що має від 3 до 10 вуглецевих атомів, фенілу, заміщеного фенілу, гетероциклічної арильної складової, гетероциклоалкільної складової, або Н; і де дана ацильна група має довжину лінійного ланцюга із принаймні двох вуглецевих атомів 11 між карбонільною функціональною групою та атомом сірки. У варіанті, якому віддається перевага, маутансиноїд являє собою 3-маутансинольний ефір, і зазначена ацильована амінокислотна група несе 0, 1 або 2 метильні групи на вуглецевому атомі, сусідньому із захищеним сульфгідрилом. У варіанті, якому віддається перевага, етерифікова2' 2' ний маутансинол вибирається із N -деацетил-N (3-меркапто-1-оксопропіл)-маутансину (DM1, но2' мер регістрації CAS 139504-50-0), N -деацетил2' N -(4-меркапто-1-оксопентил)-маутансину (DM3), 2'' 2'' та N -деацетил-N -(4-метил-4-меркапто-1оксопентил)-маутансину (DM4). В іншому аспекті даного винаходу кон'югат антитіло проти альфа V інтегрину-маутансиноїд одержується у значній мірі в одну стадію шляхом реакції реакційного ефіру, що несе маутансиноїд, з антитілом проти інтегрину, що попередньо хімічно не активувався. Реакційний ефір маутансиноїду може являти собою N-сукцинімідиловий, Nсульфосукцинімідиловий, N-фталімідиловий, Nсульфофталімідиловий, 2-нітрофенільний, 4нітрофенільний, 2,4-динітрофенільний, 3сульфоніл-4-нітрофенільний або 3-карбокси-4нітрофенільний ефір. Стислий опис фігур Фігура 1 зображує хімічну структуру тіольованих маутансинових амідів з групами, яким віддається перевага; зазначені DM1, DM3 та DM4. Фігура 2 зображує хімічні структури та їх хімічні акроніми біфункціональних лінкерних реагентів даного винаходу, яким віддається перевага. Фігура 3 являє собою схему, що зображує синтетичний метод одержання кон'югатів антитіломаутансиноїд даного винаходу. Фігура 4 являє собою графік зміни у часі об'єму пухлини меланоми людини у "голих" мишей та ефект застосування CNTO 95. Мишей піддавали 6 інокуляції підшкірно клітинами A375.S2 (3x10 ), і за три дні розпочали дозування CNTO 95 або контрольними засобами. Мишей лікували CNTO 95 або наповнювачем три рази на тиждень при дозі 10 мг/кг інтраперитонеально. Кожна точка являє собою середній об'єм пухлини із 10 тварин з пухлиною (±SEM). CNTO 95, що застосовувалось три рази на тиждень, суттєво інгібувало ріст пухлин у порівнянні з контрольними тваринами на 26 добу (Р=0,0005). Фігура 5 являє собою графік зміни у часі об'єму пухлини меланоми людини у "голих" щурів та ефект застосування CNTO 95. Щурів піддавали 6 інокуляції підшкірно клітинами A375.S2 (3x10 ), і за три дні розпочали дозування CNTO 95 або контрольними засобами. Щурів лікували CNTO 95 або наповнювачем один раз на тиждень при дозі 10 мг/кг внутрішньовенно. Кожна точка являє собою середній об'єм пухлини із 9 тварин з пухлиною (±SEM). Фігура 6 являє собою графік, що зображує ріст клітин меланоми людини A375.S2 у часі у "голих" мишей. Об'єми пухлин виражали як середнє ±SEM (n=9 або 10). Стрілками позначені внутрішньовенні ін'єкції ліків. Зірочка вказує на те, що одна тварина, котра не реагувала на лікування, була умертв 94388 12 лена, оскільки об'єм пухлини у неї складав більше 3 1500 мм . Фігура 7 являє собою графік, що зображує ріст клітин меланоми людини A375.S2 у атомічних "голих" мишей. На 14 добу, коли середній об'єм пух3 лин сягав 250 мм , тварин згрупували у довільний спосіб та застосували першу дозу. Усіх тварин умертвили на 35 добу. Об'єми пухлин виражали як середнє ±SEM (n=9 або 10). Стрілками позначені внутрішньовенні ін'єкції ліків. Фігура 8 являє собою графік, що зображує зміну загальної ваги у часі мишей з пухлинами, яким робились ін'єкції на 7 добу після імплантації пухлини і знову кожні 7 діб х5 3, 6 або 10 мг/кг CNTO 364; на 7 та 14 добу 25 мг/кг CNTO 364 або F105DM1, і на 7, 14 та 35 добу 15 мг/кг CNTO 364. Фігура 9 являє собою графік зміни у часі об'єму пухлин для тих самих тварин, що й на Фіг.8. Фігура 10 являє собою графік, що зображує об'єми окремих пухлин для всіх тварин у групах як описано на Фіг.8. Фігура 11 являє собою графік середньої ваги тіла ±SEM (n=6) у часі для "голих" щурів, що мали підшкірні пухлини легеневої карциноми людини А549 і лікувались CNTO 364 при 15 мг/кг або контрольними засобами. Стрілками позначений час внутрішньовенних ін'єкцій. Фігура 12 являє собою графік, що зображує ріст пухлин легеневої карциноми людини А549 у самиць атимічних щурів. Лікування CNTO 364 (15 мг/кг) дало зворотній хід встановленим пухлинамлегеневої карциноми людини А549 у самиць атимічних щурів. Фігура 13 являє собою графік розсіяння, що зображує вагу окремих пухлин по завершенню дослідження росту пухлин легеневої карциноми людини А549 у самиць атимічних щурів, котрі піддавались лікуванню 15 мг/кг CNTO 364 або контрольними речовинами. Горизонтальними лініями позначені медіани для кожної досліджуваної групи. Фігури 14А та В являють собою графіки, що зображують зміну середнього об'єму пухлини у часі у щурів з клітинами пухлини ободової кишки людини НТ29, котрі піддавались лікуванню CNTO 364 (CNTO 95-SPP-DM1), CNTO 365 (CNTO 95SSNPB-DM4) та CNTO 366 (CNTO 95-SSNPPDM4). А. Фізіологічний розчин із фосфатним буфером (PBS) як контрольний розчин та невідповідне антитіло, F105, піддавались кон'югації з тіольованими маутансинами з використанням того самого процесу та реагентів і вводились як ін'єкція на 7 та 21 добу 10 мг/кг. В. Фізіологічний розчин із фосфатним буфером (PBS) як контрольний розчин та кон'юговані антитіла, як описано, вводились як ін'єкція при 20 мг/кг на 7 та 21 добу, за виключенням групи CNTO 365, котра отримала єдину ін'єкцію на 7 добу. Фігури 15А та В являють собою графіки, що зображують середню зміну ваги тіла у щурів з пухлинами НТ29 як описано на Фіг.14. Детальний опис винаходу 1. Визначення Для більш легкого розуміння даного винаходу спочатку визначаються деякі терміни. Додаткові 13 визначення подаються по тексту детального опису. Терміни "альфа V інтегрин", "альфа V субодиничний інтегрин" та "інтегрин, що містить альфа V субодиницю", застосовуються в даному тексті у взаємозамінний спосіб і відповідають альфа V трансмембранним глікопротеїновим субодиницям функціонального інтегринового гетеродимеру, і включають усі варіанти, ізоформи та видові гомологи альфа V. Відповідно, антитіла даного винаходу можуть, у деяких випадках, реагувати у перехресний спосіб з альфа V від видів, відмінних від людини, або іншими протеїнами, котрі структурно споріднені з альфа V людини (наприклад, людські альфа V гомологи). В інших випадках дані антитіла можуть бути цілком специфічними до людського альфа V і не виявляють видової або інших типів перехресної реактивності. Як застосовується у даному тексті, "антитіло" включає повні антитіла та будь-який фрагмент, що зв'язує антиген, або його окремий ланцюг. Так, антитіло містить будь-яку молекулу, котра включає протеїн або пептид, що включає принаймні частину молекули імуноглобуліну, таку як, проте не обмежуючись цим, принаймні одну гіперваріабельну ділянку (CDR) важкого або легкого ланцюга, або його частину, що зв'язує ліганд, варіабельну ділянку важкого ланцюга або легкого ланцюга, константну ділянку важкого ланцюга або легкого ланцюга, каркасну (FR) ділянку, або будь-яку її частину, або принаймні одну частину зв'язувального протеїну, що може бути уведена в антитіло даного винаходу. Антитіло може бути мишачим, людським, гуманізованим або химерним. "Фрагмент, що зв'язує антиген", або його частина включає антитіла з одиничним ланцюгом або їх фрагменти. Функціональні фрагменти включають фрагменти, котрі зв'язують антиген, що зв'язуються з альфа-V субодиницею ссавця. Приклади зв'язувальних фрагментів, що охоплюються терміном "частина, що зв'язує антиген", антитіла включають (і) Fab фрагмент, моновалентний фрагмент, що складається із VL, VH, CL та СН доменів; (іі) F(ab')2 фрагмент, бівалентний фрагмент, що включає два Fab фрагменти, з'єднані дисульфідним містком у шарнірній області; (iiі) Fd фрагмент, що складається із VH та СН доменів; (iv) Fv фрагмент, що складається із VL та VH доменів одного плеча антитіла; (v) dAb фрагмент, в якому VH та VL домени експресовані на окремому поліпептидному ланцюгу, але який використовує лінкер, занадто короткий для реалізації спарювання зазначених двох доменів на тому самому ланцюгу, чим спонукає дані домени до спарювання з комплементарними доменами іншого ланцюга і утворює два сайти, що зв'язують антиген; та (vi) ізольовану гіперваріабельну ділянку (CDR). Крім того, хоча зазначені два домени Fv фрагмента, VL та VH, кодуються окремими генами, вони можуть бути з'єднані з використанням рекомбінантних методів за допомогою синтетичного лінкера, що дозволяє їм бути зробленими у вигляді окремого протеїнового ланцюга, в якому VL та VH ділянки спарюються з утворенням моновалентних молекул (що відомий як окремий ланцюг Fv (sc Fv). Такі антиті 94388 14 ла з одиничним ланцюгом, як мається на думці, також охоплюються терміном "частина, що зв'язує антиген" антитіла. Ці фрагменти антитіл одержуються з використанням звичайних методів, відомих фахівцям у даній галузі, і дані фрагменти піддаються скринінгу на придатність у той самий спосіб, що й інтактні антитіла. Такі фрагменти можуть продукуватись шляхом ферментативного розщеплення, синтетичними або рекомбінантними способами, як відомо у цій галузі та/або як описано у даному тексті. Термін "епітоп" означає протеїнову детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з антитілом. Епітопи звичайно складаються із хімічно активних поверхневих угрупувань молекул, таких як амінокислоти або бічні цукрові ланцюги, і звичайно мають специфічні тривимірні структурні характеристики, так само як і специфічні зарядові характеристики. Конформаційні та нонконформаційні епітопи відрізняються тим, що зв'язок з першим, але не з другим втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Термін "природний конформаційний епітоп" або "природний протеїновий епітоп" застосовуються тут у взаємозамінний спосіб і включають протеїнові епітопи, що утворюються в результаті конформаційного складання інтегринової молекули, що відбувається, коли амінокислоти із різних частин лінійної послідовності інтегринової молекули близько підходять одна до одної у 3вимірному просторі. Такі конформаційні епітопи розподілені на екстрацелюлярному боці плазмової мембрани. Термін "людське антитіло", як застосовується у даному винаході, як мається на думці, включає антитіла, що мають варіабельні та константні ділянки, одержані із людських зародково-лінійних імуноглобулінових послідовностей або що добре їм відповідають. Людські антитіла даного винаходу можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються людськими зародково-лінійними імуноглобуліновими послідовностями (наприклад, мутації, що введені шляхом неспецифічного або сайтспецифічного мутагенезу in vitro або соматичної мутації in vivo). Таким чином, як застосовується у даному тексті, термін "людське антитіло" стосується антитіла, в якому у значній мірі кожна частина протеїну (наприклад, CDR, каркас, CL, CH домени (наприклад, СН1, СН2, СH3), шарнір, (VL, VH) у значній мірі подібна до людського зародково-лінійного антитіла. Людські антитіла класифікують на групи, основані на їх подібностях амінокислотних послідовностей, дивись, наприклад, http://people.crvsl.bbk.ac. uk/~ubcg07s/. Таким чином, використовуючи пошук подібності послідовностей, можна вибрати антитіло з подібною лінійною послідовністю як шаблон для створення "гуманізованих антитіл". "Гуманізація" (що також називається решейпінгом або CDR-щепленням) тепер є загальновизнаним методом для зниження імуногенності моноклональних антитіл (mАb) від ксеногенних джерел (звичайно, гризунів) та для поліпшення ефекторних функцій (ADCC, активації комплементу, Clq зв'язування). Розроблене mAb продукується з використанням методів молекулярної біології, 15 проте, просте CDR-щеплення гіперваріабельних ділянок гризунів (CDR) до людських каркасів часто призводить до втрати зв'язувальної спорідненості та/або специфічності оригінального mAb. Для гуманізації антитіла конструювання гуманізованого антитіла включає варіації, такі як заміни консервативних амінокислот у залишках CDR, та зворотну заміну залишків від mAb гризунів у ділянках людського каркасу (зворотні мутації). Ці позиції можуть розрізнятись або ідентифікуватись шляхом порівняння послідовностей для структурного аналізу або аналізу гомологічної моделі 3D структури варіабельних ділянок. Процес афінного визрівання застосовує у самий останній час банки фатів для варіювання амінокислот у вибраних позиціях. Подібно до цього, багато підходів застосовуються для вибору найбільш придатних людських каркасів, до яких прищеплюються CDR гризунів. Оскільки набір даних по відомим параметрам для структур антитіл зростає, то відповідно зростає й вишуканість та удосконалення цих методів. Може бути використаний консенсус або зародковолінійні послідовності від окремого антитіла або фрагментів каркасних послідовностей всередині кожної варіабельної ділянки легкого або важкого ланцюга від кількох різних людських mAb. Інший підхід до гуманізації полягає у модифікації лише поверхневих залишків послідовності гризунів найбільш загальними залишками, що знайдені у людських mAb, і він отримав назву "повторне покриття" або "облицювання". Відомі людські Ig послідовності розкриті, наприклад, у www.ncbi.nim.nih.gov/entrez/query.fcgі; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phaae/hdb.html: www.kabatdatabase.com/top.html; www.antibodvrcsource.com/onlinecomip.html; www.appliedbiosystems.com; www.biodesign.com; antibody.bath.ac.uk; http//www.unih.ch/~antibody/; www.cryst.bbk.ac.uk/~-ubcg07s; Kabal et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), на які у даному тексті зроблено повне посилання. "Химерні антитіла" є такими антитілами, що зберігають окремі домени, звичайно, варіабельний домен, від одного виду і залишок від іншого виду; наприклад, химери миша-людина. Термін "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального тіла", як застосовується у даному тексті, стосується одержання молекул антитіла окремої молекулярної композиції. В одному варіанті моноклональні антитіла людини продукуються гібридомою, що включає В клітину, одержану від трансгенної нелюдської тварини, наприклад, трансгенної миші, що має геном, який містить людський трансген важкого ланцюга та трансген легкого ланцюга, злитий з імморталізованою клітиною. Проте, загалом, послідовності, що кодують антитіло, клонуються та вводяться у клітинухазяїна або продуктивну клітинну лінію. Вираз "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн"), як застосовується у даному тексті, як мається на думці, стосується клітини, в яку був уведений рекомбінантний вектор екс 94388 16 пресії. Слід розуміти, що такі терміни, як мається на думці, стосуються не лише конкретної суб'єктної клітини, але й нащадка такої клітини. У зв'язку з деякими модифікаціями, що можуть мати місце у наступних генераціях через мутації або вплив навколишньою середовища, такий нащадок може не бути, фактично, ідентичним до материнської клітини, але все ж включений в обсяг терміну "клітинахазяїн", як тут застосовується. Рекомбінантні клітини-хазяї включають, наприклад, СНО лінії або клітинну лінію, отриману із мишачої мієломи SP/0. Термін "рекомбінантне людське антитіло", як застосовується у даному тексті, включає всі людські або гуманізовані антитіла, котрі одержані, експресовані, створені або виділені за допомогою рекомбінантних засобів, такі як (а) антитіла, виділені із тварини (наприклад, миші), що є трансгенною або трансхромосомною щодо імуноглобулінових генів людини або одержаної із них гібридоми, (b) антитіла, виділені із клітини-хазяїна, трансформованої для експресії даного антитіла, наприклад, із трансфектоми, (с) антитіла, виділені із бібліотеки рекомбінантних, комбінаторних людських антитіл, і (d) антитіла, одержані, експресовані, створені або виділені за допомогою будь-яких інших засобів, що включають сплайсінг людських імуноглобулінових генних послідовностей з іншими ДНК послідовностями. "Виділене антитіло", як застосовується у даному тексті, як мається на думці, стосується антитіла, котре у значній мірі вільне від інших антитіл, що мають різні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, що у специфічний спосіб зв'язується з альфа V, у значній мірі вільне від антитіл, що специфічним чином зв'язують антигени, інші, ніж альфа V). Проте, виділене антитіло, що у специфічний спосіб зв'язується з епітопом, ізоформою або варіантом людського альфа V, може мати перехресну реактивність щодо інших споріднених антигенів, наприклад, від інших видів (наприклад, видові гомологи альфа V). Крім того, виділене антитіло може бути у значній мірі вільним від іншого клітинного матеріалу та/або хімічних речовин. Як застосовується у даному тексті, "специфічне зв'язування" стосується антитіла, що зв'язується з предетермінованим антигеном. Типово, дане антитіло зв'язується з константою дисоціації (KD) -7 10 Μ або менше, і зв'язується з предетермінованим антигеном з KD, що принаймні у два рази менша, ніж його KD для зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, BSA, казеїн), іншим, ніж предетермінований антиген або у значній мірі споріднений антиген. Як застосовується у даному тексті, "ізотип" стосується класу антитіла (наприклад, IgM або lgG1), що кодується генами константної ділянки важкого ланцюга. Скорочення Abs антитіла, поліклональні або моноклональні aV інтеїринова субодиниця альфа V b3 інтегринова субодиниця бета 3 bFGF базовий фактор росту фібробластів HUVEC ендотелій пупкової вени людини 17 IFN інтерферон Ig імуноглобулін IgG імуноглобулін G Mab моноклональне антитіло NPB = N-сукцинімідил-5-нітро-(2піридилдитіо)бутират SMCC = сукцинімідил 4-(Nмалеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат SMNP = N-сукцинімідил 4-метил-4-(5-нітро-2піридилдитіо)пентаноат SMPT = 4-сукцинімідилоксикарбоніл-(2піридилдитіо)толуол SPDB = N-сукцинімідил-4-(2піридилдитіо)бутират SPDP = N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо)пропіонат SPP = N-сукцинімідил-4-(2піридилтіо)пентаноат SP = N-сукцинімідил 4-(2-піридил) SS = сульфосукцинімідил SSNPP = сульфосукцинімідил-N-сукцинімідил4-(5-нітро-2-піридилдитіо)пентаноат VEGF ендотеліальний фактор росту судин 2. Композиції А. Кон'югати антитіл даного винаходу Кон'югати антитіла даного винаходу представлені Формулою [C-L]m-A, де А являє собою альфа V інтегринове субодиничне специфічне антитіло людини, де зазначене антитіло здатне інтерналізуватись клітиною, що експресує зазначену альфа V субодиницю; С яв-9 ляє собою цитотоксин з ІС50 10 Μ або менше; і L являє собою зв'язувальну групу, котра зв'язує дане антитіло та цитотоксин, і також містить зв'язок, здатний розщеплюватись компонентами внутрішньоклітинного середовища; і m репрезентує середню кількість цитотоксинових молекул, зв'язаних з даним антитілом, і є цілим числом від 1 до 5, краще, 3-4. Даний цитотоксин може вибиратись із групи, яка складається із маутансиноїдів, калікеаміцинів, епотилонів, дискодермоліду, елеутробінів, доластатинів, криптофіцинів, камптотецинів, ризоксину (регістрац. номер CAS 90996546), або таксанових похідних і таких інших сполук, що виявляють половинне від максимального інгібування -9 (ІС50 або GI50) росту пухлинних клітин при 10 Μ або менше. Лінкери, що містять здатні до внутрішньоклітинного розщеплення зв'язки, включають кислотно-лабільні зв'язки, такі як цис-аконітилові зв'язки, ефіри, кислотно-чутливі гідразонові зв'язки, здатні до лізосомної деградації пептидні зв'язки, лінкери, що здатні до розщеплення гідролазою, специфічні до пептидази або протеази лінкери, та дисульфідні (сульфгідрильні) лінкери (дивись огляд у роботі Dyba, Μ., et al. 2004 Curr Pharm Design 10:23112334). Завдяки здатності до більш швидкого або селективного розщеплення за внутрішньоклітинних умов, у порівнянні з умовами, що переважають у, наприклад, кровотоці, лінкер надає додаткової специфічності та безпеки повній фармакодинаміці даного кон'югату. Особлива перевага віддається 94388 18 дисульфідним зв'язкам через сприятливий відновлювальний потенціал усередині клітинних комірок, так само як і індуковану редокс ензимну активацію (Satio, G.et al. Adv. Drug Delivery Rev 2003 55:199215). В одному варіанті даного винаходу зв'язок виникає між атомом сірки, присутнім в молекулі антитіла, наприклад, у бічному ланцюгу цистеїнового залишку, та іншим атомом сірки, присутнім у токсичній сполуці. В іншому варіанті зв'язувальна складова складається із одного або кількох атомів, або хімічних груп. Інше основне міркування щодо хімічного зв'язування біологічної молекули, такої як рекомбінантний протеїн, з хімічною сполукою полягає у тому, що хімія дериватизації може, і у більшості випадків дасть, новий молекулярний об'єкт, котрий може мати невідомі до цього біологічні властивості. Таким чином, слід розуміти, що продукти фізіологічного розщеплення мають замислюватись у такий спосіб, щоб дати бажані біологічно активні похідні. Маутансиноїди даного винаходу, включаючи DM1, DM3, DM4 та інші, як показано та описано на Фіг.1, зберігають біологічну активність. Кон'югати антитіло проти альфа V інтегринумаутансиноїд даного винаходу одержуються шляхом хімічного зв'язування антитіла проти альфа V інтегрину з маутансиноїдною молекулою без значного зниження біологічної активності даного антитіла та запровадження маутансиноїду, котрий при виділенні за певних фізіологічних умов зберігає свій цитотоксичний потенціал. Прикладами придатних маутансиноїдів є ефіри маутансинолу та маутансинольних аналогів, включаючи, проте не обмежуючись цим, такі, що мають модифіковане ароматичне кільце і такі, що мають модифікації по С-19, С-20 або С-14, або С-15, або С-4,5 деокси. Перевага віддається маутансинольним С-3 ефірам. Маутансиноїди, яким віддається особлива перевага, являють собою похідні N-метил2' аланінових ефірів маутансинолу (N -деацетилмаутансин). Кон'югати, яким віддається особлива перевага, містять дисульфідний зв'язок, котрий при розщепленні шляхом відновлення виділяє відповідний маутансиноїд, що несе вільний тіол. Маутансиноїди, що містять тіол, яким віддається 2' 2' перевага, показані на Фіг.1: N -деацетил-N -(3меркапто-1-оксопропіл)-маутансин (DM1, регістр, 2' 2' номер CAS 139504-50-0), N -деацетил-N -(42' меркапто-1-оксопентил)-маутансин (DM3) та N 2' деацетил-N -(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)маутансин (DM4). Кон'югати молекул антитіла даного винаходу та токсичної сполуки можуть бути утворені з використанням будь-яких методів, відомих тепер або розроблених пізніше. Наприклад, цитотоксична сполука може бути модифікована з утворенням вільної аміногрупи і потім зчеплена з молекулою антитіла через кислотно-лабільний лінкер або фотолабільний лінкер. Дана токсична сполука може бути конденсована з пептидом і потім зчеплена з молекулою антитіла з утворенням пептидазалабільного лінкера. Токсична сполука може бути оброблена з одержанням первинної гідроксильної групи, котра може бути сукцинильована та зчеплена з молекулою антитіла, утворюючи кон'югат, що 19 94388 може бути розщеплений внутрішньоклітинними естеразами з вивільненням вільних ліків. Для утворення дисульфідного зв'язку між антитілом А та цитотоксином С, краще, коли дану токсичну сполуку обробляють для утворення вільної або захищеної тіолової групи, і потім одну або багато токсичних сполук, що містять дисульфід або тіол, зчіплюють у ковалентний спосіб з молекулою антитіла через дисульфідний зв'язок(ки). Немає потреби у тому, щоб дисульфідний зв'язок формувався безпосередньо вільним тіолом антитіла, він може утворюватись шляхом дериватизації будь-якої реактивної групи всередині антитіла з уведенням сайту для дисульфідного обміну, наприклад, шляхом сполучення біфункціонального лінкера з вільними аміногрупами у даному антитілі. Наприклад, молекули антитіла можуть бути модифіковані структуруючими реагентами, такими як N-сукцинімідил 3-(2-піридилдитіо)пропіонат 20 (SPDP), 4-сукцинімідил-оксикарбоніл-а-метил а-(2піридилдитіо)-толуол (SMPT), N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо-бутират (SDPB), N-сукцинімідил-4-(2піридилдитіо)пентаноат (SPP), N-сукцинімідил-5(2-піридилдитіо)пентаноат, 2-імінотіолан (IT) або ацетилсукциновий ангідрид, з використанням відомих методів. Кон'югати даного винаходу антитіло проти альфа V інтегрину-цитотоксин представлені формулою II, де маутансинол підданий етерифікації по С-3, і дане антитіло є антитілом проти альфа V інтегринової субодиниці; R1, R2, Χ1 та Х2 являють собою, незалежно, Н, Me, С2Н5, лінійний алкіл або алкеніл, що має від 1 до 10 вуглецевих атомів, розгалужений або циклічний алкіл або алкеніл, що має від 3 до 10 вуглецевих атомів, феніл, заміщений феніл або гетероциклічну арильну складову, або гетероциклоалкільну складову; n дорівнює 1-5; p дорівнює 1-5; і m дорівнює 1-10. 1 - маутансинольний ефір, 2 - антитіло У варіанті, якому віддається перевага, лінкерна складова являє собою 4-тіопентаноат, одержаний із SPP, або 4-тіопентаноат. Молекула антитіла, що містить вільну або захищену тіолову групу, отримана у такий спосіб, потім піддається реакції з токсичною сполукою, що містить дисульфід або тіол, з одержанням кон'югатів. Дані кон'югати можуть піддаватись очищенню методами високоефективної рідинної хроматографії або гельфільтрації. В. Антитіла проти альфа V субодиниці даного винаходу Окрім зв'язування альфа V, антитіла людини або фрагменти, що зв'язують антигени, або їх частини, як ті, що описані вище, можуть вибиратись для збереження інших функціональних властивостей антитіл даного винаходу, таких як: 1) зв'язування з живими клітинами, що експресують альфа V людини; 2) запобігання зв'язуванню живих клітин з матричними протеїнами; -8 3) зв'язування з альфа V людини з KD 10 Μ -9 -10 або менше (наприклад, 10 Μ або 10 Μ або менше); 4) виявлення незалежного від кальцію зв'язування з альфа V; 5) зв'язування з унікальним епітопом на альфа V або тим, що належить унікальній комплементаційній групі антитіл, що зв'язуються з альфа V; 6) інгібування ангіогенезу in vitro або in vivo; або 7) зниження маси пухлини або запобігання росту пухлини in vivo. В іншому аспекті даного винаходу структурні особливості антитіл людини проти альфа V даного винаходу, CNTO 95, використовуються для створення структурно споріднених людських антитіл проти альфа V, що зберігають принаймні одну функціональну властивість антитіл даного винаходу, таку як зв'язування з альфа V. Більш конкретно, одна або кілька CDR ділянок CNTO 95 може бути скомбінована у рекомбінантний спосіб з відомими людськими каркасними областями та CDR з утворенням додаткових, рекомбінантносконструйованих людських антитіл проти альфа V даного винаходу. У варіанті, якому віддається перевага, антитіло для використання в описаних тут кон'югатах антитіл проти альфа V являє собою антитіло лю 21 дини проти альфа V, одержане від імунізації генів трансгенної миші для експресії імуноглобулінів людини. Одержання такого антитіла детально описано у РСТ публікації за номером WO 02/12501 та у публікації США за номером 2003/040044, на які у даному тексті зроблено посилання. Дане антитіло включає будь-яку молекулу, що містить протеїн або пептид, котра включає принаймні частину гіперваріабельної ділянки (CDR) важкого або легкого ланцюга, або її частину, що зв'язує ліганд, одержану із антитіла, позначеного як "CNTO 95" (дивись РСТ публікацію за номером WOI 02/12501 та публікацію США за номером 2003/040044), у комбінації з варіабельною ділянкою важкого ланцюга або легкого ланцюга, константною ділянкою важкого ланцюга або легкого ланцюга, каркасною ділянкою, або будь-якою її частиною, що може бути уведена в антитіло. Краще, коли CDR 1, 2 та/або 3 описаних вище отриманих методами інженерії антитіл включають визначену амінокислотну послідовність(ті) як такі у цілком людського Mab, позначеного як CNTO 95, Gen0101, CNTO 95, С371А, генерованого шляхом імунізації трансгенної миші як розкрито у даному тексті. Проте, звичайному фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що можливе деяке відхилення від точних CDR послідовностей CNTO 95, хоча й при збереженні здатності даного антитіла ефективно зв'язувати альфа V (наприклад, консервативні заміщення). В особливому варіанті дане антитіло або фрагмент, що зв'язує антиген, можуть мати ділянку, котра зв'язує антиген, яка включає принаймні частину принаймні одного важкого ланцюга CDR (тобто CDR1, CDR2 та/або CDR3), що має амінокислотну послідовність відповідної CDR 1, 2 та/або 3 (наприклад, SEQ ID NOS: 1, 2 та/або 3). В іншому особливому варіанті дане антитіло або частина, що зв'язує антиген, або варіант можуть мати ділянку, котра зв'язує антиген, яка включає принаймні частину принаймні одного легкого ланцюга CDR(тобто CDR1, CDR2 та/або CDR3), що має амінокислотну послідовність відповідної CDR 1, 2 та/або 3 (наприклад, SEQ ID NOS: 4, 5 та/або 6) легкого ланцюга CNTO 95. У варіанті, якому віддається перевага, три важколанцюгових CDR та три легколанцюгових CDR даного антитіла або фрагмента, що зв'язує антиген, мають амінокислотну послідовність відповідної CDR mAb CNTO 95. Відповідно, в іншому варіанті створене антитіло може складатись із однієї або кількох CDR, котрі, наприклад, на 90%, 95%, 98% або 99,5% ідентичні до однієї або кількох CDR CNTO 95. Антитіла проти альфа V субодиниці даного винаходу можуть включати, проте не обмежуючись цим, принаймні одну частину, послідовність або комбінацію, що вибирається із від 5 до всіх суміжних амінокислот принаймні однієї із SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6. Антитіло проти альфа V субодиниці може також включати, при потребі, поліпептид із принаймні однієї із 70-100% суміжних амінокислот принаймні однієї із SEQ ID NOS: 7, 8. Наприклад, амінокислотна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга може бути порівняна з послідовністю SEQ ID NO: 8, або амінокислотна послідовність CDR3 94388 22 важкого ланцюга може порівнюватись з SEQ ID NO: 7. Як тут розкрито та заявлено, послідовності, викладені у SEQ ID NOS 1-8, включають "модифікації консервативних послідовностей", тобто модифікації амінокислотних послідовностей, котрі суттєво не впливають або змінюють зв'язувальні характеристики антитіла, кодованого нуклеотидною послідовністю або що містить дану амінокислотну послідовність. Такі модифікації консервативних послідовностей включають амінокислотні заміщення, приєднання та делеції. Модифікації можуть бути внесені у SEQ ID NOS: 1-8 або до нуклеїнових кислот, що кодують їх, за допомогою стандартних методів, відомих у даній галузі, таких як сайт-специфічний мутагенез та PCRопосередкований мутагенез. Заміщення консервативних амінокислот включають такі, в яких амінокислотний залишок замінюється амінокислотним залишком, що має схожий бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, що мають схожі бічні ланцюги, визначені у даній галузі. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Так, передбачуваний несуттєвий амінокислотний залишок в людському антитілі проти альфа V заміщується, краще, іншим амінокислотним залишком із того самого сімейства бічних ланцюгів. Принаймні одне антитіло даного винаходу зв'язує принаймні один визначений епітоп, специфічний до принаймні одного альфа V субодиничного протеїну, субодиниці, фрагмента, частини або будь-якої їх комбінації. Зазначений принаймні один епітоп може включати принаймні одну ділянку, що зв'язує антитіло, яке містить принаймні одну частину зазначеного протеїну, де даний епітоп, краще, складається із принаймні однієї екстрацелюлярної, розчинної, гідрофільної, зовнішньої або цитоплазмової частини зазначеного протеїну. Зазначений принаймні один визначений епітоп може включати будь-яку комбінацію принаймні однієї амінокислотної послідовності принаймні 1-3 амінокислот до всієї визначеної частини суміжних амінокислот SEQ ID NO: 9. Як зазначалось попередньо, даний винахід також стосується антитіл, фрагментів, що зв'язують антиген, імуноглобуцінових ланцюгів та CDR, які включають амінокислоти у послідовності, котра є у значній мірі такою самою як описана тут амінокислотна послідовність. Краще, коли антитіла або фрагменти, що зв'язують антиген, та антитіла, що містять такі ланцюги або CDR, можуть зв'язувати альфа-V субодиницю людини з високою спорідненістю (наприклад, KD менше або дорівнює прибли 23 -9 зно 10 М). Амінокислотні послідовності, котрі є у значній мірі такими самими як описані у даному тексті, включають послідовності, що містять заміщення консервативних амінокислот, так само як і амінокислотні делеції та/або інсерції. Амінокислоти в антитілі проти альфа-V субодиниці даного винаходу, котрі є важливими для функціонування, можуть бути ідентифіковані з використанням методів, відомих у даній галузі, таких як сайт-специфічний мутагенез або аланінскануючий мутагенез (наприклад, Ausubel, вище, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells. Science 244:1081-1085 (1989)). Остання процедура вводить одиничні аланінові мутації у кожний залишок у даній молекулі. Результуючі молекули мутанта потім випробують на біологічну активність, таку як, проте не обмежуючись цим, нейтралізуючу активність принаймні до однієї альфа-V субодиниці. Сайти, які є критичними щодо зв'язування антитіла, можуть також ідентифікуватись шляхом структурного аналізу, такого як кристалізація, ЯМР або фотоафінне мічення (Smith, et al., J. Моl. Biol. 224:899-904 (1992) та de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)). 3. Способи одержання кон'югатів Вихідна сполука, маутансинол, як застосовується у виробництві сполук DM1, DM3 та DM4 і споріднених активованих маутансиноїдів (Фіг.1) згідно з даним винаходом, може бути одержана із маутансинового природного С-3 ефіру, виділеного із природних джерел (Kupchan et al., J. Amer. Chem. Soc. 97, 5294 (1975)) шляхом відновлювального розщеплення. Для цієї стадії особливо корисним є реагент літійтриметоксиалюміній гідрид у тетрагідрофурані при -40°С. Інші природні маутансиноїдні ефіри можуть також бути з вигодою одержані шляхом культивування мікроорганізмів, котрі належать до роду Nocardia (U.S. Pat. No. 4151042) або видів Actinosynnema, що були використані для одержання маутансинолу, маутанасину або С-3 маутансинольних ефірів, таких як маутансинол пропіонат, у культуральній рідині та екстрагування сполук із культуральної рідини для додаткового очищення. Існує множина зв'язувальних груп, відомих у даній галузі, для приготування антитіломаутансиноїдних кон'югатів, включаючи, наприклад, дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислотні лабільні групи, фотолабільні групи, пептидазалабільні пептидні лінкери або ефіри, котрі можуть бути кислотно-лабільними або розщеплюватись естеразою. Як зазначається у патенті США за номером 5208020, етерифікація маутансинолу або аналогу карбоновими кислотами, що містять метилдитіогрупу або іншу захищену тіогрупу, включаючи, наприклад, N-метил-N-[3-(метилдитіо)-1-оксопропіл]L-аланін, дає відповідні маутансиноїди, що містять дисульфід. У випадку, коли утворюються два діастереомерних продукти, що містять D- та L-ацильні бічні ланцюги, дані діастереомерні маутансиноїдні ефіри легко розділяються з використанням способів, що відомі у даній галузі, і менш бажаний Dаланіловий аналоговий ізомерний продукт відновлюється з утворенням маутансинолу, як показано у WO 03096782. Відновлювальне розщеплення 94388 24 дисульфідної групи дитіотреітолом дає відповідний маутансиноїд, що містить тіол, котрий легко зчіплюється через дисульфідний або тіоефірний зв'язок з агентами, котрі зв'язують клітину. Тіолмаутансиноїди можуть піддаватись очищенню методом високоефективної рідинної хроматографії з використанням С 18 колонки з оберненою фазою при градієнтному елююванні сумішшю водаацетонітрил. Біфункціональні сполучні реагенти Відомо, що при приготуванні кон'югатів двох речовин, принаймні одна із яких включає протеїн або поліпептид, використовуються біфункціональні агенти з метою ковалентного сполучення компонентів даного кон'югата; звичайно, для реакції кон'югації застосовуються аміногрупи в молекулах, що піддаються кон'югації. Біфункціональні протеїнові сполучні агенти включають N-сукцинімідил-(2піридилдитіо)пропіонат (SPDP), сукцинімідил-4-(Nмалеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат, імінотіолан (IT), біфункціональні похідні імідоефірів, такі як диметил адипімідат·HCl, активні ефіри, такі як дисукцинімідил суберат, альдегіди, такі як глутаральдегід, біс-азидо сполуки, такі як біс(раксидобензоїл)гександіамін, біс-діазонієві похідні, такі як біс-(р-діазонійбензоїл)-етилендіамін), діізоціанати (такі як толуол-2,6-діізоціанат), та біс активні фторидні сполуки, такі як 1,5-дифторо-2,4динітробензол). SPDP є серед найбільш часто уживаних для цього реагентів, і також корисними виявились багато інших N-сукцинімідил-(2піридилдитіо)-, N-сукцинімідил-(5-нітро-2піридилдитіо)або N-сукцинімідил-(4піридилдитіо)-алканових кислот з короткими ланцюгами. На Фіг.2 зображені структури найбільш поширених біфункціональних лінкерів та їх акроніми. Кон'югація активованого антитіла з тіольованим маутансиноїдом. Одержання кон'югатів CNTO 95-маутансиноїд здійснюється згідно зі способом, що описаний раніше (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131, 1992 та патент США 5208020), і як це окреслено на Фіг.3. У цій процедурі антитіло модифікується біфункціональним лінкером при відношенні лінкер-антитіло у межах 5-10:1 з уведенням дитіопіридильних груп в амінокислотні бічні ланцюги даного антитіла. Активоване антитіло відокремлюється від залишкового лінкера за методом G25 гель-фільтраційної хроматографії. Відношення лінкер-антитіло після очистки складає менше 5-10:1, і, типово, лежить у межах 3-5:1, з визначенням за оптичною густиною при 252 та 280 нм. Активований тіол-маутансиноїд додається при молярному надлишку до відміряного лінкера. Відповідно до кон'югації, дану суміш знов піддають очищенню за методом G25 витіснювальної хроматографії з одержанням об'ємного продукту. Як альтернатива, кон'югат антитіло проти інтегрину - маутансиноїд одержується у значній мірі в одну стадію шляхом реакції маутансииоїду, що несе реакційний ефір, з антитілом проти інтегрину, котре попередньо хімічно не активувалось. Реакційний ефір маутансиноїду може бути Nсукцинімідиловим, N-сульфосукцинімідиловим, N 25 фталіміділовим, N-сульфофталімідиловим, 2нітрофеніловим, 4-нітрофеніловим, 2,4динітрофеніловим, 3-сульфоніл-4-нітрофеніловим або 3-карбокси-4-нітрофеніловим ефіром. Даний спосіб описаний у публікації WO 2002 098883, на яку у даному тексті зроблено посилання. 4. Способи використання кон'югатів даного винаходу Антитіла даного винаходу можуть призначатись суб'єкту, котрий потребує цього, для запобігання, лікування, контролю або послаблення раку, або одного чи кількох його симптомів. Антитіла даного винаходу можуть також призначатись у комбінації з однією або кількома іншими терапіями, краще, терапіями, що корисні для запобігання, контролю або лікування раку (включаючи, проте не обмежуючись цим, профілактичні або терапевтичні агенти, що перелічені нижче), суб'єкту, котрий потребує цього, для запобігання, лікування, контролю або послаблення раку, або одного чи кількох його симптомів. В особливому варіанті даний винахід запроваджує спосіб запобігання, лікування, контролю або послаблення раку, або одного чи кількох його симптомів, зазначений спосіб включає призначення суб'єкту, котрий потребує цього, дози профілактично або терапевтично ефективної кількості препарату, що містить кон'югати антитіла проти альфа V даного винаходу. В іншому варіанті даний винахід запроваджує спосіб запобігання, лікування або послаблення раку, або одного чи кількох його симптомів, зазначений спосіб включає призначення суб'єкту, котрий потребує цього, дози профілактично або терапевтично ефективної кількості кон'югатів антититіла проти альфа V даного винаходу у сполученні з профілактично або терапевтично ефективною однією чи кількома терапіями (наприклад, хірургією, променевою терапією, або застосуванням терапевтичних агентів, інших, ніж кон'югати антитіла проти альфа V). Кон'югати антитіла даного винаходу можуть бути використані як перша, друга, третя або четверта лінії лікування раку. Даний винахід запроваджує способи для лікування або послаблення одного або кількох симптомів раку у суб'єкта. Крім того, даний винахід запроваджує способи для запобігання рецидивам раку у пацієнтів, що піддавались лікуванню і не виявляли активності хвороби, шляхом застосування кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу. Рак, що може лікуватись з використанням способів, які охоплюються даним винаходом, включає, проте не обмежуючись цим, новоутворення, пухлини, метастази або будь-яку хворобу чи розлад, які характеризуються неконтрольованим ростом клітин. Рак може бути первинним або метастатичним. Клітини раку можуть або не можуть експресувати альфа V субодиничні інтегрини. У варіанті, якому віддається перевага, рак, що контролюється, лікується або послаблюється згідно зі способами даного винаходу, являє собою рак, котрий експресує інтегрин альфа V субодиницю і метастазується в інший сайт або орган у тілі пацієнта, або має потенціал метастазувати туди. Специфічні приклади раку, що може лікуватись з використанням способів, які охоплюються даним 94388 26 винаходом, включають, проте не обмежуючись цим, рак голови, шиї, очей, рота, горла, стравоходу, грудної клітки, кісток, легень, товстої кишки, прямої кишки, шлунка, простати, молочної залози, яєчника, нирок, печінки, підшлункової залози та мозку. Додаткові види раку включають, проте не обмежуючись цим, наступні: лейкози, такі як, проте не обмежуючись цим, гострий лейкоз, гострий лімфоцитарний лейкоз, гострі мієлоцитарні лейкози, такі як мієлобластний, промієлоцитарний, мієломоноцитарний, моноцитарний, еритролейкозні лейкози та мієлодиспластичний синдром, хронічні лейкози, такі як, проте не обмежуючись цим, хронічний мієлоцитарний (гранулоцитарний) лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, злоякісний ретикулоендотеліоз; еритремія; лімфоми, такі як, проте не обмежуючись цим, хвороба Ходжкіна, неходжкінська лімфома; мієломи, такі як множинна мієлома, несекреторна мієлома, остеосклеротична мієлома, плазмоцитарний лейкоз, окрема плазмоцитома та екстрамедулярна плазмоцитома; макроглобулінемія Вальденстрема; рак кісток та саркоми з'єднувальної тканини, такі як саркома кісток, мієломна хвороба кісток, остеосаркома, хондросаркома, саркома Юїнга, хвороба кісток Пагета, злоякісна гігантоклітинна пухлина, фібросаркома кісток, хордома, періостальна саркома, саркоми м'яких тканин, ангіосаркома (гемангіосаркома), фібросаркома, саркома Капоші, лейоміосаркома, ліпосаркома, лімфангіосаркома, невринома, рабдоміосаркома, синовіальна саркома; пухлини мозку, такі як, проте не обмежуючись цим, гліома, астроцитома, негліальна пухлина, слухова невринома, краніофарингіома, медулобластома, менінгіома, пінеоцитома, пінеобластома, первинна мозкова лімфома: рак молочної залози, включаючи аденокарциному та індуковані карциноми, та папілярний рак молочної залози; адренальний рак, включаючи феохромоцитому та адренокортикальну карциному; рак щитоподібної залози; рак підшлункової залози; рак гіпофізної залози; рак очей, не обмежуючись очною меланомою, хороїдальною меланомою, меланомою ціліарного тіла та ретинобластомою; вагінальний рак; вульварний рак; цервікальний рак; рак матки, не обмежуючись ендометричною карциномою та саркомою матки; рак яєчника; рак стравоходу та інші види раку голови та шиї, такі як, проте не обмежуючись цим, сквамозний рак, аденокарцинома, мукоепідермоїдна карцинома, аденосквамозна карцинома, саркома, меланома, плазмацитома, верукозна карцинома, та вівсяноклітинна (малоклітинна) карцинома; рак шлунку: рак товстої кишки; ректальний рак; рак печінки, такий як гепатоцелюлярна карцинома та гепатобластома, рак жовчного міхура; холангіокарциноми; рак легень, такий як недрібноклітинний рак легень, сквамозноклітинна карцинома (епідермоїдна карцинома), аденокарцинома, гігантоклітинна карцинома та дрібноклітинний рак легень; тестикулярний рак, хоріокарцинома (пухлина жовткового мішка), рак простати; пенільний рак; ротовий рак, не обмежуючись сквамозноклітинною карциномою; базальноклітинний рак; рак слинної залози; рак клітин ниркового епітелію та інші види раку нирок; та рак сечового міхура, не обмежую 27 чись карциномою перехідних клітин (огляд таких розладів дивись у роботі DeVita, V.T., Hellman, S., & Rosenberg, S.A. Cancer: Principles and practice of th oncology. Philadelphia: J.B. Lippincott Company; 6 Edition, 2001). Передракові стани можуть також лікуватись з використанням способів та композицій даного винаходу. Такі види раку можуть включати, проте не обмежуючись цим, фолікулярні лімфоми, карциноми з р53 мутаціями, пухлини молочної залози, що залежать від гормонів, порушення простати та яєчника, і передракові ушкодження, такі як сімейний аденоматозний поліпоз, і мієлодиспластичні синдроми. У варіанті, якому віддається перевага, рак, котрому запобігають, який контролюють, лікують або полегшують згідно зі способом даного винаходу, вибирається із раку простати, раку молочної залози, раку кісток, меланоми, раку легень та раку яєчника. В іншому варіанті рак, котрому запобігають, який контролюють, лікують або полегшують згідно зі способами даного винаходу, вибирається із метастатичних пухлин, включаючи, проте не обмежуючись цим, пухлини, які метастазували або можуть метастазувати у кістки (не обмежуючими прикладами є рак простати, молочної залози та легень, що метастазував або має можливість метастазувати у кістки), пухлини, що метастазували або можуть метастазувати в легені, пухлини, що метастазували або можуть метастазувати у мозок, і пухлини, що метастазували або можуть метастазувати в інші органи чи тканини суб'єкта. Протиракова терапія Будь-який агент або терапія (наприклад, хіміотерапія, променева терапія, гормональна терапія та/або біологічна терапія або імунотерапія), що, як відомо, корисні, або котрі застосовувались або застосовуються у теперішній час для запобігання, лікування, контролю або послаблення раку або одного чи кількох його симптомів, можуть використовуватись у комбінації з кон'югатом антитіла проти альфа V даного винаходу згідно з описаним тут винаходом. Терапевтичні або профілактичні агенти включають, проте не обмежуючись цим, пептиди, поліпептиди, протеїни, злиті протеїни, молекули нуклеїнових кислот, невеликі молекули, міметичні агенти, синтетичні ліки, неорганічні молекули та органічні молекули. Приклади класів таких агентів (тобто протиракових агентів) включають, проте не обмежуючись цим, цитотоксини, інгібітори ангіогенезу та імуномодуляторні агенти, і агенти, що застосовуються для зняття болю або компенсації шкідливих ефектів одного або кількох терапевтичних агентів (наприклад, бісфосфонат використовується для зниження гіперкальцемічних ефектів глюкокортикоїдів). Біологічні імуномодуляторні агенти включають: антитіла проти Т-клітинних рецепторів, такі як антитіла проти CD3 (наприклад, Нувіон (лабораторії Protein Design), OКT3 (Johnson & Johnson), або антитіла проти CD20 Ритуксан (IDEC), антитіла проти CD52 (наприклад, CAMPΑΤΗ 1H (Ілекс)), антитіла проти CD11a (наприклад, Ксанелім (Genentech)); атитіла проти цитокіну або цитокінових рецепторів, та антагоністи, такі як антитіла проти IL-2 рецепторів (Зенапакс (лабораторії 94388 28 Protein Design)), антитіла проти IL-6 рецепторів (наприклад, MRA (Chugai)), та антитіла проти IL-12 (CNTO 1275 (Centokor)), антитіла проти TNF альфа (Ремікад (Centocor)) або TNF рецепторний антагоніст (Енбрел (Immunex)), антитіла проти IL-6 (BE8 (Diaclone) і CNTO328 (Centocor)), та антитіла, що в імуноспецифічний спосіб зв'язуються з антигенами, які асоціюються з пухлиною (наприклад, трастузимаб (Genentech). Інгібітори ангіогенезу (тобто антиангіогенні агенти) включають, проте не обмежуючись цим, ангіостатин (плазміногенний фрагмент); антиангіогенний протитромбін III; ангіозим. Бісфосфонати включають, проте не обмежуючись цим, алендронат, клодронат, етидронат, ібандронат, памідронат, ризедронат, тилудронат та золедронат. Специфічні приклади протиракових агентів, котрі можуть бути використані згідно зі способами даного винаходу, включають, проте не обмежуючись цим: 5-флуорурацил; акивіцин; алдеслейкін; альтретамін; аміноглутeтимід; амсакрин; анастрозол; антраміцин; аспарагіназа, азацитидин; азетепа; азотоміцин; батимастат; бікалутамід; блеоміцину сульфат; брекінар натрій; бропіримін; бусульфан; карбоплатин; кармустин; карубіцину гілрохлорид; карцелезин; цедефінгол; хлорамбуцил; циролеміцин; цисплатин; кладрибін; кризнатолу мезилат; циклофосфамід; цитарабін; дакарбазин; дактиноміцин; даунорубіцину гідрохлорид; децитабін; дексормаплатин; дезагуанін; дезагуаніну мезилат; діазикон; доцетаксел; доксорубіцин; доксорубіцину гідрохлорид; дролоксифен; дролоксифену цитрат; дромостанолону пропіонат; дуазоміцин; едатрексат; ефломітину гідрохлорид; енлоплатин; енпромат; епіпропідин; епірубіцину гідрохлорид; ербулозол; езорубіцину гідрохлорид; естрамустин; естрамустину фосфат натрію; етанідазол; етопозид; етопозиду фосфат; фазарабін; фенретинід; флоксуридин; флударабіну фосфат; флуороурацил; флуроцитабін; фоскуідон; фостриєцин натрію; гемцитабін; гемцитабіну гідрохлорид; гідроксисечовина; ідарубіцину гідрохлорид; іфосфамід; ілмофозин; інтерлейкін II (включаючи рекомбінатний інтерлейкін II або rIL2), інтерферон альфа-2а; інтерферон альфа-2b; інтерферон альфа-m; інтерферон альфа-n3; інтерферон бета-1а; інтерферон гамма-1b; іпроплатин; іринотекану гідрохлорид; ланреотиду ацетат; летрозол; лепроліду ацетат; ліарозолу гідрохлорид; лометрексол натрій; ломустин; лозоксантрону гілрохлорид; мазопрокол; мехлоретаміну гідрохлорид; мегестролу ацетат; меленгестролу ацетат; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрій; метоприн; метуредепа; мітоміцин; мітоспер; мітотан; мітоксантрону гідрохлорид; мікофенолова кислота; нокодазол; ормаплатин; паклітаксел; пегаспаргаз; порфроміцин; преднімустин; прокарбазину гідрохлорид; пуроміцин; роглетимід; сафінголу гідрохлорид; семустин; симтразен; спарфозат натрій; спарсоміцин; спіромустин; спіроплатин; стрептонігрин; стрептозоцин; сулофенур; талізомуцин; тегафур; телоксантрону гілрохлорид; темопорфін; теніпозид; тероксирон; тестолактон; тіаміприн; тіогуанін; тіотепа; тіазофурин; тірапазамін; топотекан; триметрексат; триметрексату глю 29 коронат; трипторелин; урацил мустард; уредепа; вапреотид; вертепорфін; вінбластину сульфат; вінкристину сульфат; віндезин; віндезину сульфат; вінепілину сульфат; вінгліцинату сульфат; вінлеурозину сульфат; вінорелбіну тартрат; вінрозидину сульфат; вінзолідину сульфат; ворозол; зеніплатин; зиностатин; зорубіцину гідрохлорид. Даний винахід також охоплює застосування антитіла даного винаходу у комбінації з променевою терапією, що включає використання рентгенівських променів, гамма променів та інших джерел опромінення для руйнування ракових клітин. У варіантах, яким віддається перевага, променева терапія застосовується як зовнішня променеве опромінення або телетерапія, де випромінювання спрямовується від віддаленого джерела. В інших варіантах, яким віддається перевага, променеве лікування застосовується як внутрішня терапія або брахітерапія, де радіоактивне джерело розмішується всередині тіла поблизу ракових клітин або маси пухлини. У специфічних варіантах пацієнтам з раком молочної залози призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з призначенням профілактично або терапевтично ефективної кількості одного або кількох інших агентів, корисних для терапії раку молочної залози, включаючи, проте не обмежуючись цим, доксорубіцин, епірубіцин, комбінацію доксорубіцину та циклофосфаміду (АС), комбінацію циклофосфаміду, доксорубіцину та 5-флуороурацилу (CAP), комбінацію циклофосфаміду, епірубіцину та 5флуороурацилу (CEF), або інші агенти, такі як герцептин, тамоксифен, паклітаксел або таксотер. У специфічних варіантах пацієнтам з раком простати призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з призначенням профілактично або терапевтично ефективної кількості одного або кількох інших агентів, корисних для лікування раку простати, включаючи, проте не обмежуючись цим, зовнішню променеву терапію; внутрішньотканинну імплантацію радіоізотопів, наприклад, ренію, паладію або іридію; лепролід або інші LHRH агоністи; нестероїдні антиандрогени (флутамід, нилутамід, бікалутамід), стероїдні анти андрогени (ципротерону ацетат), комбінацію лепроліду та флутаміду, естрогени, такі як DES, етиніл естрадіол; низькодозовий преднізон, або інші-хіміотерапевтичні схеми, про які доповідалось, щo вони дають суб'єктивне поліпшення симптомів та зниження PSA рівнів. У специфічних варіантах пацієнтам з раком яєчника призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з призначенням профілактично або терапевтично ефективної кількості одного або кількох інших агентів, корисних для лікування раку яєчника, включаючи, проте не обмежуючись цим, інтраперитонеальну 32 променеву терапію, таку як Р терапію; повну черевну та тазову променеву терапію, цисплатин, комбінацію паклітаксела (Таксол) або доцетаксела (Таксотер) та цисплатин або карбоплатин, комбі 94388 30 націю циклофосфаміду та цисплатину, комбінацію циклофосфаміду та карбоплатину, комбінацію 5FU та леуковорину, етопозид, ліпосомний доксорубіцин, гемцитабін, іфосфамід, гексаметилмеламін (НММ), або топотекан. У специфічних варіантах пацієнтам з пухлинними метастазами у кістки призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з призначенням профілактично або терапевтично ефективної кількості одного або кількох, інших агентів, корисних для лікування кісткових пухлинних метастазів, включаючи, проте не обмежуючись цим, агенти або терапії, що використовуються у лікуванні основної злоякісності, такі як гормональні інгібітори для раку простати або раку молочної залози, що метастазував у кістки, променеву терапію або хіміотерапію остеотропними ізотопами металів (стронцій-89 та самарій-153) та біофосфонати (наприклад, палмідронат або алендронат). Терапія раку та дози, схеми застосування та рекомендації щодо застосування відомі у даній галузі і описані у такій літературі як Physician's th Desk Reference (57 ed., 2003), котра тепер доступна через Інтернет шляхом передплати у PDR Electronic Library, Thompson Micromedex, Greenwood Village, Colorado (Edition 2004). Лікування запальних розладів Кон'югати антитіла проти альфа V даного винаходу можуть призначатись суб'єкту, що потребує цього, для запобігання, лікування, контролю або послаблення запального розладу, або одного чи кількох його симптомів. Антитіла даного винаходу можуть також призначатись у комбінації з однією або кількома іншими терапіями, краще, терапіями, що корисні для запобігання, контролю, лікування або полегшення запального розладу (включаючи, проте не обмежуючись цим, профілактичні або терапевтичні агенти, що перелічені нижче), суб'єкту, котрий потребує цього, для запобігання, лікування, контролю або послаблення запального захворювання, або одного чи кількох його симптомів. Запальні розлади, котрі можуть піддаватись лікуванню за допомогою способів, що охоплюються даним винаходом, включають, проте не обмежуючись цим, астму, енцефаліт, запальну хворобу кишечнику, хронічку обструктивну легеневу хворобу (COPD), алергічні розлади, септичний шок, фіброз легень, недиференційовану спондилоартропатію, недиференційовану артропатію, артрити, остеоартрити, спондилоартропатії (наприклад, псоріатичний артрит, анкілозуючий спондиліт, синдром Рейтера (реактивний артрит), запальний остеоліз, хворобу Вільсона та хронічне запалення, спричинене хронічними вірусними чи бактеріальними інфекціями. Крім того, автоімунні розлади асоціюються із запальною патологією. Протизапальні терапії Даний винахід запроваджує способи запобігання, контролю, лікування або послаблення запального розладу, або одного чи кількох його симптомів, зазначені способи включають призначення суб'єкту, котрий погребує цього, кон'югату антитіла 31 проти альфа V та однієї або кількох терапій (наприклад, профілактичних або терапевтичних агентів, інших, ніж антитіла або фрагменти антитіл, що в імуноспецифічний спосіб зв'язуються з альфа V інтегринами). Будь-який агент або терапія, котрі, як відомо, корисні, або які використовувались, або використовуються у теперішній час для запобігання, контролю, лікування або послаблення запального розладу або одного чи кількох його симптомів, можуть використовуватись у комбінації з кон'югатом антитіла проти альфа V даного винаходу згідно з описаним тут винаходом. Приклади таких агентів включають, проте не обмежуючись цим, імуномодуляторні агенти, антиангіогенні агенти, протизапальні агенти та ТNFальфа антагоністи. Специфічні приклади імуномодуляторних агентів, котрі можуть призначатись у комбінації з кон'югатом антитіла проти альфа V даного винаходу суб'єкту із запальним розладом, включають метотрексат, лефлуномід, циклофосфамід, цитоксан, нуран, циклоспорин А, міноциклін, азатіоприн, антибіотики (наприклад, FK506 (такролімус)), метил преднізолон (МР), кортикостероїди, стероїди, мікофеноляту мофетил, рапаміцин (сиролімус), лефлунамід, антитіла проти Т-клітинних рецепторів (наприклад, ортоклон ОКТ3 (Johnson & Johnson), нувіон (лабораторії Protein Design), або антитіла проти IL-2 рецепторів (наприклад, зенапакс (лабораторії Protein Design) та антитіла проти IL6 (CNTO 328, Centocor) або IL-6 рецепторів (MRA, Chugai), та антитіла проти IL-12 (CNTO 1275, Centocor), антитіла проти IFN, антитіла проти TNF, антитіла проти IL-1 та- IL-альфа/бета антагоністи. Приклади TNF альфа антагоністів, котрі можуть призначатись у комбінації з кон'югатами антитіла проти альфа V даного винаходу суб'єкту із запальним розладом включають протеїни, поліпептиди, пептиди, злиті протеїни, антитіла (та їх фрагменти, що зв'язують антигени), такі як антитіла, що в імуноспецифічний спосіб зв'язуються з ТNFальфа, молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, антисенсові молекули або потрійні спіралі), органічні молекули, неорганічні молекули, та невеликі молекули, що блокують, знижують, інгібують або нейтралізують функцію, активність та/або експресію ТNFальфа. Приклади ТNFальфа антагоністів включають: інфліксимаб (ремікад; Centocor), D2E7 (гумара; Abbot Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co., Mt. Olive, N.J.), CDP571, який відомий також як хумікад та CDP-870 (обидва від Celltech/Pharmacia, Slough, U.K.), TNF-R1 (Amgen), етанерцепт (енбрел; Immunex), та інгібітори інших членів надсімейства TNFR рецепторів. Інші TNF антагоністи, що охоплені даним винаходом, включають, проте не обмежуючись цим, IL-10, котрий, як відомо, блокує продукування ТNFальфа, та агенти проти р38 MARK. Необмежувальні приклади протизапальних агентів, котрі можуть призначатись у комбінації з кон'югатом антитіла проти альфа V даного винаходу суб'єкту із запальним розладом, включають нестероїдні протизапальні ліки (NSAID), стероїдні протизапальні ліки, бета-агоністи, антихолінергічні 94388 32 агенти та метилксантини. Приклади NSAID включають, проте не обмежуючись цим, аспірин, ібупрофен, целекоксиб (целебрекс), диклофенак (волтарен), етодолак (іодин), фенопрофен (налфон), індометацин (індоцин), кеторалак (торадол), оксапрозин (дейпро), набументон (релафен), суліндак (клінорил), толментин (толектин), рофекоксіб (віокс), напроксен (алев, напрозин), кетопрофен (актрон) та набуметон (релафен). Такі NSAID діють шляхом інгібування циклооксгеназного ензиму (наприклад, СОХ-1 та/або СОХ-2). Приклади стероїдних протизапальних ліків включають, проте не обмежуючись цим, глюкокортикоїди, дексаметазон (декатрон), кортизон, гідрокортизон, преднізон (делтазон), преднізолон та триамциналон. У специфічних варіантах пацієнтам з остеоартритом призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з іншими агентами або терапіями, корисними для запобігання, лікування, контролю або полегшення остеоартриту, включаючи, проте не обмежуючись цим, анальгетики, такі як ацетамінофен, фенацетин; та трамадол, NSAID, такі як аспірин, дифлунізал, диклофенак, етодолак, фенамати, фенопрофен, флубіпрофен, ібупрофен, індометацин, кетопрофен, метилсаліцилат, небуметон, напрксин, оксапразин, фенілбутазон, піроксикам, суліндак, та толметин; специфічні інгібітори (CSI) циклооксигенази (Сох)-2, такі як целекоксиб та рофекоксиб; інтра- або периартикулярну ін'єкцію депо препаратів, наприклад, глюкокортикоїдів або біофармацевтичних препаратів, та інтра-артикулярну ін'єкцію гіалуронової кислоти. Кон'югат антитіла проти альфа V даного винаходу може також застосовуватись у комбінації з іншими нефармакологічними засобами запобігання, лікування, контролю та полегшення остеоартриту, включаючи, проте не обмежуючись цим, іригацію остеоартритного суглобу, зниження навантаження на суглоб, аплікацію тепла або холоду до ураженого суглобу; перцевий крем; вправи та іншу фізичну терапію, та хірургію по заміні суглобу. У специфічних варіантах пацієнтам з ревматоїдним артритом призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з іншими агентами або терапіями, корисними для запобігання, лікування, контролю або полегшення ревматоїдного артриту, включаючи NSAID, анальгетики, та CSI, як розглядалось для остеоартриту. Крім того, у конкурентний спосіб можуть застосовуватись й інші терапії, до або після застосування антитіла проти альфа V даного винаходу, такі як щомісячні імпульси високих доз глюкокортикоїдів, або внутрішньосуглобові уведення глюкокортикоїдів; модифікуючі хворобу протиревматичні ліки (DMARD), включаючи метотрексат, сполуки золота (наприклад, ауранофін), D-пеніциламін, протималярійні препарати (наприклад, хлорокін) та сульфасалазин; агенти, що нейтралізують TNFальфа, такі як етанерцепт тa інфліксимаб; імуносупресори та цитотоксичні агенти, що не обмежуються азатіоприном, лефлуномідом, циклоспорином і циклофосфамідом; та хірургічні інтервенції, такі як арт 33 ропластика, повна заміна суглобу, реконструктивна ручна хірургія, відкрита або артроскопічна синовектомія та рання тендосиновектомія зап'ястка; зовнішні інтервенції, такі як різновид ортопедичних та допоміжних пристроїв, та інші фізичні терапії; та дієтичні доповнення, такі як підсилення уживання омега-3 жирних кислот (таких як ейкозапентенова кислота). У специфічних варіантах пацієнтам з хронічною обструктивною легеневою хворобою (COPD) призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з іншими агентами або терапіями, корисними для запобігання, лікування, контролю або полегшення COPD, включаючи, проте не обмежуючись цим, бронходилагатори, включаючи, проте не обмежуючись цим, бета-адренергічні агоністи короткої та тривалої дії, такі як альбутерол, пірбутерол, тербуталін, та метапротеренол, пероральний альбутерол затриманого виділення та салметерол, що застосовується шляхом інгаляції; антихолінергетики, такі як іпратропію бромід, та теофілін і його похідні; глюкокортикоїди; кисень; легеневу трансплантацію; хірургію, пов'язану зі зниженням об'єму легень; ендотрахеальну інтубацію, вентиляційну підтримку; щорічну вакцинацію проти грипу та пневмококову вакцинацію; вправи; та припинення паління. У специфічних варіантах пацієнтам з фіброзом легень призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з ефективною кількістю одного або кількох інших агентів, корисних для терапії фіброзу легень, включаючи, проте не обмежуючись цим, кисень, кортикостероїди; цитотоксичні ліки (циклофосфамід або азатіоприн); бронходилататори, такі як бета-адренергічні агоністи короткої та тривалої дії, антихолінергетики, та теофілін і його похідні); та антигістамінні препарати (дифенгідрамін та доксиламін). У специфічних варіантах пацієнтам з астмою призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з ефективною кількістю одного або кількох інших агентів, корисних для лікування астми, включаючи, проте не обмежуючись цим, адренергічні стимулятори (приклади включають, але не обмежуються цим, катехоламіни, наприклад, епінефрин, ізоперотеренол, та ізоетарин; резорциноли, наприклад, метапротеренол, тербуталін, та фенотерол; та салігеніни, наприклад, салбутамол; метилксантіни, включаючи теофілін та його різні солі; антихолінергетики, включаючи атропіну сульфат, акопіну метил нітрат, та іпратропію бромід; глюкокортикоїди; агенти, що стабілізують мастоцити, такі як кромолін натрій та недокроміл натрій; лейкотрієнові модифікатори, такі як злеутон, зафірлукаст та монтелукаст; імуносупресанти, включаючи метотрексат; та ацетилцистеїн. У специфічних варіантах пацієнтам з алергією призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з ефективною кількістю одного або кількох інших агентів, корис 94388 34 них для лікування алергії, включаючи, проте не обмежуючись цим, кромолін; антигістамінні препарати; симпатоміметичні ліки (як альфаадренергічні, так і бета-адренергічні ліки); теофілін та його похідні; глюкокортикоїди; та імуннодесенсибілізуючу терапію за допомогою ін'єкцій алергенів. Лікування автоімунних розладів Кон'югат антитіла проти альфа V даного винаходу може призначатись суб'єкту, який потребує цього, для запобігання, контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів. Кон'югат антитіла проти альфа V даного винаходу може також призначатись у комбінації з однією або кількома іншими терапіями, краще, терапіями, що корисні для запобігання, контролю або лікування автоімунного розладу (включаючи, проте не обмежуючись цим, профілактичні або терапевтичні агенти, перелічені нижче), суб'єкту, котрий потребує цього, для запобігання, контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів. У специфічному варіанті даний винахід запроваджує спосіб запобігання, контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів, зазначений спосіб включає призначення суб'єкту, котрий потребує цього, дози профілактично або терапевтично ефективної кількості рідкого препарату даного винаходу. В іншому варіанті даний винахід запроваджує спосіб запобігання, контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів, зазначений спосіб включає призначення суб'єкту, котрий потребує цього, дози профілактично або терапевтично ефективної кількості рідкого препарату даного винаходу та дози профілактично або терапевтично ефективної кількості одного або кількох терапевтичних препаратів (наприклад, профілактичних або терапевтичних агентів), відмінних від антитіл або фрагментів антитіл, що в імуноспецифічний спосіб зв'язуються з альфа V інтегрином. Даний винахід запроваджує способи контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів у суб'єкта, резистентного до звичайних терапій для такого автоімунного розладу, зазначені способи включають призначення зазначеному суб'єкту дози профілактично або терапевтично ефективної кількості антитіл даного винаходу. Даний винахід також запроваджує способи контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів у суб'єкта, резистентного до існуючих моноагентних терапій для такого автоімунного розладу, зазначені способи включають призначення зазначеному суб'єкту дози профілактично або терапевтично ефективної кількості кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу та дозу профілактично або терапевтично ефективної кількості одного або кількох терапевтичних препаратів (наприклад, профілактичних або терапевтичних агентів), інших, ніж антитіла або фрагменти антитіл, що в імунологічний спосіб зв'язується з альфа V інтегрином. Даний винахід також запроваджує способи контролю, лікування або 35 послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів шляхом призначення кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з будь-яким іншим лікуванням пацієнтам, котрі виявили резистентність до іншого лікування, але більше не застосовують це лікування. Даний винахід також запроваджує альтернативні способи контролю або лікування автоімунного розладу, де інша терапія виявилась або може виявитись занадто токсичною, тобто призводить до неприйнятних або непереносних побічних ефектів для пацієнта, котрий піддається лікуванню. Зокрема, даний винахід запроваджує альтернативні способи контролю або лікування автоімунного розладу, де даний пацієнт є резистентним до інших терапій. Крім того, даний винахід запроваджує способи запобігання рецидивам автоімунного розладу у пацієнтів, що піддавались лікуванню і не мають виявів активності хвороби, шляхом застосування кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу. При автоімунних розладах імунна система запускає імунну реакцію, коли сторонні речовини, проти яких має проводитись боротьба, відсутні, і нормальна захисна імунна система організму спричиняє шкоду своїм власним тканинам, помилково атакуючи сама себе. Є багато різних автоімунних розладів, котрі діють на організм у різні способи. Наприклад, мозок уражується в осіб з розсіяним склерозом, кишки уражуються в осіб з хворобою Крона, і синовіальна капсула, кістка та хрящ різних суглобів уражуються в осіб з ревматоїдним артритом. У міру, як автоімунні розлади прогресують, може виникати деструкція одного або кількох типів тканин тіла, аномальний ріст органу, що може супроводжуватись неоваскуляризацією зазначеного органу або тканини, або зміни у функції органу. Автоімунний розлад може спричинювати шкоду лише одному типу органу або тканини, або множині органів та тканин. Органи та тканини, що звичайно вражаються автоімунними розладами, включають червоні кров'яні тільця, кровоносні судини, з'єднувальні тканини, ендокринні залози (наприклад, щитоподібну або підшлункову), м'язи, суглоби та шкіру. Приклади автоімунних розладів, що можуть лікуватись за допомогою способів даного винаходу, включають, проте не обмежуючись цим, алопецію вогнищеву, анкілозивний спондиліт, антифосфоліпідний синдром, автоімунну хворобу Едісона, автоімунні хвороби надниркової залози, автоімунну гемолітичну анемію, автоімунний гепатит, автоімунний оофорит та орхіт, автоімунну тромбоцитопенію, хворобу Берета, бульозний пемфігоїд, кардіоміопатію, черевний спру-дерматит, синдром хронічної втоми імунної дисфункції (CFIDS), хронічну запальну демієлінізуючу поліневропатію, синдром Черджа-Строса, рубцевий пемфігоїд, синдром CRST, хворобу холодових аглютинінів, хворобу Крона, дискоїдний вовчак, ессенціальну змішану кріоглобулінемію, фіброміалгію-фіброміозит, гломерулонефрит, хворобу Граве, Гієна-Баре, тіреоідит Хашімото, ідіопатичний фіброз легень, ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру (ІТР), IgA невропатію, ювенільний артрит, червоний плеский лишай, червоний вовчак, хворо 94388 36 бу Меньєра, змішану хворобу з'єднувальної тканини, розсіяний склероз, типу 1 або імуноопосередкований цукровий діабет, важку міастенію, пемфігус вульгаріс, перніціозну анемію, нодозний поліартрит, поліхрондрит, полігландулярні синдроми, поліміалгію ревматика, поліміозит та дерматоміозит, первинну агамаглобулінемію, первинний міліарний цироз, псоріаз, псоріатичний артрит, феномен Рейнольда, синдром Рейтера, ревматоїдний артрит, саркоїдоз, склеродерма, синдром Шегрена, синдром ригідної людини, системний еритематозний вовчак, еритематозний вовчак, синдром Такаясу, скроневий артрит/гігантськоклітинний артрит, виразковий коліт, увеїт, васкуліти, такі як герпетиформний васкулітний дерматит, вітіліго, та грануломатоз Вегенера. Види автоімунної терапії, дози, схеми застосування та рекомендації щодо застосування відомі у даній галузі і описані у літературі, такій як th th Physician's Desk Reference (56 ed., 2002, та 57 ed., 2003). Даний винахід запроваджує способи запобігання, контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох його симптомів, зазначені способи включають призначення суб'єкту, котрий потребує цього, кон'югату антитіла проти альфаV даного винаходу та одного або кількох терапевтичних засобів (наприклад, профілактичних або терапевтичних агентів), відмінних від антитіл або фрагментів антитіл, котрі в імуноспецифічний спосіб зв'язуються з альфа V інтегринами. Будь-який агент або терапія, котрі, як відомо, корисні, або які використовувались, або використовуються у теперішній час для запобігання, контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу або одного чи кількох їх симптомів, можуть застосовуватись у комбінації з кон'югатом антитіла проти альфа V даного винаходу згідно з даним винаходом, що тут описаний. Приклади таких агентів включають, проте не обмежуючись цим, імуномодуляторні агенти, протизапальні агенти та ТNFальфа антагоністи. Специфічні приклади імуномодуляторних агентів, протизапальних агентів та ТNFальфа антагоністів, котрі можуть використовуватись у комбінації з кон'югатом антитіла проти альфа V даного винаходу для запобігання, контролю, лікування або послаблення автоімунного розладу, розкриті вище. У специфічних варіантах пацієнтам з множинним склерозом (MS) призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з іншими агентами або терапіями, що корисні для запобігання, лікування, контролю та послаблення MS, включаючи, проте не обмежуючись цим, IFN-бета 1b (бетасерон) та IFN-альфа2а (авонекс); глатирамеру ацетат (копаксон); мітоксантрон; метотрексат; циклофосфамід; внутрішньовенний імуноглобулін, глюкокортикоїди; метилпреднізолон; 2-хлородеоксиаденозин (кладрибін), баклофен (перорально або інтратекально через вбудований катетер), циклоензаприну гідрохлорид; клоназепам; клонідіину гідрохлорид; карбамазепін; габапентин; амітриптилін; примідон; ондансетрон; ізоніазид; оксибутинін; толтеродин; 37 пропантелін; бетанекол; теразозину гідрохлорид; силденафілу цитрат; амантадин; пемолін; вітаміни у великих дозах; оротат кальцію; гансикловір; антибіотики та плазмовий обмін. У специфічних варіантах пацієнтам з псоріазом призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з іншими агентами або терапіями, що корисні для запобігання, лікування, контролю та послаблення псоріазу, включаючи місцеві препарати, що містять стероїди; дьоготь (естаровий, псоригелевий, фототаровий крем); місцево аналоги вітаміну D, такі як кальціпотрієнова мазь; ультрафіолетове світло з або без псоралену; та синтетичні ретиноїди. У специфічних варіантах пацієнтам з хворобою Крона призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з іншими агентами або терапіями, що корисні для запобігання, лікування, контролю та послаблення хвороби Крона, включаючи, проте не обмежуючись цим, антидіарейні засоби (лоперамід, дифеноксилат з атропіном, холестирамін або колестипол); протиспазматичні засоби (пропанхелін, дицткломін, або гіосціамін); агенти 5аміносаліцилової кислоти (сульфасалазин, мезаламін (азакол) та його форма повільного виділення (пентаза); кортикостероїди; імуномодуляторні ліки, корисні при ревматичних хворобах - азатіоприн, меркаптопурин, циклоспорин, та метоірексат: антибіотики; TNF інгібітори, включаючи ентерасепт та інфліксимаб; імуносупресивні агенти, включаючи такролімус, мікофеноляту мофетил, та талідомід; дієтотерапії; ентеральну терапію з елементними дієтами (наприклад, вівонекс протягом 4 тижнів); та повне парентеральне харчування. У специфічних варіантах пацієнтам з еритематозним вовчаком призначають профілактично або терапевтично ефективну кількість кон'югату антитіла проти альфа V даного винаходу у комбінації з іншими агентами або терапіями, що корисні для запобігання, лікування, контролю та послаблення еритематозного вовчака, включаючи, проте не обмежуючись цим, протималярійні засоби (включаючи, але не обмежуючись цим, гідроксихлорокін); глюкокортикоїди (наприклад, може застосовуватись низькодозова, високодозова або високодозова внутрішньовенна пульс-терапія); імуносупресивні та імуномодуляторні агенти, включаючи циклофосфамід, хлорамбуцил та азантіоприн, метотрексат та мікофеноляту мофетил; андрогенні стероїди (включаючи, проте не обмежуючись даназолом); та антикоагулянти (включаючи, проте не обмежуючись варфарином). Незлоякісні або імунологічно-зв'язані клітиннопроліферативні хвороби Кон'югати даного винаходу також корисні для лікування незлоякісних проліферативних хвороб і, особливо, таких хвороб, що включають ангіогенез. Ангіогенез, як відомо, є чинником, що вносить свій вклад у ряд патологічних станів на додаток до здатності пухлин до росту та метастазування, очних розладів, включаючи ретинопатії, та розлади шкіри, включаючи псоріаз та саркому Капоші. Репре 94388 38 зентативні приклади таких неонкогенних залежних від ангіогенезу хвороб включають рогівкову неоваскуляризацію, гіпертрофічні рубці та келоїди, проліферативну діабетичну ретинопатію, ревматоїдний артрит, артеріовенозні мальформації (розглянуті вище), атеросклеротичні бляшки та ішемічну хворобу серця, затримане загоювання ран, гемофільні суглоби, незрощувані переломи, синдром Ослера-Вебера, псоріаз, пемфігус вульгаріс, синдром Бекета, гострий респіраторний дистрес-синдром (ARDS), піогенна гранулома, склеродерма, трахома, менорагія (розглянута вище) та васкулярні спайки. 4. Фармацевтичні препарати Даний винахід запроваджує стабільні препарати кон'югатів антитіло проти альфа Vмаутансиноїд, котрі, краще, являють собою водний фосфатний буферний сольовий або змішаний сольовий розчин, так само як і законсервовані розчини та препарати, що містять консервант, так само як і законсервовані препарати багаторазового застосування, що придатні для фармацевтичного або ветеринарного використання, котрі включають принаймні один кон'югат антитіло проти альфа V - маутансиноїд у фармацевтично прийнятному препараті. Консерванти, яким віддається перевага, включають ті, що, вибираються із групи, яка складається із фенолу, m-крезолу, р-крезолу, о-крезолу, хлорокрезолу, бензилового спирту, алкілпарабену (метил, етил, пропіл, бутил і таке подібне), бензалконій хлориду, бензтоній хлориду, дегідроацетату натрію та тимерозалу, або їх сумішей. Принаймні один кон'югат антитіло проти альфа V - маутансиноїд у вигляді стабільних або законсервованих розчинів, що тут описані, може призначатись пацієнту згідно з даним винаходом шляхом доставки з використанням різновиду способів, включаючи підшкірні або внутрішньом'язові ін'єкції; трансдермальний, пульмонарний, трансмукозальний, імплантацію, осмотичну помпу, картридж:, мікропомпу, або інші засоби, з якими знайомі фахівці, як це добре відомо у даній галузі. 5. Фармацевтичні препарати У способі застосування CNTO 95 - маутансиноїд, якому віддається перевага, дана лікарська речовина вводиться внутрішньовенно із попередньо встановленого катетеру, обладнаного інфузійною системою. CNTO 95 - мертансин постачається у 20 мл одноразових ампулах компанією ImmunoGen, Inc. (Cambridge, MA). Кожна ампула містить протеїн у концентрації від 0,05 до приблизно 2,0 мг/мл у буферному розчині (рН 6,5±0,5), що складається у значній мірі із первинного кислого фосфату калію (0,57 мг/мл), первинного кислого фосфату натрію моногідрату (0,20 мг/мл), вторинного кислого фосфату натрію (0,555 мг/мл), та хлориду натрію (8,16 мг/мл) в очищеній воді, Фармакопея США. Даний лікарський продукт попередньо фільтрується двічі шляхом інстиляції дозового об'єму в інфузійну систему шляхом його перепускання через 5 мкм фільтр з низьким зв'язуванням протеїну і уводиться пацієнтам через прохідний 0,22 мкм фільтр у межах 8 годин приготування. Після інфузії внутрішньовенна лінія має бути про 39 мита рідиною для забезпечення доставки повної дози ліків. Виходячи із попереднього досвіду застосування на людських пацієнтах кон'югатів Mabмаутансоїд шляхом внутрішньовенного введення, можливо застосовувати кожні три тижні дози у межах від 22 до 295 мг/мл (J Clin Oncol. 21:211222, 2003). 6. Виріб Даний винахід включає виріб, що містить матеріали, корисні для лікування розладів, котрі описані вище, який включає кон'югат антитіло проти альфа V - маутансиноїд, контейнер та етикетку або пакувальний вкладиш на ньому або з'єднаний з ним. Даний виріб містить, краще, принаймні одну ампулу, яка включає розчин принаймні одного кон'югату антитіло проти альфа V - маутансиноїд з приписаними буферами та/або консервантами, при потребі, у водному розчиннику, де зазначений пакувальний матеріал включає етикетку із зазначенням терміну зберігання такого розчину. Даний винахід може включати виріб, що містить пакувальний матеріал, першу ампулу, що містить ліофілізований принаймні один кон'югат антитіло проти альфа V - маутансиноїд, та другу ампулу, яка містить водний розріджувач приписаного буферу або консервант, де зазначений пакувальний матеріал включає етикетку з інструкцією практикуючому лікарю або пацієнту, яким чином відновити принаймні один кон'югат антитіло проти альфа V маутансиноїд у водному розріджувачі для утворення розчину. Придатні контейнери включають, наприклад, пляшки, ампули, шприці і т.д. Контейнери можуть бути зроблені із різновиду матеріалів, таких як скло або пластик. Даний контейнер може мати стерильний вхідний порт (наприклад, контейнер може являти собою пакет з внутрішньовенним розчином або ампулу з пробкою, котра може проколюватись гіподермічною ін'єкційною голкою). Принаймні одним активним агентом у даній композиції є кон'югат антитіло проти альфа V маутансиноїд. Етикетка або пакувальний вкладиш зазначають, що дана композиція застосовується для лікування вибраного стану, такого як рак. Пакувальний вкладиш може вказувати на те, що дане антитіло або композиція використовується для лікування раку, котрий не реагує або реагує слабо на лікування за допомогою стандартних засобів, як тут окреслено для специфічних захворювань та діагнозів. В інших варіантах пакувальний вкладиш може вказувати на те, що даний кон'югат антитіломаутансиноїд або композиція може також використовуватись для лікування метастатичного раку, раку простати, раку молочної залози або колоректального раку. Хоча даний винахід був описаний у загальних термінах, варіанти даного винаходу будуть додатково розкриті у наступних прикладах. Приклад 1 Одержання та опис моноклонального антитіла CNTO95 Одержання антитіла CNTO95 проти альфа V інтегрину детально описано у РСТ публікації за номером WO 02/12501 та у патентній публікації 94388 40 США за номером 2003/040044, на які у даному тексті зроблено посилання. Конкретно, людське Mab CNTO 95 було генероване шляхом імунізації (CBA/J x C57/BL6/J, GenPharm International) F2 гібридних мишей V3 інтегріном, очищеним із плаценти людини. Дане антитіло складається із людської варіабельної та lgG1 каппа константної ділянок. Спосіб одержання та бажані характеристики CNTO 95 описані раніше у WO0212501 та роботі Trikha et al. 2004, Int. J. Cancer 110 (3):326335. Були використані трансгенні миші від GenPharm International, що експресують людські імуноглобуліни, але не миші IgM або Ig. Ці миші містять трансгени людської послідовності, що піддаються V(D)J з'єднанню, важколанцюговокласному перемиканню та соматичній мутації з генерацією репертуару імуноглобулінів людської послідовності (Taylor et al., International Immunology 6:579-591 (1993)). Легколанцюговий трансген отримується, частково, із дріжджового штучного хромосомного клону, що включає приблизно половину зародковолінійної людської ділянки V. Окрім кількох VH генів, важколанцюговий (НС) трансген кодує як людську , так і людську 1 (Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994), та/або 3 константні ділянки. Миша, отримана від НС012 генотипного родоводу, застосовувалась в імунізації та процесі злиття для генерації моноклонального антитіла проти альфа V, котре використовувалось в одержанні кон'югату даного винаходу. Людську плаценту (зруйновану за допомогою м'ясорубки) або клітини меланоми людини М21, що експресують V3 інтегрин, екстрагували OTG (октилтіоглюкозидний укол) у буферному сольовому розчині як описано (WO0212501). Ці препарати піддавали емульсифікації рівним об'ємом повного ад'юванта Фрейнда (Freund) та використовували для імунізації 15-17 тижневого кастрованого у хірургічний спосіб самця миші (GenPharm, Foster City, СА) на 0 та 14 добу, і в неповному ад'юванті Фрейнда на 28, 48 та 56 добу. За три доби спленоцити збирали від миші з титром 1:1280 щодо альфаVбета3 з використанням формату твердої фази ЕІА. Злиття проводилось при відношенні клітин мишачої мієломи (SP2/0) до живих клітин селезінки 1:1. Гібридомні супернатанти піддавались скринінгу з використанням ЕІА (імуноферментний аналіз) методу мікроплат або ЕІА проби із захопленням, і вибрані лінії продукування антитіл розширювались та повторно випробувались на бажані властивості. Аналіз ELISA підтвердив, що очищене антитіло від двох гібридом, С372А (що також називається Mab CNTO 95) та С372А, зв'язує альфаVбета3 у спосіб, залежний від концентрації. П'ятдесят відсотків зв'язування досягається при 0,07 та 0,7 мкг/мл для С372А та CNTO 95 відповідно. У тій самій пробі антитіло проти альфаІІбета3, с7ЕЗ IgG, демонструвало 50% максимальне зв'язування при 0,07 мкг/мл. Для визначення унікальної специфічності CNTO 95 проводились проби на конкурентне зв'язування (або комплементацію) з використанням наступних мишачих антитіл: m7E3 IgG, проти аль 41 фаVбета3 (клон LM609, Chemicon), проти альфаVбета5 (клон P12F6, Gibco), проти бета3 (Chemicon, АМАС), або проти альфаV (клон VNR139, Gibco). Ці результати продемонстрували, що CNTO 95 зв'язує епітоп, який не розділяється іншими випробуваними антитілами. Дані по спорідненості до зв'язування для очищених інтегринів порівнювались зі зв'язуванням з рецепторами, експресованими на різних клітинних лініях з використанням 125-1 CNTO 95. A375S2 та М21 клітини експресують як V3, так і V5, ΗΤ-29 клітини експресують V5. Для порівняння застосовувались й інші Mab, здатні до зв'язування інтегринів. KD визначали із кривої насичення зв'язування у кожному випадку з використанням множинних реплік множини лотів антитіл. На пластинках, покритих V3, середня KD складала -10 2,1±1,33x10 М; і середня abciximab KD дорівню-10 вала 2,5±1,46x10 М. Середня KD CNTO 95 на -11 V5 складала 2,5±1,04x10 Μ. Abciximab не виявляло ані зв'язування ані залежності від дози на пластинках, покритих V5. Як показано на Фіг.4 дозування CNTO 95 інгібувало ріст пухлин меланоми людини у безтимусних мишей. На 26 добу CNTO 95 інгібувало ріст пухлини приблизно на 80%, у порівнянні з пухлинами від тварин, що лікувались контрольними засобами. У цій моделі CNTO 95 не взаємодіє з ангіогенними судинами хазяїна, оскільки не зв'язує інтегрини миші, і можна припустити, що сама блокада людських експресованих пухлинами інтегринів може інгібувати ріст пухлин у мишей, незалежно від ангіогенних ефектів. Для досліджень на щурах у фірми Harlan були придбані самиці безтимусних щурів віком 6-7 тижнів. Двадцять щурів були піддані інокуляції підшкі6 рно клітинами A372.S2 (3x10 ) в області боку (доба 1). На 4 добу щури були довільно розділені на 2 групи. Одній групі вводили внутрішньовенну ін'єкцію CNTO 95 (10 мг/кг у PBS), тоді як друга група одержала погоджену за ізотипом контрольну IgG (10 мг/кг). Після цього дозування було продовжено потижнево до 46 доби (загалом, 6 доз). Вимірювання пухлин проводилось за допомогою кронциркуля два рази на тиждень, і об'єми пухлин обчислювались за формулою (довжина x ширина2)/2. Вагу тіла також записували кожен тиждень. У щурів, CNTO 95 здатне блокувати як ангіогенні інтегрини щурів, так і людські експресовані пухлинними клітинами інтегрини. Потижневе лікування безтимусних щурів з пухлинами CNTO 95 при 10 мг/кг знижувало ріст пухлин у порівнянні з погодженим за ізотипом людським IgG контрольним Mab (Фіг.5). На 46 добу лікування CNTO 95 дало значне зниження кінцевого розміру пухлини у порівнянні з контрольними безтимусними щурами (р=0,0007). Як резюме, CNTO 95 є цілком людським Mab, котре зв'язує члени альфа V сімейства інтегринів з унікальною специфічністю, авідитетом та активністю, як продемонстровано за допомогою множинних функціональних аналізів, котрі показали, що воно нейтралізує біологічні ефекти інтегринових рецепторів альфа Vбета3 та альфа Vбета5 in vitro та in vivo. CNTO 95 інгібувало злипання, міграцію, 94388 42 проліферацію та інвазію як пухлинних, так і ендотеліальних клітин in vitro і продемонструвало, що зв'язування та блокування множинних альфа V інтегринових рецепторів було більш ефективним, ніж блокування одного окремого інтегрину. Крім того, CNTO 95 інгібувало ангіогенез та ріст пухлин in vivo. Ріст пухлин меланоми людини був суттєво знижений шляхом блокади інтегринів пухлинних клітин у мишачій моделі або комбінованої блокади пухлинних клітин та ангіогенних інтегринів хазяїна у моделі на щурах, що висвітлює потенційну важливість кон'югування множинних клітинних мішеней для забезпечення протипухлинної ефективності. Результати in vitro моделей демонструють, що CNTO 95 має значні антиангіогенні властивості, інгібуючи злипання ендотеліальних клітин, проліферацію, міграцію та капілярне проростання. Крім того, CNTO 95 блокувало ангіогенез, стимульований як bFGF, так і М21 клітинами меланоми у моделі Matngel на щурах і bFGF у моделі ангіогенезу на приматах. CNTO 95 виявило значні антиангіогенні ефекти як у моделі на гризунах, так і новій моделі на нелюдських приматах у мавп cytomulgus. На додаток до блокування інтегринів на ангіогенному ендотелії здатність інгібувати інтегринову функцію на самих пухлинних клітинах знижувала ріст пухлин. Кількість альфа V інтегринів, як можна припустити, відіграє критичну роль у біології пухлинних клітин. У мишачій моделі ксенотрансплантата, де CNTO 95 не піддається перехресній реакції з інтегринами хазяїна, обробка CNTO 95 суттєво інгібувала ріст v3/5-позитивних пухлин меланоми. Однією із найбільш важливих особливостей CNTO 95 є його повна людська природа. Оскільки воно є цілком людським, CNTO 95 з меншою вірогідністю може спричинювати імунні реакції у пацієнтів. Крім того, оскільки CNTO 95 здатне зв'язувати не лише альфа Vбета3 та альфа Vбета5, але й також інші альфа V інтегрини, такі як альфа Vбета 6 та альфа Vбета1, воно має потенціал інгібувати множину опосередкованих інтегрином подій. Приклад 2 Одержання кон'югатів CNTO 95 - маутансин Кон'югати антитіла тіольованих маутансинів одержували для подальшого біологічного випробування, починаючи з використання біфункціональних лінкерів, як описано. Антитіло CNTO 95 постачалось фірмою Centocor для кон'югації. CNTO 95 постачалось при приблизно 20 мг/мл (загалом 260 мг). Дане антитіло піддавали діалізу у Буфері А (50 мМ Крі, 50 мМ NaCl, 2 мМ EDTA рН 6,5), потім доводили до 8 мг/мл у 95% Буфері А, 5% ЕТОН. Антитіло модифікували 6,5 кратним мольним надлишком SPP для введення лінкеру з метою кон'югації ліків, з утворенням CNTO 95-SS-Py, де S-py є 2меркаптопіридином. Залишковий SPP вилучали шляхом G25 гель-фільтруючої хроматографії. Відношення лінкеру до Аb складало 4,7. Ab-SS-Py кон'югат модифікували 1,7 кратним мольним надлишком DM1 (Мол. вага (MW)=737,5 г/моль) до лінкеру, використовуючи концентрацію антитіла 43 3,2 мл у 97% Буфері А, 3% диметилацетамід. Потім кон'югат піддавали повторному хроматографуванню на G25, використовуючи PBS, рН 6,5, як буфер. Результуючий кон'югат містив 3,2 моля DM1 на моль CNTO-95: [Аb]=2,59 мг/мл, [DM1]=38,3 мкг/мл. Обчислення базувались на даних оптичної густини при 252 та 280 нм фільтрованого матеріалу та з використанням коефіцієн-1 -1 тів згасання: Аb=224,000 М см при 280 нм, -1 -1 -1 -1 DM1=5700 М см при 280 нм, Аb=82,880 М см -1 -1 при 252 нм і DM1=26,790 М см при 252 нм. Даний продукт аналізували з використанням SDS-PAGE (додецилсульфат натріюелектрофорез у поліакриламідному гелі), SECвисокопродуктивної рідинної хроматографії та за спорідненістю до зв'язування до альфа Vбета3 та альфа Vбета5 протеїну з використанням методу ELISA (твердофазовий імуноферментний аналіз). За методом PAGE даний продукт являв собою, головним чином, смугу близько 160 кД з також видимою більш слабкою низькомолекулярноваговою смугою. За даними аналізу методом SECвисокопродуктивної рідинної хроматографії, фракція кон'югату, що елюював мономер (18,8'), складала 96%, і приблизно 4% кон'югату елюювалось як речовина з більшою молекулярною вагою (16,2'). Спорідненість до зв'язування визначалась із графіка залежності оптичної густини від концентрації, що дало позірну Kd 3,0 е-11 Μ для CNTO 95 і Kd 3,5 е-11 Μ для кон'югату на альфа Vбета5. Обидві речовини дали позірну Kd приблизно 3,0 е9 на альфа Vбета3. Інші партії CNTO 95-SPP-DM1 та CNTO 95, що піддавались кон'югації з DM4 та стороннім антитілом, котре націлене на нелюдський антиген, F105, одержували в аналогічний спосіб з використанням біфункціональних лінкерів, як показано на Фіг.2 і як окреслено на Фіг.3. Характеристики цих препаратів подані нижче: Одержання CNTO95-SPP-DM1 (CNTO 364) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM1 з SPP лінкером у наступний спосіб: 270,6 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 3,7 мг DM1, результуючі 98 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°С до 8°С при 2,74 мг/мл у PBS при рН 6,5. Концентрація DM1, визначена за оптичною густиною, складала 37,6 мкг/мл. Таким чином, співвідношення DM1 на моль CNTO 95 складало 2,98 (1 мкг DM1 еквівалентний 68,9 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 96,3% мономером з 0,59% вільних ліків. Одержання CNTO95-SPP-DM1 (CNTO 364) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM1 з SPP лінкером у наступний спосіб: 104 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 1,82 мг DM1, результуючі 26 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°С до 8°С при 3,65 мг/мл кон'югованого антитіла CNTO95-SPP-DM1 у PBS при рН 6,5. Концентрація DM1, визначена за оптичною густиною, складала 70,07 мкг/мл. Таким чином, даний препарат містив співвідношення 3,80 моль DM1 на моль CNTO 95 94388 44 (1 мкг DM1 еквівалентний 57,2 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 93,4% мономером з 1,61% вільних ліків. Одержання CNTO95-SPP-DM1 (CNTO 364) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM1 з SPP лінкером у наступний спосіб: 228 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 4,13 мг DM1, результуючі 102 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°С до 8°С при 2,24 мг/мл кон'югованого CNTO95-SPPDM1 антитіла у PBS при рН 6,5. Концентрація DM1, визначена за оптичною густиною, складала 40,53 мкг/мл. Таким чином, даний препарат містить співвідношення 3,93 моль DM1 на моль CNTO 95 (1 мкг DM1 еквівалентний 55,3 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 94,7% мономером з 1,00% вільних ліків. Одержання CNTO95-SSNPB-DM4 (CNTO 365) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SSNPB лінкером у наступний спосіб: 121 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 2,18 мг DM4, результуючі 34 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 3,25 мг/мл у PBS при рН 6,5. Концентрація DM4, визначена за оптичною густиною, складала 64,11 мкг/мл. Таким чином, співвідношення DM4 на моль антитіла складає 3,57 (1 мкг DM4 еквівалентний 55,6 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 95,4% мономером з 3,23% вільних ліків. Одержання CNTO95-SSNPP-DM4 (CNTO 366) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SSNPP лінкером у наступний спосіб: 101 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 1,45 мг DM4, результуючі 30мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 3,07 мг/мл антитіла у PBS при рН 6,5. Концентрація DM4, визначена за оптичною густиною, складала 48,39 мкг/мл. Таким чином, даний препарат мав 2,95 моля DM4 на моль CNTO 95 (1 мкг DM4 еквівалентний 69,5 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроіматографії, даний препарат був на 85,9% мономером з 1,18% вільних ліків. Одержання CNTQ95-SPDB-DM4 CCNTO 365) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SPDB лінкером у наступний спосіб: 228,5 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 4,37 мг DM4, результуючі 104,5 мл кон'югагу зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 2,19 мг/мл кон'югованого антитіла CNTO-SPDB-DM4 у PBS при рН 6,5. Концентрація DM4, визначена за оптичною густиною, складала 41,84 мкг/мл. Таким чином, даний препарат мав 3,92 моля DM4 на моль CNTO 95 (1 мкг DM4 еквівалентний 52,3 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопро 45 дуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 93,6% мономером з 0,55% вільних ліків. Одержання CNTO95-SPDB-DM4 (CNTO 365) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SPDB лінкером у наступний спосіб: 309 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 5,4 мг DM4, результуючі 130,7 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 2,36 мг/мл кон'югованого антитіла CNTO-SPDB-DM4 у PBS при рН 6,5. Концентрація DM4, визначена за оптичною густиною, складала 41,2 мкг/мл. Таким чином, даний препарат мав 3,57 моля DM4 на моль CNTO 95 (1 мкг DM4 еквівалентний 57,5 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 93,8% мономером з 0,40% вільних ліків. Одержання CNTO95-SPP-DM1 (CNTO 364) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM1 з SPP лінкером у наступний спосіб: 270,6 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 3,7 мг DM1, результуючий кон'югат зберігався при температурі від 2°C до 8°C при 2,74 мг/мл у PBS при рН 6,5. Концентрація DM1, визначена за оптичною густиною, складала 37,6 мкг/мл. Таким чином, даний препарат містить співвідношення 2,98 моль DM1 на моль CNTO 95 (1 мкг DM1 еквівалентний 68,9 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 96,3% мономером з 0,59% вільних ліків. Одержання CNTO95-SPP-DM1 (CNTO 364) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM1 з SPP лінкером у наступний спосіб: 245 мг F105 піддавалось кон'югації з 4,28 мг DM1, результуючий кон'югат у кількості 91,5 мл зберігався при температурі від 2°C до 8°C при 2,68 мг/мл кон'югованого F105SPP-DM1 антитіла у PBS при рН 6,5. Концентрація DM1, визначена за оптичною густиною, складала 46,76 мкг/мл. Таким чином, даний препарат містить співвідношення 3,79 моль DM1 на моль F105 (1 мкг DM1 еквівалентний 57,3 мкг кон'югованого F105 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 90,3% мономером з 2,44% вільних ліків. Одержання CNTO95-SPP-DM4 (CNTO 366) Моноклональне антитіло CNTO 95 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SPP лінкером у наступний спосіб: 76,7 мг CNTO 95 піддавалось кон'югації з 1,10 мг DM4, результуючі 35 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 2,19 мг/мл кон'югованого CNTO95-SPPDM4 антитіла у PBS при рН 6,5. Концентрація DM1, визначена за оптичною густиною, складала 31,5 мкг/мл. Таким чином, даний препарат містить співвідношення 2,96 моль DM4 на моль CNTO 95 (1 мкг DM4 еквівалентний 69,4 мкг кон'югованого CNTO 95 антитіла). За даними, отриманими мето 94388 46 дом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 97,3% мономером з 1,14% вільних ліків. Одержання F105-SSNPB-DM4 Моноклональне антитіло F105 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SSNPB лінкером у наступний спосіб: 106 мг F105 піддавалось кон'югації з 1,84 мг DM4, результуючі 25 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 3,85 мг/мл у PBS при рН 6,5. Концентрація DM1, визначена за оптичною густиною, складала 73,45 мкг/мл. Таким чином, співвідношення DM4 на моль антитіла складала 3,57 (1 мкг DM4 еквівалентний 57,5 мкг кон'югованого F105 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 85,1% мономером з 1,92% вільних ліків. Одержання F105-SSNPB-DM4 Моноклональне антитіло F105 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SSNPB лінкером у наступний спосіб: 106 мг F105 піддавалось кон'югації з 1,84 мг DM4, результуючі 30 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 3,46 мг/мл у PBS при рН 6,5. Концентрація DM4, визначена за оптичною густиною, складала 57,93 мкг/мл. Таким чином, співвідношення DM4 на моль антитіла складає 3,32 (1 мкг DM4 еквівалентний 65,4 мкг кон'югованого F105 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 88,8% мономером з 1,85% вільних ліків. Одержання F105-SSNPP-DM4 Моноклональне антитіло F105 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SSNPP лінкером у наступний спосіб: 105 мг F105 піддавалось кон'югації з 1,76 мг DM4, результуючі 28 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 3,41 мг/мл у PBS при рН 6,5. Концентрація DM4, визначена за оптичною густиною, складала 62,87 мкг/мл. Таким чином, даний препарат містить 3,45 моль DM4 на моль F105 (1 мкг DM4 еквівалентний 59,4 мкг кон'югованого F105 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 85,9% мономером з 3,75% вільних ліків. Одержання F105-SPDB-DM4 Моноклональне антитіло F105 піддавалось кон'югації з маутансиноїдом DM4 з SPDB лінкером у наступний спосіб: 230,5 мг F105 піддавалось кон'югації з 4,12 мг DM4, результуючі 104,5 мл кон'югату зберігались при температурі від 2°C до 8°C при 2,21 мг/мл у PBS при рН 6,5. Концентрація DM4, визначена за оптичною густиною, складала 39,41 мкг/мл. Таким чином, даний препарат містив 3,66 моля DM4 на моль F105 (1 мкг DM4 еквівалентний 56,0 мкг кон'югованого F105 антитіла). За даними, отриманими методом високопродуктивної рідинної хроматографії, даний препарат був на 89,2% мономером з 0,65% вільних ліків. Загалом, для подальшого аналізу були синтезовані наступні речовини (Таблиця 6). 47 94388 48 Таблиця 6 Сполука Ліки CNTO364 DM1 CNTO365 DM4 CNTO366 DM4 F105-DM1 DM1 F105-DM4 DM4 F105-DM4 DM4 Реагент, що активує маутансинол N-метил, N-(1-дитіометил-3-карбоксипропіл)аланін N-метил, N-(1-дитіометил-2-метил-4карбокси-n-бутил)аланін N-метил, N-(1-дитіометил-2-метил-4карбокси-n-бутил)аланін N-метил, N-(1-дитіометил-3-карбоксипропіл)аланін N-метил, N-(1-дитіометил-2-метил-4карбокси-n-бутил)аланін N-метил, N-(1-дитіометил-2-метил-4карбокси-n-бутил)аланін Приклад 3 Зв'язування кон'югату CNTO 95-маутанзин з пухлинними клітинами Випробувалась здатність та спорідненість кон'югату СNTО95-маутансиноїд до зв'язування з живими клітинами. Матеріали та способи. CNTO 95, Centocor, лот №95-VF30A03-1, 20 мг/мл у PBS; CNTO 364 (CNTO 95-SPP-DM1), Immunogen. лот №1806-164, 37,6 мг/мл DM1, 2,74 мг/мл кон'югованого антитіла, рівень ендотоксину