Суміш жирних кислот та її застосування

Реферат: Винахід належить до сумішей олій та жирних кислот для одержання біодизельного пального, що містять більш ніж 50 % середньоланцюгових жирних кислот чи їх алкільних естерів та мають низькі температури плавлення. UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цій заявці заявлено пріоритет попередньої патентної США № 60/817,558, під навою "Суміші жирних кислот та їх застосування", поданої 28 червня 2006 p., що включена до цієї заявки повністю, включаючи фігури. Галузь винаходу Забезпечено олії; суміші олій чи жирних кислот; застосування таких сумішей, включаючи застосування як пального; та способи одержання сумішей олій чи сумішей жирних кислот. Передумови створення винаходу Наступний опис передумов створення винаходу забезпечено тільки для розуміння винаходу та не призначено для опису рівня техніки та не являє собою рівень техніки для даного винаходу. Рослинні олії застосовували як альтернативні види пального сировини для промисловості при виробництві біологічного пального. Загалом, олії, що використовують, екстрагують з рослин, що у великій кількості зростають у конкретному регіоні. Тому, соєву олію розглядають як джерело біодизельного пального в Сполучених Штатах, тоді як рапсову - в Європейських країнах; а країни з тропічним кліматом використовують кокосову чи пальмову олію (Knothe et al., on-line за адресою wvwv.biodiesel.orq/resouroes/reportsdatabase/reports/gen/19961201 gen162.pdf). Композиція тригліцеридів, що стимулюють олію з VS-320, мутанта Cuphea viscossima, описана G eller et al. (Transactions of the American Society of Agricultural Engineers 42:859-862, 1999). "Стимульований аналог олії VS-320", що описано у Geller, має склад тригліцеридів 4,2% С6:0; 40,20% С8:0; 36,90% С10:0; 4,80% С12:0; 6,80% С14:0; 3,33% С16:0; 0,00 % С18:0; 1,37% С18;І; 2,05% С18:2; та 0,00% С18:3 (див. Таблицю 1). Geller et al., (1999) дійшли до висновку, що "ця модель передбачає, що зростання вмісту С8:0 рослинних олій поряд із наступним зменшенням середньо- та довго-ланцюгових тригліцеридів може призвести до більш ефективного, більш потужного альтернативного дизельного палива" Stournks, et at, (JACOS, 1995, 72:433-437) описує характеристики різноманітних олій як пального та стверджує "при ±3°С повторюваності визначень температур застигання, більшість з доданих компонентів не має значного впливу на температуру застигання -12°С базового пального. Основними винятками є насичені жирні спирти з С12 та довшими алкільними ланцюгами, до суттєво підвищує температуру застигання; незначний негативний вплив також спостерігали для деяких довголанцюгових естерів. Необхідно відмітити, наявність подвійного зв'язку в усіх похідних олеатів сильно покращує їх властивості текучості на холоді порівняно із відповідними стеаратами" та „коли до уваги приймають якість запалення та властивості текучості на холоді, найбільшу продуктивність мають третинні диметилові аміни; проте, третинні аміди також є перспективними з точки зору їх одержання з гліцеридів природних рослинних олій, що є набагато простішим, ніж з гліцеридів амінів, як було показано в останніх дослідженнях." Mittelbach (Bioresource Technology, 1996, 56:7-11) обговорює характеристики та контроль якості дизельного пального, одержаного з рослинних олій та заявляє "один параметр, що не був ще включений до Австрійських стандартів RME, проте може бути необхідний при визначенні загальних стандартів для метилових естерів жирних кислот, являє собою йодне число, що описує вміст ненасичених жирних кислот та належить тільки від джерела природної олії. У Німеччині визначено число 115, що відповідає рапсовій олії, але виключає різні види олій, таких, як соняшникова та соєва олія. Обмеження ненасичених жирних кислот може бути необхідним, через те, що нагрівання вищих ненасичених жирних кислот призводить до полімеризації гліцеридів. Це може призвести до утворення осадів чи погіршення мастил. Цей ефект підвищує кількість подвійних зв'язків у ланцюгу жирних кислот. Тому, краще обмежувати вміст вищих ненасичених жирних кислот, таких, як лінолева кислота, ніж обмежувати ступінь ненасичення йодним числом." Graboski (Prog. Energy Combustion Sci., 1998, 24:125-164) обговорює "статус дизельного пального, одержаного з жирів та олій, з точки зору властивостей пального, параметрів двигуна та емісії" та стверджує „зменшення довжини ланцюгу та/або збільшення розгалуження ланцюгів покращить властивості текучості на холоді пального. Довжина ланцюгу та ступінь розгалуження можуть бути змінені як для рослинного, так і для генетичного підходів, а також шляхом хімічної обробки біопального для розщеплення подвійних зв'язків чи для формування розгалужених ізомерів. Дуже невелика кількість практичних досліджень здійснена у галузі хімічної переробки. Властивості текучості на холоді біодизельного пального є, без сумніву, важливими для досліджень." Goodrumet al., (Bioresource Technology, 1996, 56:55-60) обговорює "фізичні властивості низькомолекулярних тригліцеридів для розвитку моделей біодизельного пального" та заявляє, що олії, що містять значні фракції низькомолекулярних тригліцеридів можуть бути придатними 1 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для безпосереднього використання як наповнювачі пального. Фактично, сировина від Cuphea (Graham, 1989), містить олії, що головним чином складаються з таких тригліцеридів (особливо трикаприліну та трикапріну). Сучасні ДНК трансферні технології можуть також підсилювати трансфер генів, що контролюють синтез низькомолекулярних тригліцеридів з видів, таких, як Cuphea в інші більш відомі олійні культури. Склади олій можуть бути генетично модифіковані для одержання оптимальних бажаних властивостей біопального." Knothe (Fuel Processing Technology, 2005, 86:1059-1070) заявляє "насичені жирні сполуки мають значно підвищені температури плавлення, ніж ненасичені жирні кислоти (Таблиця 1) та у суміші вони кристалізуються при більш високій температурі, ніж ненасичені. Ці біодизельні палива, одержані з жирів чи олій, зі значною кількістю насичених жирних сполук проявлятимуть вищі температури помутніння та температури застигання." Kinney et al, (Fuel Processing Technology,2005, 86:1137-1147) обговорює питання стосовно модифікації соєвої олії для підвищеної продуктивності біодизельного пального. Ця стаття посилається на суміші, описані у Geller et al., 1999 та заявляє "оскільки температура плавлення біопального, одержаного з цих коротколанцюгових жирних кислот є високою, то додаткові стадії фракціювання будуть потрібні для покращення властивості текучості на холоді." Kinney et at. також заявляє "зміни профілю жирних кислот, що підвищують вміст насичених жирних кислот зі значною стійкістю до окиснення, але погіршують текучість у холодному стані ... наявність подвійних зв'язків у жирних кислотах знизить цетанове число; звідси, стратегія до підвищення вмісту насиченої фракції жирів у рослинній олії покращить якість запалення одержаного біопального, проте є ризиком для властивості текучості на холоді з точки зору стійкості до окиснення." У патенті США № 4,364,743 ("патент 743") описано "синтетичне пальне естерів жирних кислот, що забезпечує нове джерело енергії при самозапалення чи у комбінації з іншими відомими видами пального," та що "естери, переважно, одержують реакцією трансетерифікації з використанням різних олій, таких, як соєва, пальмова, сафлорова, арахісова, кукурудзяна, бавовняна, лляна, акацієва, тунгова, кокосова, касторова, периллова, рапсова, соняшникова, свинячий жир, рибні жири, ворвань, ліпіди морських та сухопутних тварин та ліпіди від рослинних джерел." У патенті США № 5,389,113 ("патент '113") описано "суміші, що містять а) 58-95% від маси, щонайменше, одного естера з йодним числом від 50-150, одержаних з жирних кислот, що містять 12-22 атомів вуглецю та нижчих аліфатичних спиртів, що містять 1-4 атомів вуглецю, b) 4-40% від маси, щонайменше, одного естера жирних кислот, що містять від 6 до 14 атомів вуглецю та нижчих аліфатичних естерів, що містять 1-4 атомів вуглецю та с) 0,1-2% від маси, щонайменше, одного полімерного естеру." У публікації патентної заявки США № 2006026963 описано "конструкти нуклеїнових кислот та способи продукування змінених композицій олії з насіння" та заявляє "спосіб підвищення вмісту олеїнових кислот та зменшення вмісту насичених жирних кислот у насінні рослин, що включає і FAD2 з рослини, трансформованої першою гетерологічною послідовністю FAD2 є, щонайменше, частково зменшеною порівняно із кількістю генної супресії FAD2 у рослинній клітині, що містить подібну генну основу та другу гетерологічну FAD2 послідовність, де друга гетерологічна РАО2послідовність складається з більш ендогенної FAD2 послідовності, ніж перша гетерологічна FAD2 послідовність; іі) експресію гетерологічної FATB послідовності, здатної, щонайменше, частково зменшувати генну експресію FATB у рослинній клітині відносно FATB у рослинній клітині з аналогічною генною основою, але гетерологічної FATB послідовності; ііі) вирощування рослини, що містить геном з першою гетерологічною FAD2 послідовністю та гетерологічною FATB послідовністю; та iv) культивування рослини, що продукує насіння зі зменшеним вмістом насичених жирних кислот порівняно із насінням рослини, що має подібну генну основу, але в якого відсутні перша гетерологічна FAD2 послідовність та гетерологічна FATB послідовність." Стислий опис винаходу Заявник визначив, що суміші рослинних олій можуть бути вибрані таким чином, що суміш проявляє бажані властивості для застосування як альтернативного виду пального чи як сировини для продукування біопального. Наприклад, такі суміші можуть бути вибрані таким чином, що при застосуванні пального у холодному кліматі, суміш замерзає з меншою ймовірністю. Суміші також можуть бути вибрані таким чином, щоб суміш була стійкою при більш високих температурах. Додатково, суміші можуть бути вибрані для одержання бажаних запальних властивостей при застосуванні пального у транспортному засобі. Деякі конкретні приклади ознак сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом описано нижче. Зрозуміло, що суміші олій чи жирних кислот в обсязі винаходу можуть містити будь-яку комбінацію ознак, описаних у втіленнях, наведених нижче. Зокрема, винахідники визначили, що певні суміші 2 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жирних кислот мають неочікувані корисні властивості для продукування біопального. Наприклад, винахідники знайшли, що конкретний баланс середньоланцюгових жирних кислот та мононенасичених жирних кислот може мати неочікувані корисні властивості, наприклад щодо експлуатації у холодну погоду. У певних втіленнях сумішей жирних кислот, що мають збалансовані кількості середньоланцюгових жирних кислот (наприклад С8, С10 та С12) та мононенасичених жирних кислот (переважно, С16:1 та С18:1), винахідники знайшли, що наявність С16:0 та С18:0 може мати особливо небажану дію на властивості текучості на холоді та тому зменшені рівні С16:0 та С18:0 у біодизельному пальному можуть бути корисними для експлуатації у холодну погоду; та що C14:0, C18:2, C18:3, C20, C22 та С24 можуть також несприятливо впливати на властивості текучості на холоді; тому, зменшення вмісту цих жирних кислот у біодизельному пальному може також бути корисним. Термін "олія", як вживається у цій заявці, відноситься до речовини, що складається, головним чином, з тригліцеридів жирних кислот. Рослинні олії можуть бути екстраговані з різних частин рослини, включаючи насіння, плоди чи листя рослини. Це, зазвичай, рідина при кімнатній температурі. У деяких втіленнях олії одержують з каноли, рапсу, пальми, пальмових ядер, кокосів, тукума, соняшника, сафлори, оливи, макадамії, бабассу, кастору, арахісу, бавовни, льону, манаки та ятрофи. У додаткових втіленнях, олії можуть бути одержані з генетично модифікованих рослин. Тригліцериди є основними є основними складовими рослинних олій та тваринних жирів. Тригліцериди можуть бути твердими чи рідкими при кімнатній температурі. Тригілцерид, що також має назву тригліцерину (TAG), є хімічною сполукою, що сформована з однієї молекули гліцерину та трьох жирних кислот. Гліцерин - тричі гідрований спирт (що містить три гідроксильні групи), що можуть бути скомбіновані з аж до трьох жирних кислот з утворенням моногліцеридів, дигліцеридів, та тригліцеридів, при сполученні з однією, двома чи трьома жирними кислотами, відповідно. Моногліцериди, дигліцериди, та тригліцериди класифікують як естери, що сполуками, утвореними шляхом реакції між кислотами та спиртами з вивільненням води як бічного продукту. Жирні кислоти можуть бути сполучені з будь-якою з трьох гідроксильних груп з утворенням естерного зв'язку та одержанням широкого різноманіття сполук. Додатково, жирні кислоти, що мають різну довжину, можуть сполучатися з окремою молекулою гліцерину. Таким чином, утворений в результаті дигіцерид чи тригліцерид можуть містити різні жирні кислоти в одній молекулі тригліцериду. Жирні кислоти складаються з вуглецю, водню та кисню, розташованих як вуглецевий ланцюговий скелет, на одному кінці якого знаходиться карбоксильна група. Жирними кислотами можуть бути насичені жирні кислоти (SFAs) без подвійних зв'язків між атомами вуглецю, мононенасичені (MUFAs) з одним подвійним зв'язком між атомами вуглецю, чи поліненасичені жирні кислоти (PUFAs) з більш, ніж одним подвійним зв'язком між атомами вуглецю. Кількість атомів вуглецю у жирнокислотному ланцюгу та кількість подвійних зв'язків між атомами вуглецю загалом виражають як "кількість атомів вуглецю: кількість подвійних зв'язків між атомами вуглецю." Наприклад, олеїнова кислота, що має 18 атомів вуглецю та один подвійний зв'язок між атомами вуглецю може бути виражена як "С18:1" чи "18:1." Термін "середньоланцюгові жирні кислоти", як вживається у цій заявці, відноситься до жирних кислот, що містять 6-14 атомів вуглецю, переважно, 8-12 атомів вуглецю. Термін "довголанцюгові жирні кислоти", як вживається у цій заявці, відноситься до жирних кислот, що містять більш, ніж 14 атомів вуглецю, чи більш, ніж 16 атомів вуглецю, або навіть більш, ніж 18 атомів вуглецю. В одному аспекті забезпечені суміші жирних кислот. У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, лауриновій кислоті відповідає 6% - 20% суміші; більш переважно, 6% -10% суміші. У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають від 20% and 40% суміші; чи від 20% до 30% суміші; чи від 30% до 40% суміші; чи від 25% до 35% суміші. В інших втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають від 60% до 85% суміші; чи від 60% до 70% суміші; чи від 70% до 85% суміші; чи від 65% до 75% суміші. Ще в одних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають від 40% до 60% суміші; чи від 40% до 50% суміші; чи від 50% до 60% суміші; чи від 45% до 55% суміші. У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, мононенасичені жирних кислоти складають від 5% до 95% суміші; переважно, мононенасичені жирні кислоти складають більш, ніж 10%, чи більш, ніж 15%; чи більш, ніж 20%; чи більш, ніж 25%; чи більш, ніж 30%; чи більш, ніж 35%; чи більш, ніж 40%; чи більш, ніж 45; чи 3 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більш, ніж 50%; чи більш, ніж 60%; чи більш, ніж 65%; чи більш, ніж 70%; чи більш, ніж 80%; чи більш, ніж 85% суміші. У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, олеїнова кислота (С18:1) та пальмітолеїнова кислота (16:1) разом складають від 20% до 85% суміші; чи від 20% до 40% суміші; чи від 20% до 30% суміші; чи від 30% до 40% суміші; чи від 25% до 35% суміші; чи від 40% до 60% суміші; чи від 35% до 55% суміші; чи від 55% до 65% суміші; чи від 60% до 85% суміші; чи від 60% до 70% суміші; чи від 70% до 85% суміші; чи від 65% до 75% суміші. У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), лауринова кислота (С12:0), олеїнова кислота (С18:1) та пальмітолеїнова кислота (16:1) разом складають більш, ніж 50% суміші; чи більш, ніж 55% суміші; чи більш, ніж 60% суміші; чи більш, ніж 65% суміші; чи більш, ніж 70% суміші; чи більш, ніж 75% суміші; чи більш, ніж 80% суміші; чи більш, ніж 85% суміші; чи більш, ніж 90% суміші. У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, стеаринова (18:0) та пальмітинова кислота (16:0) разом складають менш, ніж 25% суміші; більш переважно, менш, ніж 15% суміші; більш переважно, менш, ніж 10% суміші; більш переважно, менш, ніж 8% суміші; більш переважно, менш, ніж 6% суміші; більш переважно, менш, ніж 5% суміші; більш переважно, менш, ніж 4% суміші; більш переважно, менш, ніж 3% суміші; більш переважно, менш, ніж 2% суміші; чи менш, ніж 1% суміші; чи менш, ніж 0,5% суміші; чи, у деяких переважних втіленнях, суміш жирних кислот є істотно вільною від стеаринової (18:0) та пальмітинової кислоти (16:0). У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, міристиринова кислота (14:0) відповідає менш, ніж 25% суміші; більш переважно, менш, ніж 15% суміші; більш переважно, менш, ніж 10% суміші; більш переважно, менш, ніж 8% суміші; більш переважно, менш, ніж 6% суміші; більш переважно, менш, ніж 5% суміші; більш переважно, менш, ніж 4% суміші; більш переважно, менш, ніж 3% суміші; більш переважно, менш, ніж 2% суміші; чи менш, ніж 1% суміші; чи менш, ніж 0.5% суміші; чи, у деяких переважних втіленнях, суміш жирних кислот є істотно вільною від міристиринової кислоти (14:0). У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, лінолеїнова кислота (18:2) та ліноленова кислота (18:3) разом складають менш, ніж 25% суміші; більш переважно, менш, ніж 15% суміші; більш переважно, менш, ніж 10% суміші; більш переважно, менш, ніж 8% суміші; більш переважно, менш, ніж 6% суміші; більш переважно, менш, ніж 5% суміші; більш переважно, менш, ніж 4% суміші; більш переважно, менш, ніж 3% суміші; більш переважно, менш, ніж 2% суміші; чи менш, ніж 1% суміші; чи менш, ніж 0,5% суміші; чи, у деяких переважних втіленнях, суміш жирних кислот є істотно вільною від лінолеїнової кислоти (18:2) та ліноленової кислоти (18:3). У деяких переважних втіленнях сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці, арахідонова кислота (С20:0), бегенова кислота (С22:0) та лігноцеринова кислота (С24:0) разом складають менш, ніж 25 % суміші; більш переважно, менш, ніж 15% суміші; більш переважно, менш, ніж 10% суміші; більш переважно, менш, ніж 8% суміші; більш переважно, менш, ніж 6% суміші; більш переважно, менш, ніж 5% суміші; більш переважно, менш, ніж 4% суміші; більш переважно, менш, ніж 3% суміші; більш переважно, менш, ніж 2% суміші; чи менш, ніж 1% суміші; чи менш, ніж 0,5% суміші; чи, у деяких переважних втіленнях, суміш жирних кислот є істотно вільною від арахідонової кислоти (С20:0), бегенової кислоти (С22:0) та лігноцеринової кислоти (С24:0). У деяких аспектах, забезпечується суміш жирних кислот, де насичені жирні кислоти, що мають 812 атомів вуглецю, та мононенасичені жирні кислоти, що мають 12-18 атомів вуглецю, складають від 80% до 100% суміші, каприлова кислота (С8:0) та капринова кислота (С10:0) складають від 5% до 80% суміші, лауринова кислота відповідає менш, ніж 20% суміші, та поліненасичені жирні кислоти та насичені жирні кислоти, що мають більш, ніж 12 атомів вуглецю, разом складають менш, ніж 20% суміші. У деяких переважних втіленнях вищезазначеної суміші жирних кислот каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають 20%-40% суміші; переважно, лауринова кислота (C12:0) містить 6%-20% суміші, більш переважно, лауринова кислота (С12:0) містить 6%-10% суміші. У деяких переважних втіленнях суміші, олеїнова кислота (С18:1) та пальмітолеїнова кислота (16:1) разом складають 50%-85% суміші. У деяких аспектах, забезпечується суміш жирних кислот, де насичені жирні кислоти, що мають 8-12 атомів вуглецю, та мононенасичені жирні кислоти, що мають 12-18 атомів вуглецю складають від 80% до 100% суміші, каприлова кислота (С8:0) та капринова кислота (С10:0) складають від 5% до 80% суміші, лауринова кислота відповідає менш, ніж 20% суміші, та поліненасичені жирні кислоти та насичені жирні кислоти, що мають більш, ніж 12 атомів 4 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вуглецю, разом складають менш, ніж 20% суміші. У деяких переважних втіленнях вищезазначеної суміші жирних кислот каприлова кислота (С8.0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають 20%-40% суміші; переважно, лауринова кислота (С12:0) містить 6%-20% суміші, більш переважно, лауринова кислота (С12:0) містить 6-10% суміші; та олеїнова кислота (С18:1) та пальмітолеїнова кислота (16:1) разом складають 50%85% суміші. В інших переважних втіленнях вищезазначеної суміші, каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають 60%-85% суміші; переважно, лауринова кислота (C 12:0) містить 6%-20% суміші, більш переважно, лауринова кислота (C 12:0) містить 6 = 10% суміші; та олеїнова кислота (C18:1) та пальмітолеїнова кислота (16:1) разом складають 20%-40% суміші. В одному аспекті, винахід забезпечує суміші двох чи більше олій, де, щонайменше, 50% від маси жирні кислоти є середньоланцюговими жирними кислотами, та де каприлова кислота (С8:0) становить аж до 25% кінцевої суміші та менш, ніж 20% є довголанцюговими жирними кислотами. У пов'язаному аспекті, винахід забезпечує суміші жирних кислот, де, щонайменше, 50% від маси жирні кислоти є середньоланцюговими жирними кислотами, а каприлова кислота (С8:0) становить аж до 25% кінцевої суміші та менш, ніж 20% є довголанцюговими жирними кислотами. В інших втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміші містять, щонайменше, 60% середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 65% середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 70% середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 75% середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 80% середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 85% середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 90% середньоланцюгових жирних кислот, чи, переважно, щонайменше, 95% середньоланцюгових жирних кислот. У конкретних втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміші містять 5-25% каприлової кислоти (С8:0); 10-25% каприлової кислоти (С8:0); 10-20% каприлової кислоти (С8:0); чи 15-25% каприлової кислоти (С8:0). У конкретних втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміші містять 30-60% капринової кислоти (С10:0); 25-55% капринової кислоти (С10:0); 30-50% капринової кислоти (С10:0); чи 40-50% капринової кислоти (С10:0). У конкретних втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміші містять 5-35% лауринової кислоти (С12:0); 10-20% лауринової кислоти (С12:0); 15-25% лауринової кислоти (С12:0); 20-30% лауринової кислоти (С12:0); чи 25-35% лауринової кислоти (С12:0). В інших втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміші містять менш, ніж 15% довголанцюгових жирних кислот, переважно, менш, ніж 10% довголанцюгових жирних кислот, переважно, менш, ніж 7% довголанцюгових жирних кислот, переважно, менш, ніж 5% довголанцюгових жирних кислот, чи, переважно, менш, ніж 3% довголанцюгових жирнихкислот. В інших втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміші містять менш, ніж 15% мононенасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 10% мононенасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 7% мононенасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 5% мононенасичених жирних кислот, чи, переважно, менш, ніж 2% мононенасичених жирних кислот. В інших втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміші містять менш, ніж 10% поліненасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 7% поліненасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 5% поліненасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 3% поліненасичених жирних кислот, чи, переважно, менш, ніж 1 % поліненасичених жирних кислот. У конкретних втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, капронова кислота (6:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від маси суміші; каприлова кислота (8:0) може становити від, приблизно, 5 до, приблизно, 25% від маси суміші; капринова кислота (10:0) може становити від, приблизно, 30 до, приблизно, 60% від маси суміші; лауринова кислота (12:0) може становити від, приблизно, 5 до, приблизно, 30% від маси суміші; міристиринова кислота (14:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від маси суміші; пальмітинова кислота (16:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від маси суміші; пальмітолеїнова кислота (16:1) може становити від 0 до, приблизно, 10% від маси суміші; стеаринова кислота (18:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від маси суміші; олеїнова кислота (18:1) може становити від 0 до, приблизно, 10% від маси суміші; лінолеїнова кислота (18:2) може становити від 0 до, приблизно, 5% від маси суміші; ліноленова кислота (18:3) може становити від 0 до, приблизно, 1% від маси суміші; арахідонова кислота (20:0) може становити від 0 до, приблизно, 3% від маси суміші; бегенова кислота (22:0) може становити від 0 до, приблизно, 3% від маси суміші; 5 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ерукова кислота (22:1 ) може становити від 0 до, приблизно, 5% від маси суміші; та лігноцеринова кислота (24:0) може становити від 0 до, приблизно, 3% від маси суміші. В інших втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, тригліцериди олій чи жирних кислот перетворюють на алькільні естери жирних кислот. У конкретних втіленнях алкільні естери є метиловими естерами, етиловими естерами, пропіловими естерами, ізопропіловими естерами, чи бутиловими естерами, у переважних втіленнях, алкільні естери є метиловими естерами. У певних втіленнях сумішей олій за даним винаходом, олії одержують з рослинних олій чи тваринних жирів. У переважних втіленнях олію вибирають з групи, що складається з канолової, рапсової , пальмової олії, олії пальмових ядер, кокосової, тукумової, соняшникової, сафлорової, Cupheay оливи, макадамової, бабассу, касторової, арахісової, бавовняної, лляної, кохунової та ятрофної олії. У деяких втіленнях сумішей олій за даним винаходом, олії одержують з генетично модифікованої рослини. У конкретних втіленнях, олію одержують з генетично модифікованої рослини, де рослину модифікують з одержанням підвищеної кількості середньоланцюгових жирних кислотах порівняно із природною рослиною. У додаткових втіленнях, одна чи більше олій з природної рослини чи рослин можуть бути змішані з однією чи більше олій, одержаних з генетично модифікованих рослин. В інших втіленнях сумішей олій чи жирних кислот за даним винаходом, суміш олій чи суміш жирних кислот є корисними як пальне для живлення двигунів внутрішнього згорання. В інших втіленнях суміш олій чи суміш жирних кислот є корисними як сировина при одержанні добавок до палив, функціонального пального, знижувана температури замерзання, біодизельного пального, авіаційного пального, комунально-побутового пального, чи замісника керосину. У пов'язаному аспекті, винахід забезпечує алкільні естери жирних кислот, де, щонайменше, 50% алкільних естерів жирних кислот є алкільними естерами середньоланцюгових жирних кислот та менш, ніж 20% є алкільними естерами довголанцюгових жирних кислот. В конкретних втіленнях сумішей алкільних естерів жирних кислот за даним винаходом, такі суміші містять, щонайменше, 60% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 65% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 70% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 75% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 80% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 85% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот, переважно, щонайменше, 90% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот, чи, переважно, щонайменше, 95% алкільних естерів середньоланцюгових жирних кислот. В інших втіленнях сумішей алкільних естерів жирних кислот за даним винаходом, суміші містять менш, ніж 15% алкільних естерів довголанцюгових жирних кислот, переважно, менш, ніж 10% алкільних естерів довголанцюгових жирних кислот, переважно, менш, ніж 7% алкільних естерів довголанцюгових жирних кислот, переважно, менш, ніж 5% алкільних естерів довголанцюгових жирних кислот, чи, переважно, менш, ніж 3% алкільних естерів довголанцюгових жирних кислот. В інших втіленнях сумішей алкільних естерів жирних кислот за даним винаходом, суміші містять менш, ніж 15% алкільних естерів мононенасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 10% алкільних естерів мононенасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 7% алкільних естерів мононенасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 5% алкільних естерів мононенасичених жирних кислот, чи, переважно, менш, ніж 2% алкільних естерів мононенасичених жирних кислот. В інших втіленнях сумішей алкільних естерів жирних кислот за даним винаходом, суміші містять менш, ніж 10% алкільних естерів поліненасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 7% алкільних естерів поліненасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 5% алкільних естерів поліненасичених жирних кислот, переважно, менш, ніж 3% алкільних естерів поліненасичених жирних кислот, чи, переважно, менш, ніж 1% алкільних естерів поліненасичених жирних кислот. В конкретних втіленнях сумішей алкільних естерів жирних кислот за даним винаходом, алкільні естери жирних кислот вибирають з групи, що складається з метилового естеру, етилового естеру, пропілового естеру, та бутилового естеру. В інших втіленнях алкільні естери жирних кислот вибирають з групи, що складається з ізопропілового естеру, t-бутилового естеру, чи sec-бутилового естеру. У переважних втіленнях, алкільні естери жирних кислот є метиловими естерами. У деяких втіленнях, метиловий естер капронової кислоти (6:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер каприлової кислоти (8:0) може становити від, приблизно, 5 до, приблизно, 6 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 35%, чи від, приблизно, 10 до, приблизно, 30%, від, приблизно, 15 до, приблизно, 25% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер капринової кислоти (10:0) може становити від, приблизно, 20 до, приблизно, 60%, чи від, приблизно, 30 до, приблизно, 50%, чи від, приблизно, 40 до, приблизно, 50% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер лауринової кислоти (12:0) може становити від, приблизно, 5 до, приблизно, 30%, чи від, приблизно, 10 до, приблизно, 30%, чи від, приблизно, 15 до, приблизно, 25% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер міристиринової кислоти (14:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер пальмітинової кислоти (16:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер пальмітолеїнової кислоти (16:1) може становити від 0 до, приблизно, 10% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер стеаринової кислоти (18:0) може становити від 0 до, приблизно, 5% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер олеїнової кислоти (18:1) може становити від 0 до, приблизно, 10% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер лінолевої кислоти (18:2) може становити від 0 до, приблизно, 5% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер ліноленової кислоти (18:3) може становити від 0 до, приблизно, 1 % від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер арахідонової кислоти (20:0) може становити від 0 до, приблизно, 3% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер бегенової кислоти (22:0) може становити від 0 до, приблизно, 3% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; метиловий естер еруконової кислоти (22:1) може становити від 0 до, приблизно, 5% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот; та метиловий естер лігноцеринової кислоти (24:0) може становити від 0 до, приблизно, 3% від усієї маси суміші метилових естерів жирних кислот. У додаткових втіленнях вищезазначених аспектів даного винаходу, суміші олій, чи жирних кислот чи алкільних естерів жирних кислот мають температуру плавлення, яка менш, ніж чи дорівнює 0°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -10°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює 15°С, переважно, менш, ніж чи дорівнює -20°C, чи, переважно, менш, ніж чи дорівнює -25°C. У додаткових втіленнях вищезазначених аспектів даного винаходу, суміші олій, чи жирних кислот чи алкільних естерів жирних кислот мають температуру помутніння, яка менш, ніж чи дорівнює 0°С, переважно, менш, ніж чи дорівнює -10°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює 15°С, переважно, менш, ніж чи дорівнює -20°C, чи, переважно, менш, ніж чи дорівнює -25°С. У додаткових втіленнях вищезазначених аспектів даного винаходу, суміші олій, чи жирних кислот чи алкільних естерів жирних кислот мають температуру застигання, яка менш, ніж чи дорівнює 0°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -10°С, переважно, менш, ніж чи дорівнює 15°С, переважно, менш, ніж чи дорівнює -20°C, чи, переважно, менш, ніж чи дорівнює -25°С, У деяких втіленнях вищезазначених аспектів даного винаходу суміші олій, чи жирних кислот чи алкільних естерів жирних кислот є придатними для застосування як пального у двигуні внутрішнього згорання, добавок до палив, функціонального пального, знижувача температури замерзання, біодизельного пального, авіаційного пального, комунально-побутового пального, чи замісника керосину. Вираз "придатний для застосування у двигуні внутрішнього згорання" відноситься до властивостей пального, що дозволяють застосування для живлення двигуна внутрішнього згорання. У деяких втіленнях, придатне пальне має цетанове число 40-100; 40-80; чи, переважно, 40-70; чи, переважно, 40-60; чи, переважно, 40-55; чи, переважно, 40-50. В інших втіленнях придатне пальне має йодне число 20-130; переважно, 40-100; переважно, 20-50, чи, переважно, 10-20. У додаткових втіленнях, придатне пальне має температуру плавлення, яка менш, ніж чи дорівнює 0°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -10°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -15°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -20°С, чи, переважно, менш, ніж чи дорівнює -25°C. У додаткових втіленнях, придатне пальне має температуру застигання, яка менш, ніж чи дорівнює 0°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -10°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює 15°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -20°C, чи, переважно, менш, ніж чи дорівнює -25°C. В інших втіленнях, а придатне пальне має температуру застигання, яка менш, ніж чи дорівнює 0°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -10°C, переважно, менш, ніж чи дорівнює -15°С, переважно, менш, ніж чи дорівнює -20°C, чи, переважно, менш, ніж чи дорівнює -25°С. У додаткових втіленнях вищезазначеного аспекту даного винаходу суміші жирних кислот чи алкільних естерів жирних кислот застосовують як біодизельне пальне та змішують з пальним на основі нафти з утворенням біодизельної суміші для застосування як пального. У конкретних втіленнях, біодизельне пальне містить 1 %, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, або навіть 75% біодизельної суміші, а пальне на основі нафти є залишком. The American Society for 7 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Testing Materials (ASTM) класифікує дві марки дизельного палива, дизельне пальне № 1 та дизельне пальне № 2. У конкретних втіленнях, біодизельне пальне змішують з дизельним пальним № 1, дизельним пальним № 2 чи змішують із сумішшю біодизельного пального № 1 та № 2. В іншому аспекті, винахід забезпечує генетично змінену рослину, де рослина експресує один чи більше модифікованих ферментів, одну чи більше мутацій, таким чином, щоб рослина продукувала підвищені кількості середньоланцюгових жирних кислотах порівняно із природною рослиною. У переважних втіленнях, генетично змінена рослина, переважно, продукує середньоланцюгові жирні кислоти, що мають 8, 10, чи 12 атомів вуглецю. Як вживається у цій заявці, термін "переважно, продукує середньоланцюгові жирні кислоти, що мають 8, 10, чи 12 атомів вуглецю" означає, що, щонайменше, 50% від маси жирних кислот, що продукує генетично змінена рослина, є середньоланцюговими жирними кислотами, що мають 8, 10, чи 12 атомів вуглецю; більш переважно, щонайменше, 60%; більш переважно, щонайменше, 70%; більш переважно, щонайменше, 75%; більш переважно, щонайменше, 80%; більш переважно, щонайменше, 85%; більш переважно, щонайменше, 90%; більш переважно, щонайменше, 95%; більш переважно, щонайменше, 98% від маси жирних кислот, що продукує генетично змінена рослина, є середньоланцюговими жирними кислотами, що мають 8, 10, чи 12 атомів вуглецю. У переважних втіленнях вищезазначеного аспекту винаходу, генетично змінену рослину одержують з рослини, яка, у своєму природному стані продукує олію, що має більш, ніж 40% довголанцюгових жирних кислот. У деяких втіленнях, генетично змінену рослину одержують з природної рослини, що не є видом Cuphea. Cuphea має деякі особливості, що можуть бути недоліками у певних втіленнях даного винаходу. Наприклад, ідіоплазм Cuphea дикого типу осипається та, як результат, не може бути вирощений у комерційній кількості" (Knapp et al. "Modifying the seed storage of lipids of Cuphea'. A source of medium chain triglycerides." In Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, 111., AOCS Press). Додатково, "він не стійкий до холоду, насіння руйнується, цвітіння непередбачене, а стеблини, листя та квіти покриваються липким еластичним волоссям... [та] проростання є повільним (14-20 днів)" (Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol. 12, No. 3). Додатково, одержання достатньої кількості олії з Cuphea може перешкоджати здатності до продукування достатньої кількості олії для комерційної практики Cuphe. Проте, у певних втіленнях, деякі інші застосування Cuphea можуть забезпечити рослину для модифікації. Наприклад, "рослини ростуть швидко, а насіння дозріває тільки на шостий тиждень, що є ідеальним для помірного клімату" (Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol. 12, No. 3). Відповідно у певних втіленнях забезпечено генетично змінену рослину Cuphea, що продукує суміш олій, що описано у цій заявці. У деяких втіленнях вищезазначеного аспекту даного винаходу, рослиною, що експресує модифікований фермент, є рослина, вибрана з групи, що складаються з рапсу, бавовни, льону, арахісу, пальми, сафлори, сої, соняшника, кастору та кукурудзи. У переважних втіленнях рослиною є соя, більш переважно, пальма, чи більш переважно, кастор, чи найбільш переважно, рапс. У конкретних втіленнях рослина є видом рапсу, переважно, Brassica napus, Brassica juncea, Brassica rapa, Brassica oteracea, Brassica nigra, Brassica carinata, та Sinapis alba (Brassica alba Rabenh.). У переважних втіленнях вищезазначеного аспекту винаходу, мутацію вводять у фермент з використанням ген-відновлюючої олігонуклеооснови, що містить мутацію. Неклеооснова містить основу, що є пурином, пирімидином, чи їх похідним чи аналогом. Нуклеозиди є нуклеосновами, що містять пентозафуранозильну групу, наприклад, необов'язково заміщений рибозид чи 2'-дезоксирибозид. Нуклеозиди можуть бути зв'язані однією чи декількома зв'язуючими групами, що можуть чи не можуть містити фосфор. Нуклеозид, зв'язані незаміщеними фосфодіестеровими звязуючими групами мають назву нуклеотидів. "Нуклеооснови", як вживається у цій заявці, включають пептидні нуклеооснови, підгрупи пептидних нуклеїнових кислот та морфолінові нуклеооснови, а також нуклеозиди та нуклеотиди. Олігонуклеооснова є полімером нуклеооснов, де полімер може гібридизувати шляхом основного спарювання Уотсона-Кріка із ДНК, що має комплементарну послідовність. Олігонуклеооснова послідовність має один 5' та 3' кінець, що є віддаленими нуклеоосновами полімеру. Конкретний олігонуклеоосновий ланцюг може містити нуклеооснови усіх типів. Олігонуклеооснова сполука є сполукою, що містить один чи більше олігонуклеоосновних ланцюгів, що комплементарні та гібридизовані шляхом основного спарювання Уотсона-Кріка. Нуклеооснови можуть бути дезоксирибо-типу чи рибо-типу. Рибо-типною нуклеоосновою є пентозафуранозил, що містить нуклеооснови, де 2' вуглець є метиленом, заміщеним гідроксилом, алкокси чи галогеном. Дезокси-типними нуклеоосновами є нуклеооснови, інші, ніж 8 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рибо-типні нуклеооснови, що включають усі нуклеооснови, що не містять пентозафуранозил групу. Олігонуклеоосновна нить генерично містить обидві олігонуклеооснові ланцюги та сегменти чи регіони олігонуклеоосновних ланцюгів. Олігонуклеоосновна нить має 3' кінець та 5" кінець. Коли олігонуклеоосновна нить має таку ж довжину, що й ланцюг, 3' та 5' кінці ниті є також 3' та 5' кінцями ланцюгу. Термін "олігонуклеооснова відновлення генів" вживається у цій заявці для позначення олігонуклеооснов, включаючи змішані дуплексні олігонуклеотиди, молекули, що містять ненуклеотиди, однониткові олігодезоксинуклеотиди та інші молекули відновлення генів, як детально описано нижче. У додаткових втіленнях вищезазначеного аспекту даного винаходу, модифікованим ферментом є ацил-АСР тіоестераза. У певних втіленнях, модифікованою ацил-АСР тіоестеразою є рослина, вибрана з групи, що складається з рапсу, бавовни, льону, арахісу, пальми, сафлори, сої, соняшника, кастору та кукурудзи. У переважних втіленнях модифікованою ацил-АСР тіоестеразою є вид рапсу, переважно, Brassica napus, Brassica juncea, Brassica rapa, Brassica oleracea, Brassica nigra, Brassica carinata, Sinapis alba (Brassica alba Rabenh.), переважно, Brassica napus. У конкретних втіленнях, одна чи більше мутацій містяться у регіоні, що відповідає амінокислотним залишкам 91-397 SEQ ID NO:2; переважно, одна чи більше мутацій містяться у регіоні, що вибрано з групи, що складаються з амінокислотних залишків 128-147 SEQ ID NO:2, амінокислотних залишків 175-206 SEQ ID NO:2, амінокислотних залишків 254-297 SEQ ID NO:2, амінокислотних залишків 333-335 SEQ ID NO:2, чи амінокислотних залишків 365-397 SEQ ID NO:2. У деяких переважних втіленнях ацил-АСР тіоестеразою є пальмітоїл-АСР тіоестераза (PTE). У додаткових втіленнях вищезазначеного аспекту даного винаходу, модифікованим ферментом є кето ацил синтаза (KAS). У конкретних втіленнях фермент KAS може бути модифікований таким чином, щоб його активність була зменшена чи знищена. В інших втіленнях, фермент KAS може бути модифікований таким чином, щоб змінювати його субстратну селективність. У переважних втіленнях, ферментом KAS є KAS Il та одна чи більше мутацій наявні у положеннях у регіоні, що відповідає амінокислотним залишкам 328-385. У переважних втіленнях одна чи більше мутацій наявні у регіоні, що відповідає амінокислотним залишкам 325-352 SEQ ID NO:3 чи амінокислотним залишкам 355-385 of SEQ ID NO:3. У більш переважних втіленнях, дна чи більше мутацій наявні у регіоні, що відповідає амінокислотним залишкам 325-340 of SEQ ID NO:3, або навіть амінокислотним залишкам 331-337 SEQ ID NO:3 У деяких втіленнях, амінокислоту, що відповідає консервованому лейциновому залишку у положенні 337 SEQ ID NO:3, мутовано. В іншому аспекті даного винаходу забезпечено трансгенні рослини, що містять два експресованих трансгена, що кодують ацил-АСР тіоестерази, де кожна тіоестераза не має активності по відношенню до середньоланцюгових жирних кислот різної довжини. Таким чином, така трансгенна рослина експресуватиме обидві тіоестерази та продукуватиме суміш середньоланцюгових жирних кислот. 9 У певних втіленнях, модифікованим ферментом є А -стеароїл ацил-АСР десатураза. У 9 переважних втіленнях активність чи експресія А -стеароїл ацил-АСР десатурази збільшена. У 9 переважних втіленнях, підвищення активності А -стеароїл ацил-АСР десатурази генетично модифікованій рослині призводить до продукування підвищених рівнів C16:1 та/або C18:1; та/або зменшених рівнів С16:0 та/або зменшених рівнів С18:0 порівняно із природною 9 рослиною. У деяких переважних втіленнях, ген А -стеароїл ацил-АСР десатурази модифіковано таким чином, що генетично модифікована рослина продукує підвищені рівні С16:1. У певних 9 втіленнях ген А -стеароїл ацил-АСР десатурази модифіковано таким чином, що він проявляє підвищену активність із пальмітоїл-АСР; чи у генетично модифікованій рослині, що є бавовною, льоном, арахісом, пальмою, саффлорою, соняшником, соєю, Cuphea, кастором чи кукурудзою 9 та підвищене продукування С16:0 досягається шляхом трансформації рапсу А -стеароїл ацилАСР геном макадамії (Macadamia integhfolia), обліпихи (Hippophae rhamnoides) чи лядвенця (Doxantha unguis-cati). У певних втіленнях, модифікованим ферментом є A12 десатураза (кодований геном FAD2). У переважних втіленнях активність чи експресія А12 десатурази інгібована чи атенуйована. У переважних втіленнях, інгібування чи атенуація активності чи експресії А12 десатурази в генетично модифікованій рослині призводить до генетично модифікованій рослини, що продукує знижені рівні С18:2, та/або С18:3; та підвищені рівні С18:1 відносно природної рослини. У певних втіленнях вищезазначеного аспекту, перша ацил-АСР тіоестераза має активність по відношенню до С8 та С10 жирних ацил-АСР субстратів та експресованого трансгену, що 9 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодує другу ацил-АСР тіоестеразу, що має активність по відношенню до С12 жирних ацил-АСР субстратів. У конкретному втіленні, першу ацил-АСР тіоестеразу одержують з виду Cuphea, а другу ацил-АСР тіоестеразу одержують з виду Ulmus. У деяких аспектах даного винаходу, забезпечена генетично модифікована рослина, що генетично модифікована таким чином, щоб продукувати олію, що має суміш жирних кислот, що описана у цій заявці. Наприклад у деяких переважних втіленнях забезпечена рослина, що продукує суміш жирних кислот, де насичені жирні кислоти мають 8-12 атомів вуглецю, та мононенасичені жирні кислоти, що мають 12-18 атомів вуглецю, складають 80% 100% суміші, каприлова кислота (С8:0) та капринова кислота (С10:0) складають 5%-80% суміші, лауринова кислота відповідає менш, ніж 20% суміші, а поліненасичені жирні кислоти та насичені жирні кислоти, що мають більш, ніж 12 атомів вуглецю, разом складають менш, ніж 20% суміші. У деяких переважних втіленнях генетично модифікованої рослини, рослина продукує вищезазначену суміш жирних кислот, де каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають 20%-40% суміші; переважно, лауринова кислота (С12:0) складає 6%-20% суміші, більш переважно, лауринова кислота (C12:0) містить 6%-10% суміші; та олеїнова кислота (С18:1) та пальмітолеїнова кислота (16:1) разом складають 50%85% суміші. У деяких переважних втіленнях генетично модифікованої рослини, рослина продукує вищезазначену суміш жирних кислот, де каприлова кислота (С8:0), капринова кислота (С10:0), та лауринова кислота (С12:0) разом складають 60%-85% суміші; переважно, лауринова кислота (С12:0) становить 6%-20% суміші, більш переважно, лауринова кислота (С12:0) складає 6%-10% суміші; та олеїнова кислота (С18:1) та пальмітолеїнова кислота (16:1) разом складають 20%-40% суміші. У певних особливо переважних втіленнях, забезпечена генетично модифікована рослина, що продукує олію, що містить, приблизно, 10% С8; приблизно, 20% С10; приблизно, 10% С12; та приблизно, 60% C16:1 та/або C18:1. У різних особливо переважних втіленнях, забезпечена генетично модифікована рослина, що продукує олію, що містить, приблизно, 5% С8; приблизно, 5% С10; приблизно, 15% С12; приблизно, 70% C16:1 та/або С18:1; та приблизно, 1% чи менше з кожних С14:0, С16:0, С18;0, С18:2 та С18:3. У деяких втіленнях вищезазначених аспектів даного винаходу, генетично модифіковану рослину одержують з рослини, вибраної з групи, що складається з рапсу, бавовни, льону, арахісу, Cuphea, сафлори, сої, соняшника, кастору та кукурудзи. У конкретних втіленнях рослина є видом рапсу, переважно, Brassica napus, Brassica juncea, Brassica rapa, Brassica oleracea, Brassica nigra, Brassica carinata, та Sinapis alba (Brassica alba Rabenh.). У деяких особливо переважних втіленнях вищезазначених аспектів, генетично модифікованою рослиною є генетично змінена рослина; в інших переважних втіленнях, генетично модифікованою рослиною є трансгенна рослина. Додатковими втіленнями є рослина, що містить як трансгенні, так і генетичні зміни. В одному втіленні, генетично модифіковану рослину модифікують таким чином, щоб генетична модифікована рослина продукувала підвищені рівні середньоланцюгових жирних кислот (переважно, підвищені рівні С8:0, С10:0 та С12:0 відповідно до переважних сумішей жирних кислот, забезпечених у цій заявці ) та/або знижені рівні пальмітинової кислоти (С16:0) та/або знижені рівні С18:0. В інших переважних втіленнях, генетично модифіковану рослину модифікують таким чином, щоб вона продукувала підвищені рівні мононенасичених жирних кислот, переважно, підвищені рівні С16:1 та С18:1 мононенасичених жирних кислот; та продукує нижчі рівні насичених та поліненасичених жирних кислот, переважно, нижчі рівні С16:0, C18:0, С18:2 та/або С18:3. В особливо переважних втіленнях генетично модифіковану рослину модифікують таким чином, щоб вона продукувала підвищені рівні середньоланцюгових жирних кислот (переважно, підвищені рівні С8:0, С10:0 та/або С12:0); знижені рівні С16:0 та С18:0; та підвищені рівні С16:1 та С18:1. В одному особливо переважному втіленні вищезазначених аспектів, забезпечено рапсову рослину, яку генетично модифіковано для продукування олії, що містить суміш жирних кислот, забезпечених у цій заявці. У деяких переважних втіленнях генетично модифіковану рапсову рослину модифікують таким чином, щоб, порівняно із природною рапсовою рослиною, генетична модифікована рапсова рослина продукувала підвищені рівні середньоланцюгових жирних кислот (переважно, підвищені рівні С8:0, С10:0 та С12:0 відповідно до переважної суміші жирних кислот, забезпечених у цій заявці ) та/або знижені рівні пальмітинової кислоти (С16:0) та/або знижені рівні С18:0. В інших переважних втіленнях, генетично модифіковану рослину модифікують таким чином, щоб, порівняно із природною рапсовою рослиною, генетична модифікована рапсова рослина продукувала підвищені рівні мононенасичених жирних кислот, переважно, підвищені рівні С16:1 та С18:1 мононенасичених жирних кислот, та продукувала нижчі рівні насичених та поліненасичених жирних кислот, переважно, нижчі рівні 10 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 С16:0, С18:0, С18:2 та С18:З. В особливо переважних втіленнях генетично модифіковану рапсову рослину модифікують для продукування підвищених рівнів середньоланцюгових жирних кислот (переважно, підвищених рівнів С8:0, С10:0 та/або С12:0); знижених рівнів С16:0 та С18:0; та підвищених рівнів С16:1 та/або С18:1. В іншому особливо переважному втіленні вищезазначених аспектів, а забезпечено соєву рослину, яку генетично модифіковано для продукування олії, що містить суміш жирних кислот, забезпечених у цій заявці. У деяких переважних втіленнях генетично модифіковану соєву рослину модифікують таким чином, щоб, порівняно із природною соєвою рослиною, генетична модифікована соєва рослина продукувала підвищені рівні середньоланцюгових жирних кислот (переважно, підвищені рівні С8:0, С10:0 та С12:0 відповідно до переважної суміші жирних кислот, забезпечених у цій заявці ) та/або знижені рівні пальмітинової кислоти (С1б:0) та/або знижені рівні С18:0. В інших переважних втіленнях, генетично модифіковану соєву рослину модифіковано таким чином, щоб, порівняно із природною соєвою рослиною, генетична модифікована соєва рослина продукувала підвищені рівні мононенасичених жирних кислот, переважно, підвищені рівні С16:1 та С18:1 мононенасичених жирних кислот, та продукувала нижчі рівні насичених та поліненасичених жирних кислот, переважно, нижчі рівні С16:0, С18:0, С18:2 та С18:3. В особливо переважних втіленнях генетично модифіковану соєву рослину модифікують для продукування підвищених рівнів середньоланцюгових жирних кислот (переважно, підвищених рівнів С8:0, С10:0 та/або С12:0); знижених рівнів С16:0 та С18:0; та підвищених рівнів С16:1 та/або С18:1. У додаткових втіленнях вищезазначених аспектів даного винаходу забезпечено насіння, що продукує генетично змінені чи трансгенні рослини. У додаткових втіленнях вищезазначених аспектів за даним винаходом забезпечено олії чи суміші жирних кислот, екстрагованих з насіння, плодів, чи листя генетично змінених чи трансгенних рослин. В іншому аспекті даного винаходу забезпечено способи одержання біодизельного пального з олії, одержаної зі зміненої рослини чи трансгенної рослини. У певних втіленнях олія з генетично зміненої рослини чи трансгенної рослини використовують як єдину олію для одержання біодизельного пального. В інших втіленнях, олію з генетично зміненої рослини змішують з олією з природної рослини, трансгенної рослини чи їх обох та використовують для одержання біодизельного пального. У конкретних втіленнях олію одержують з генетично зміненої рослини в якій одна чи більше мутацій введені з використанням олігонуклеооснов відновлення генів, такі олії можуть бути використані окремо чи у поєднанні з однією чи більше олій, одержаних з трансгенної рослини чи природної рослини, чи іншої генетично зміненої рослини. У певних втіленнях, спосіб включає трансетерифікацію олії, екстрагованої з насіння, плоду чи листя однієї чи більше генетично змінених рослин чи трансгенних рослин, змішаних з олією, одержаною з, однієї чи більше природних рослин з одержанням біодизельного пального, що містить алкільні естери жирних кислот. У деяких втіленнях, трансетерифікацію супроводжують реакцією вказаної олії зі спиртом та основним каталізатором. У додаткових втіленнях, спосіб додатково включає очищення алкільних естерів жирних кислот, де таке очищення може включати видалення каталізатору, гліцерину та води. У додаткових інших втіленнях олію з трансгенної рослини змішують з однією чи більше оліями з генетично зміненої рослини, природної рослини, чи їх обох, та використовують для одержання біодизельного пального. У конкретних втіленнях, трансгенна рослина експресує один чи більше трансгенів. У конкретних втіленнях трансген експресує протеїн, що змінює вміст середньоланцюгових жирних кислот, що продукуються рослиною. У переважних втіленнях трансгенна рослина продукує більші кількості середньоланцюгових жирних кислот, ніж природна рослина. У більш переважних втіленнях, трансгенна росина, переважно, продукує середньоланцюгові жирні кислоти, що мають 8, 10, чи 12 атомів вуглецю. У більш переважних втіленнях трансгенна рослина продукує олію, що має менш довголанцюгові жирні кислоти, ніж природна рослина. В ще одному іншому аспекті даного винаходу забезпечено спосіб прогнозування теоретичної температури плавлення суміші метилових естерів жирних кислот. У цьому способі розраховують суму множин: відсотку (в/в) індивідуального естеру жирної кислоти (X), температури плавлення цього естеру (MPX), та коефіцієнта (Fx), для кожного ME жирної кислоти, що міститься у суміші. Таким чином, ця умова для кожного метилового естеру відповідає, наприклад, (X*MPX*Fx). Числові визначення температур плавлення та коефіцієнтів, що використовують у цьому способі, можуть варіюватися, але призводити до одержання дійсного проміжного значення. Термін "коефіцієнт", як вживається у цій заявці, відноситься до постійного значення, що відповідає метиловому естеру жирної кислоти. Коефіцієнт з відсотковим вмістом для такого ME жирної кислоти та температура плавлення для такого ME 11 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жирної кислоти для одержання умови для такого ME жирної кислоти, що застосовують у способі, наприклад, індивідуальні температури плавлення можуть варіюватися шляхом додавання чи віднімання 2°C, чи 5°C, або навіть 10°C, а індивідуальні коефіцієнти можуть варіюватися на 5% чи 10% або навіть 20%, але призводити до одержання дійсної передбаченої температури плавлення суміші. У певних втіленнях, забезпечено спосіб прогнозування температури плавлення суміші, де + передбачувану температуру плавлення, Ртп, розраховують наступним чином: Pтп = [(A*MPA*FA) (B*MPB*FB) - (С*МРC*FC) * (D*MPD*FD) + (E*MPE*FE) + (F*MPF*FF) -v (G*MPG*FG) + (H*MPH*FH) + (I*MPI*FI) + (J*MPJ*FJ) + (K*MPK*FK) + (L*MPL*FL) + (M*MPM*FM)]*(0,01). Де, А є відсотком (в/в) капронового ME (6:0) у суміші; В є відсотком (в/в) каприлового ME (8:0) у суміші; C є відсотком (в/в) капринового ME (10:0) у суміші; D є відсотком (в/в) лауринового ME (12:0) у суміші; E є відсотком (в/в) мирістиринового ME (14:0) у суміші; F є відсотком (в/в) пальмітинового ME (16:0) у суміші; G є відсотком (в/в) стеаринового ME (18:0) у суміші; H є відсотком (в/в) олеїнового ME (18:1) у суміші; І є відсотком (в/в) лінолевого ME (18:2) у суміші; J є відсотком (в/в) ліноленового ME (18:3) у суміші; K є відсотком (в/в) арахідонового ME (20:0) у суміші; L є відсотком (в/в) бегенового ME (22:0) у суміші; M є відсотком (в/в) лігноцеринового ME (24:0) у суміші; МРА становить -81°С - -61°C включно; МРВ становить -5С° - -30°C включно; MPc становить -28°С - -8°С включно; MPD становить -5°С - 15°C включно; МРЕ становить 9°С - 29°C включно; MPF становить 21°С - 41°С включно; MPG становить 28°С - 48°С включно; МРН становить -30°C - -10°C включно; MPI становить -45°C - -25°C включно; MPJ становить -67°С - -47°С включно; MPK становить 4,5°C - 65°C включно, MPL становить 43°C - 63°C включно; MPM становить 48°С - 68°C включно; FA становить 8-12 включно; FB становить 3,5-5,5 включно; FC становить 1.0-1,4 включно; FD становить 0,8-1,2 включно; FE становить 0,5-0,7 включно; FF становить 1,1-1,6 включно; FG становить 1,8-2,6 включно; FH становить 0,9-1,3 включно; FI становить 0,5-0,8 включно; FJ становить 0,15-0,25 включно; FK становить 8-12 включно; FL становить 1,6-2,4 включно; та FM становить 1,6- 2,4 включно. В конкретному втіленні вищезазначеного аспекту, передбачувану температуру плавлення розраховують наступним чином: Pтп = [(A*MPA*FA) + (B*MPB*FB) - (C*MPC*FC) * (D*MPD*FD) + (E*MPE*FE) + (F*MPF*FF) -ν (G*MPG*FG) +(H*MPH*FH) + (I*MPI*FI) + (J*MPJ*FJ) + (K*MPK*FK) + (L*MPL*FL) + (M*MPM*FM)]*(0,01), де A - M визначено вище. У пов'язаному втіленні вищезазначеного аспекту, застосовують алгоритм для ідентифікації сумішей метилових естерів жирних кислот, що є придатними для застосування як біодизельного пального, де розраховують передбачувану температуру плавлення суміші та порівнюють із граничним значенням. Термін "граничне значення", як вживається у цій заявці, відноситься до бажаної температури плавлення, де суміші, що мають Ртп меншу, чи рівну бажаній температури 12 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 плавлення, є придатними для застосування біодизельного пального. У конкретних втіленнях, граничне значення становить 0°C, переважно, -5°C, переважно, -10°C, переважно, -15°С, переважно, -20°C, переважно, 0°C, чи, переважно, -20°С. Термін "відсоток від маси", як вживається у цій заявці, відноситься до кількості компоненту у суміші. Загалом, це відноситься до грамів компонента на 100 грамів суміші. Наприклад, суміші, що містять "10% сполуки X від маси", відноситься до 10 грамів сполуки X у 100 грамах суміші. Термін "біодизельне пальне", як вживається у цій заявці, відноситься до пального, одержаного з рослинної олії чи тваринного жиру. Загалом, біодизельне пальне складається, головним чином, з алкільних естерів жирних кислот. Переважно, біодизельне пальне є придатним для застосування у двигуні внутрішнього згорання. Термін "біодизельні суміші" відноситься до пального, що є сумішшю біодизельного пального та іншого пального. Загалом, біодизельне пальне змішують з нафтовим пальним (тобто, нафтопальним). Біодизельні суміші мають назву BXX. "XX" вказує на кількість біодизельного пального у суміші. В100 є 100% біодизельним пальним чи "чистим" біодизельним пальним. Суміш В20, наприклад, є 20% об'ємною сумішшю біодизельного пального з 80% нафтопального. Термін "пальне" відноситься до речовини, яку запалюють для одержання теплоти чи енергії. Приклади включають рідини, такі, як бензин, комунально-побутове пальне, авіаційне пальне, бензин, дизельне пальне, біодизельне пальне, рослинна олія, та біодизельні суміші. Деяке пальне, наприклад, бензин, дизельне пальне, біодизельне пальне, рослинна олія чи біодизельні суміші можуть бути використані для живлення двигунів внутрішнього згорання. Вираз "генетично модифікована рослина" відноситься до трансгенної рослини чи генетично зміненої рослини. Термін "природна рослина", як вживається у цій заявці, відноситься до рослини, що не була модифікована генетично (тобто, трансгенної чи генетично зміненої). Природні рослини включають рослини дикого типу, а також рослини, що були селективно розведені для набуття конкретних характеристик. Вираз "трансгенна рослина" відноситься до рослини, що має ген з іншого виду рослин чи нерослинних видів. Такий ген можу мати назву "трансген." Вираз "генетично змінена рослина" відноситься до рослини, що має одну чи більше генетичних модифікацій, таких, як трансгени та/або модифіковані ферменти, що містять одну чи більше розроблених мутацій. Такі розроблені мутації можуть призводити до утворення модифікованих ферментів, що мають активність, іншу ніж у природного ферменту. Такі відмінності можуть включати відмінності специфічності субстрату чи рівня активності. Як вживається у цій заявці, "трансгенна рослина" є одним типом "генетично зміненої рослини". Вираз "добавка до пального" відноситься до рідкої речовини, яку додають до пального, що становить менш, ніж 5% маси кінцевого пального. Вираз "суміш жирних кислот" може бути використаний для посилання на склад, що містить різні жирні кислоти. У певних втіленнях суміш жирних кислот може бути олією чи сумішшю олій, в інших втіленнях суміш жирних кислот може бути сумішшю вільних жирних кислот чи сумішшю вільних жирних кислот та олії чи суміші олій. У певних втіленнях деякі чи усі жирні кислоти у суміші жирних кислот можуть бути модифіковані з утворенням алкільних естерів жирних кислот, наприклад метилових естерів жирних кислот, етилових естерів жирних кислот, пропілових естерів жирних кислот та інш. У деяких переважних втіленнях , алкільні естери жирних кислот включають метилові естери. Відповідно, якщо не вказано інше, вираз "суміш жирних кислот", як вживається у цій заявці, охоплює суміші алкільних естерів жирних кислот, вказаних у суміші. Аналогічно, якщо не вказано інше, термін "жирна кислота", як вживається у цій заявці, включає алкільні естери жирних кислот. Вираз "функціональна рідина" відноситься до рідкої речовини, яку додають до пального, що становить більш, ніж 5% від маси кінцевої суміші. Вираз "знижувач точки замерзання" відноситься до рідкої речовини, яку додають до пального для зниження точки замерзання цього пального. Вираз "цетанове число" чи CN є мірою запальних характеристик пального та корелює з періодом затримки запалення. Наприклад, пальне з великим цетановим числом починає горіти невдовзі після його введення у циліндр (тобто, короткий період затримки запалення). Навпаки, пальне з низьким цетановим числом має більш довгий період затримки запалення. Додатково, більш високе цетанове число корелює з покращеним згоранням, покращеним початком роботи на холоді, зменшеним рівнем шуму, зменшеною кількістю білого диму, та зниженим виділенням HC, CO та частинок, особливо протягом ранньої стадії нагрівання. Комерційно наявне нафтове дизельне пальне, загалом має два CN діапазони: 40-46 для стандартного біодизельного пального, та 45-50 для пального преміум-класу. 13 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вираз "йодне число" визначають як стандартний аналіз природних олій для вимірювання ступеню ненасичення рослинних олій та жирів. Вираз "температура помутніння" відноситься до температури, при якій з'являються білі воскові кристали, та для визначення цієї температури використовують стандартизований тестовий протокол American Society for Testing and Materials (ASTM). Вираз "температура застигання" відноситься до температури, при якій пальне більше не є рідиною. Температура застигання, загалом, нижча за температуру помутніння. Деякі двигуни не здатні до експлуатації при температурі помутніння, але загалом усі двигуни не будуть працювати при температурах застигання. Вираз "температура плавлення" кристалічної твердої речовини відноситься до t температури, при якій вона змінює стан з твердого на рідкий. При розгляді температури зворотної зміни (тобто, з рідкого стану на твердий), вона має назву "температури замерзання." Для більшості речовин, температури замерзання та плавлення співпадають. Температура плавлення чи температура замерзання нижчі за температуру застигання. Термін "сировина", як вживається у цій заявці, відноситься до речовини, що складається з жирів, жирних кислот, чи тригліцеридів, що можуть бути використання як вихідний матеріал для одержання біодизельного пального. Приклади сировин, що можуть бути використані для одержання біодизельного пального, включають рослинну олію, відпрацьовану рослинну олію, та тваринні жири. Інші сировини включають суміші жирних кислот чи алкільних естерів жирних кислот. Термін "приблизно", як вживається у цій заявці, означає у кількісних термінах плюс чи мінус 10%. Наприклад, "приблизно, 3%" буде охоплювати 2,7-3,3% та "приблизно, 10%" буде охоплювати 9-11%. Якщо не вказано інше, будь-які відсотки, вказані у цій заявці, є масовими відсотками Інші ознаки та переваги даного винаходу будуть очевидними з наступного опису переважних втілень та з формули винаходу. Стислий опис фігур На Фігурі 1 наведено часткову амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:1) ацил-АСР тіоестерази (пальмітоїл-ACP тіоестерази чи PTE) з Brassica naptis. На Фігурі 2 наведено амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:2) ацил-АСР тіоестерази (пальмітоїл-АСР тіоестерази чи PTE) з Arabidopsis. На Фігурі 3 наведено амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:3) кето ацил синтази Il (KAS II) з Arabidopsis thaliana (номер доступу у GenBank NP_849888). На Фігурі 4 наведено нуклеотидну послідовність (SEQ ID NO:4) кето ацил синтази Il (KAS II) з Arabidopsis thaliana (номер доступу у GenBank NMJ 79557). На Фігурі 5 наведено два маршрути, за якими біодизельне пальне можу бути одержано з олії чи жиру. На Фігурі 6 наведено вміст жирних кислот у деяких ілюстративних оліях. Детальний опис винаходу Змішування олій Олії, що містять різні склади середньоланцюгових жирних кислотах можуть бути змішані для одержання бажаної суміші середньоланцюгових жирних кислот. Олії змішують в залежності від мас. Наприклад, об'єм рапсової олії, що має бути використана у 100 грамах суміші, що містить 25 % рапсової олії, визначають шляхом ділення грамів рапсової олії у кінцевій суміші на питому масу рапсової олії (тобто, 25 гм/0,915 гм/мкл=27,3 мл). На Фігурі 6 наведено таблицю, що містить деякі ілюстративні олії та вміст жирних кислот, що вони містять. Ці олії комерційно доступні з багатьох джерел. Відмітимо, що значення вмісту жирних кислот виражають як діапазони, оскільки, як відомо з рівня техніки, кількості конкретних жирних кислот, присутніх у конкретній рослині, можуть значно відрізнятися. Таким чином, олії, екстраговані з цих рослин, можуть проявляти різні кількості будь-якої та усіх жирних кислот в залежності від партії. Тому, зазвичай необхідно визначати вміст жирних кислот олій, що фактично застосовують для одержання сумішей чи біодизельних палив. Одержання алкільних естерів жирних кислот Алкільні естери жирних кислот можуть бути одержані з жирних кислот чи з тригліцеридів. Загалом, алкільні естери жирних кислот одержують шляхом трансетерифікації тригліцеридів у жирах та оліях чи етерифікації вільних жирних кислот (На Фігурі 5). Альтернативно, жирні кислоти можна вивільнити з тригліцеридів шляхом гідролізу чи послідовної етерифікації з одержанням естерів жирних кислот. Алкільні естери жирних кислот одержують шляхом трансетерифікації тригліцеридів з різних олій, одержаних з рослин, таких, як соєва олія, пальмова олія, сафлорова олія, арахісова олія, кукурудзяна олія, бавовняна олія, лляна олія, 14 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кокосова олія, касторова олія, рапсова олія, соняшникова олія та різні олії, одержані з тваринних жирів. Ці олії реагують зі спиртом (наприклад, метанолом, етанолом, пропанолом, бутанолом) у присутності основного каталізатора, такого, як алкоксид натрію, гідроксид натрію чи калію, чи тетраізопропоксид титану. Умови реакції, такі, як температура та тиск, можуть бути вибрані, виходячи з конкретних використаних спиртів. Кількість каталізатору, загалом, знаходиться у діапазоні від, приблизно, 0,1 до, приблизно, 0,5% від маси, виходячи з жирних кислот. Цей процес призводить до одержання алкільного естеру жирних кислот, де алкільну групу одержують зі спирту. Таким чином, реакція із використанням метанолу призведе до утворення метилового естеру жирної кислоти. Інші бічні продукти включають гліцерин. Трансестерифікаційні катіонні продукти виділяють при фракціонуванням при зниженому тиску шляхом перегонки через фракційну колонку, алкільні естери жирних кислот може одержують з вільних жирних кислот шляхом етерифікації. Вільні жирні кислоти комерційно доступні з ряду джерел чи можуть бути одержані з, наприклад, вищезазначених олій, можуть реагувати зі спиртами у присутності кислотного каталізатору, такого, як сірчана кислота, арилсульфонова кислота чи алкілсульфонова кислота. Умови реакції, такі, як температура та тиск, можуть бути вибрані, виходячи з конкретних використаних спиртів. Естери жирних кислот можуть бути відновлені шляхом нейтралізації сірчаною кислотою з наступним очищенням для видалення водних складових реакції. Змішування естерів жирних кислот Естери жирних кислот комерційно доступні чи можуть бути одержані етерифікацією жирних кислот, як описано вище. Жирні кислоти змішують з одержанням суміші, що має придатні властивості для використання як біодизельне пальне, добавка до пального, функціональна рідина, авіаційне чи реактивне пальне, комунально-побутове пальне чи бензин. Властивості, що розглядають при оцінюванні придатності сумішей, можуть включати температуру плавлення, температуру помутніння, температуру застигання, йодне число, цетанове число, в'язкість, стійкість до окиснення та характеристики зносу при терті. Суміші одержують, виходячи з масових відсотків. Для суміші метилових естерів жирних кислот (FAMEs), бажаний масовий відсоток кожного компоненту FAME ділять на питому масу цього FAME. Це дає об'єм FAME на 100 грамів кінцевої суміші. Наприклад, для одержання суміші, що містить 14% (мас. %) метилового естеру капринової кислоти (спостерігають за переходом з твердого до рідкого стану або зменшення розсіювання світла, реєструють як температуру плавлення проби. Альтернативно до простої температури плавлення, як пояснено вище, існує "температура плавлення зсуву", у цьому способі, а невелику кількість проби поміщують у капіляр із закритим кінцем, так, щоб він був підвішений у центр пробірки по довжині. Після встановлення рівноваги на водяній бані, температуру повільно підіймають, та температура, при якій підвішена проба почне падати, чи "зсуватися" у капілярі, реєструють як температуру плавлення зсуву. Визначення температуру плавлення твердого жиру також детально описано у способах, наведених у American Association of Cereal Chemists (AACC) спосіб номер 58-40 "Температура плавлення-капілярний спосіб, та спосіб номер 58-53 температура плавлення зсуву. Додатково, способи також наявні в офіційному способі American Oil Chemists Society (AOCS) Cc 1-25 "Температура плавлення капілярно-пробірочний спосіб" та офіційний спосіб OCS Cc 3*25 "Температура плавлення зсуву AOCS стандартна температура плавлення у відкритій пробірці". Альтернативно, передбачувану температуру плавлення можна розрахувати за допомогою алгоритму, що наведений у цій заявці. Температура помутніння та температура загустіння. Температура помутніння та температура загустіння можуть бути визначені в експерименті із використанням одного приладу. Стисло, пробу охолоджують у приладі температури помутніння та загустіння та періодично аналізують протягом охолодження. Найвища температура, при якій спостерігають помутніння, є температурою помутніння. Найнижча температура, при якій спостерігають рух в олії, є температурою загустіння. Цей спосіб має відповідати ASTM D97, D2500 та пов'язаним специфікаціям. Такий прилад (К46100 Cloud Point & Pour Point Apparatus Cloud and Pour Point Chamber) наявний у Koehler Instrument Company, Inc., 1595 Sycamore Avenue, Bohemia, New York 11716, USA. Цетанове число. Якість запалення дизельного пального (DF) зазвичай вимірюють за способом тестування American Society for Testing and Materials (ASTM) ASTM D613 та повідомляють як цетанове число (CN). Якість запалення визначають за часом затримки запалення пального у двигуні. Чим коротше час затримки запалення, тим вище CN. Сполуки ранжували відповідно до метанової шкали. Цетан (С16Н34 чи гексадекан) має дуже коротку затримку запалення та йому присвоєно 15 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 CN 100. На іншому кінці шкали у патенті США №.5955,329 описано "способи зміни специфічності субстрату рослинних ацил-АСР тіоестераз, та конструювання рослинних ацилАСР тіоестераз." Зокрема, описано, що "С12 переважна рослинна ацил-АСР тіоестераза, описана у цій заявці, може бути змінена з одержанням рослинної тіоестерази, що має приблизно однакову активність на субстратах С14 та С12." Carlsson et al. (Plant Journal 29(6):761-770, 2002) описують "мутант Arabidopsis, з частковим дефіцитом активності 3-кетоацил-[ацил протеїн - носій] синтази Il (KASII)." Мутація fabl описана як "однонуклеотидна зміна у послідовності Arabidopsis KAS2, що призводить до Leu337Phe заміщення." Knapp et al. ("Modifying the seed storage of lipids of Cuphea: A source of medium chain triglycerides." In Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, III., AOCS Press) описує мутант Cuphea viscosissima, створений випадковим мутагенезом, що продукує олії, що мають змінені тригліцеридні склади. У патентах США №№ 5,667,997, 5,455,167, 5,298,421 та 5,512,482 описано нуклеотидні та амінокислотні послідовності ацил-АСР тіоестераз, що мають специфічність до середньоланцюгових жирних кислот, та відповідні трансгенні рослини, що експресують кожен з цих тіоестерів, Генетично змінена рослина, що продукує середньоланцюгові жирні кислоти може бути одержана шляхом мутації чи модифікації одного чи більше ферментів на маршруті біосинтезу жирних кислот. Біосинтез жирних кислот відбувається у пластидах рослин. Синтез жирних кислот йде від двовуглецевих прекурсорів, зв'язаних із ацил протеїновим носієм (ACP), через послідовне двовуглецеве додавання у реакцію, каталізовану ферментом кето ацил синтазою (KAS). Протягом цього процесу жирні кислоти залишаються етерифікованими до ACP, що призводить до утворення пулів ацил-АСР проміжних сполук, в яких частина ацила має різну довжину. Тіоестерази, присутні у пластиді, гідролізують зв'язок тіол-естер між жирною кислотою та ACP, таким чином, вивільнюючи жирну кислоту, що може потім існувати у пластиді та збиратися у тригліцериди. Декілька ізомерів KAS що мають афінності до ацильних ланцюгів конкретних довжин. Наприклад, KAS І фермент, наприклад, Brassica napus, має низьку афінність до ацильних ланцюгів, довших за 16 атомів вуглецю, таким чином, цей фермент не подовжуватиме ацильний ланцюг з 16 атомів вуглецю. KAS Il специфічно каталізує реакцію для продовження ацильних ланцюгів 16 атомів вуглецю до ацильних ланцюгів з 18 атомів вуглецю. KAS Il має низьку афінність до ацильних ланцюгів, більш довгих чи більш коротких, ніж 16 атомів вуглецю. Аналогічно, було ідентифіковано ацил-АСР тіоестерази, що мають переважну активність щодо ацильних ланцюгів конкретної довжини. Існують, наприклад, тіоестерази, що, головним чином, гідролізують ацил-ACPs, що мають жирні кислоти з 18 атомів вуглецю (наприклад, олеоїл-АСР тіоестераза, чи ОТЕ). Аналогічно, є тіоестерази, що мають переважну активність щодо ацил-ACPs, що мають жирні кислоти з 16 атомів вуглецю (наприклад, пальмітоїл-АСР тіоестераза, чи PTE). Додатково, повідомлялося про тіоестерази, що мають переважну активність щодо різних середньоланцюгових жирних кислотах. "Переважну активність" рослинної тіоестерази до конкретного ланцюгового жирного ацильного носія-субстрата визначають порівнянням кількостей вільних жирнокислотних продуктів, одержаних для субстратів з різною довжиною ланцюгу. Наприклад, під "С12-перевагою" мають на увазі, що гідролітична активність ферментного препарату має перевагу над лауроїльною, та, можливо, деканоїльною, над субстратами різних ацильних вуглецевих ланцюгів. Аналогічно, а рослинні тіоестерази, що мають "С10-переважну" активність, проявлятимуть вищі рівні активності по відношенню до деканоїльних субстратів, та, можливо, октаноїлу, над іншими субстратами різної довжини атомів вуглецю. Відмічено, що деяка активність, значно менша, може спостерігатися для інших ланцюгових субстратів жирних кислот. Таким чином, перевага можу бути істотною, а не абсолютною. У переважних втіленнях, генетично змінену рослину, що експресує модифікований фермент, одержують шляхом введення мутації у фермент шляхом використання олігонуклеооснови генного відновлення, як описано у цій заявці. Спосіб включає введення олігонуклеооснови генного відновлення, що містить специфічну мутацію для гена-мішені, що розглядається, у рослинну клітину будь-яким з ряду способів, відомих з рівня техніки (наприклад, мікроносіїв, мікроволокон, електропорації та мікроін'єкції) та ідентифікації клітини, насіння чи рослини, що містять мутований фермент. Як вживається у цій заявці термін "ген-мішень" відноситься до гену, що кодує фермент, що має бути модифікований. Олігонуклеооснови відновлення генів 16 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід може бути реалізований за допомогою "олігонуклеооснов відновлення генів", що мають конформації та хімічні властивості, описані детально нижче. "Олігонуклеооснови відновлення генів" за даним винаходом включають змішані дуплексні олігонуклеотиди, молекули, що містять не-нуклеотиди, однониткові олігодезоксирибонуклеотиди та інші молекули відновлення генів, описані у патентах та патентних публікаціях, наведених нижче. "Олігонуклеооснови відновлення генів" за даним винаходом також були описані в опублікованій науковій та патентній літературі з використанням інших назв, включаючи "рекомбінагенні олігонуклеооснови"; "РНК/ДНК химерні олігонуклеотиди"; "химерні олігонуклеотиди"; "змішані дуплексні олігонуклеотиди (MDONs)"; "РНК ДНК олігонуклеотиди (RDOs)"; "генні олігонуклеотиди-мішені"; "генопласти"; "однониткові модифіковані олігонуклеотиди"; "однониткові олігодезоксинуклеотидні мутаційні вектори"; "дуплексні мутаційні вектори"; та "гетеродуплексні мутаційні вектори". Олігонуклеооснови, що мають конформації та хімічні властивості, описані у патенті США № 5,565,350 Kmiec (Kmied) та патенті США № 5,731,181 Kmiec (Kmiec II), включено до цієї заявки шляхом посилання, придатні для застосування як "олігонуклеооснови відновлення генів" за даним винаходом. Олігонуклеооснови відновлення генів у Kmiec I та/або Kmiec Il містять дві комплементарні ниті, одна з яких містить, щонайменше, один сегмент нуклеотидів РНК-типу ("PHK сегмент") що основно зв'язаний із нуклеотидами ДНК-типу іншої ниті. У Kmiec Il описано, що пуринові та пирімідинові основні не-нуклеотиди можуть бути заміщені нуклеотидами. Додаткові молекули відновлення генів, що можуть бути використані у даному винаході, описані у патентах США №№ 5,756,325; 5,871,984; 5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5,780,296; 5,945,339; 6,004,804; та 6,010,907 та у міжнародному патенті PCT/US00/23457; та у міжнародних патентних публікаціях WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; та WO 99/40789, кожен з яких повністю включено до цієї заявки. В одному втіленні, олігонуклеооснова відновлення генів є змішаним дуплексним олігонуклеотидом, в якому нуклеотиди РНК-типу змішаного дуплексного олігонуклеотиду є PHK резистентні шляхом заміщення 2'-гідроксилу на фторо, хлоро чи бромо-групу чи заміщенням замісника у положенні 2'-0. Придатні замісники включають замісники, описані Kmiec II. Альтернативні замісники включають замісники, описані у патенті США № 5,334,711 (Sproat) та замісники, описані у публікаціях EP 629 387 та EP 679 657 (разом, заявки Martin), що включені до цієї заявки шляхом посилання. Як вживається у цій заявці, 2'-флоро, хлоро чи бромо похідні рибонуклеотиду чи рибонуклотиди, що мають 2'-OH, заміщені замісником, описаних у заявках Martin чи Sproat під назвою "2'-заміщений рибонуклеотид." Як вживається у цій заявці термін "нуклеотид РНК-типу" означає 2'-гідроксил чи 2'-заміщений нуклеотид, зв'язаний з іншими нуклеотидами змішаного дуплексного олігонуклеотиду незаміщеним фосфодіестерним зв'язком чи будь-якими неприродними зв'язками, описаними у Kmiec І чи Kmiec II. Як вживається у цій заявці, термін "нуклеотид дезоксирибо-типу" означає нуклеотид, що має 2'-H, що можу бути зв'язаний з іншими нуклеотидами олігонуклеооснову відновлення генів незаміщеним фосфодіестерним зв'язком чи будь-якими неприродними зв'язками, описаними у Kmiec І чи Kmiec II. У конкретному втіленні даного винаходу, олігонуклеооснова відновлення генів є змішаним дуплексним олігонуклеотидом, зв'язаним лише незаміщеними фосфодіестерними зв'язками. В альтернативних втіленнях, зв'язками є заміщені фосфодіестери, похідні фосфодіестерів, похідні та нефосфорні зв'язки, описані у Kmiec II. Ще в одному втіленні, кожен нуклеотид РНК-типу у змішаному дуплексному олігонуклеотиді 2'-заміщеним нуклеотидом. Особливо переважними втіленнями 2'-заміщених рибонуклеотидів є 2'-флоро, 2'-метокси, 2'пропілокси, 2'-алліокси, 2'-гідроксилетилокси, 2'-метоксиетилокси, 2-флоро пропілокси та 2'трифлоро пропілокси заміщені нуклеотиди. Більш переважні втілення 2'-заміщених рибонуклеотидів є 2'-флоро, 2'-метокси, 2'-метоксиетилокси та 2'-аллілокси заміщеними нуклеотидами. В іншому втіленні змішаний дуплексний олігонуклеотид зв'язаний незмішеними фосфодіестерними зв'язками. Хоча змішані дуплексні олігонуклеотиди, що мають тільки один тип 2'-заміщених нуклеотидів РНК-типу синтезують більш традиційно, способи за даним винаходом можуть бути здійснені за допомогою змішаних дуплексних олігонуклеотидів, що мають два чи більше типів нуклеотидів РНК-типу. На функцію PHK сегменту може не впливати розрив викликане введенням дезоксинуклеотиду між двома тринуклеотидами РНК-типу, відповідно, термін PHK сегмент охоплює такий "розірваний PHK сегмент". Нерозірваний PHK сегмент має назву безперервного PHK сегменту. В альтернативному втіленні, PHK сегмент можу містити перемінні РНКзарезистентні та незаміщені 2'-OH нуклеотиди. Змішані дуплексні олігонуклеотиди переважно, мають менш, ніж 100 нуклеотидів, та, більш переважно, менш, ніж 85 нуклеотидів, але більш, ніж 50 нуклеотидів. Перша та друга ниті мають основне спарення Уотсона-Кріка. В одному 17 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 втіленні ниті змішаного дуплексного олігонуклеотиду ковалентно зв'язані лінкером, таким, як однонитковий гекса, пента чи тетрануклеотид, таким чином, щоб перша та друга ниті були сегментами одного олігонуклеотидного ланцюгу, що мають один 3' та один 5' кінець. 3' та 5' кінці можуть бути захищені "шпильковою головкою", де 3' та 5' кінцеві нуклеотиди спарені за Уотсоном-Кріком із сусідніми нуклеотидами. Друга шпилькова голівка може, додатково, бути поміщена на з'єднання між першою та другою нитками на відстані від 3' та 5' кінців, таким чином, що спаренювання за Уотсоном-Кріком між першою та другою нитками стабілізовано. Перша та друга нитка містять два регіони, гомологічні двом фрагментам гена-мішені, тобто, мати такі ж самі послідовності, що й ген-мішень. Гомологічний регіон містить нуклеотиди PHK сегменту та може містити один чи більше нуклеотидів ДНК-типу звязуючого ДНК сегменту, та можуть також містити нуклеотиди ДНК-типу, поза проміжного ДНК сегменту. Два регіони гомології відділені, а кожен з них сусідній з регіоном що має а послідовність, що відрізняється від послідовності гена-мішені, під назвою "гетерологічний регіон". Гетерологічний регіон можу містити один, два чи три невідповідних нуклеотида. Невідповідні нуклеотиди можуть бути сусідніми чи, альтернативно, можуть бути відділені одним чи двома нуклеотидами, гомологічними гену-мішені. Альтернативно, гетерологічний регіон може також містити інсерцію в одному, двох, трьох чи п'яти чи менше нуклеотидах. Альтернативно, послідовність змішаного дуплексного олігонуклеотиду може відрізнятися від послідовності гену-мішені лише на одну делецію одного, двох, трьох чи п'яти чи менше нуклеотидів зі змішаного дуплексного олігонуклеотиду. Довжина та положення у гетерологічному регіоні, у такому випадку, вважаються довжиною делеції, навіть за відсутності нуклеотидів змішаного дуплексного олігонуклеотиду у гетерологічному регіоні. Відстань між фрагментами гена-мішені, комплементарного двом гомологічним регіонам, ідентична довжині гетерологічного регіону, коли планують заміщення. Коли гетерологічний регіон містить інсерцію, гомологічні регіони так відділяють у змішаному дуплексному олігонуклеотиді додатково, а їх комплементарні гомологічні фрагменти знаходяться у гені, а конверсія застосовна коли гетерологічний регіон кодує делецію. PHK сегменти змішаних дуплексних олігонуклеотидів є кожний частиною гомологічного регіону, тобто, регіону, що є ідентичним за послідовністю фрагменту гену-мішені, сегменти якого разом містять, щонайменше, 13 нуклеотидів РНК-типу та, переважно, 16-25 нуклеотидів РНКтипу чи навіть більш переважно, 18-22 нуклеотидів РНК-типу чи найбільш переважно, 2 нуклеотидів. В одному втіленні, PHK сегменти регіонів гомології розділені та сусідні, тобто, "зв'язані" проміжним ДНК сегментом. В одному втіленні, кожен нуклеотид гетерологічного регіону є нуклеотидом проміжного ДНК сегменту. Проміжний ДНК сегмент, що містить гетерологічний регіон змішаних дуплексних олігонуклеотидів, має назву "мутаторного сегменту". В іншому втіленні даного винаходу, олігонуклеооснова відновлення гену є однонитковим олігодезоксинуклеотидним вектором мутацій (SSOMV), що описано у міжнародній патентній заявці PCT/US00/23457, патенті США 6,271,360, 6,479,292, та 7,060,500, що цілком включені шляхом посилання. Послідовність SSOMV заснована на тих самих принципах, що й вектори мутацій, описані у патентах США №№ 5,756,325; 5,871,984; 5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5,780,296; 5,945,339; 6,004,804; та 6,010,907 та у міжнародних публікаціях WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; та WO 99/40789. Послідовність SSOMV містить два регіони, гомологічні послідовності-мішені, розділеній регіоном, що містить бажану генетичну зміну під назвою регіон-мутатор. Регіон-мутатор може мати послідовність тієї ж довжини, що й послідовність, яка розділює гомологічні регіони у послідовності-мішені, але що мають різні послідовності. Такий регіон-мутатор можу призводити до заміщення Альтернативно, гомологічні регіони у SSOMV можуть бути сусідніми, тоді як регіони у гені-мішені, що мають таку ж саму послідовність, розділені одним, двома чи більше нуклеотидами. Така SSOMV викликає делецію з гена-мішені нуклеотидів, що відсутні у SSOMV. Остаточно, the послідовність гену-мішені, що ідентична гомологічним регіонам, сусіднім гену-мішені, проте розділеним одним, двома чи більше нуклеотидами SSOMV. Така SSOMV викликає інсерцію послідовності гена-мішені. Нуклеотиди SSOMV - це деоксорибонуклеотиди, який зв'язані не модифікованими фосфодіестерними зв'язками, за винятком того, що 3' кінцевий та/або 5' кінцевий міжнуклеотидний зв'язок або альтернативно два 3' кінцевий та/або 5' кінцевий міжнуклеотидний можуть бути фосфотіоатними або фосфоамідатними. Як вживається у цій заявці міжнуклеотидний зв'язок є зв'язком між нуклеотидами SSOMV і не включає зв'язок між 3' кінцевим нуклеотидом або 5' кінцевим нуклеотидом і блокуючим замісником, див. вище. В конкретному втіленні довжина SSOMV становить 21-55 дезоксинуклеотидів, і довжини регіонів гомології, відповідно, являють собою повну довжину, щонайменше, у 20 дезоксинуклеотидів і, 18 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 щонайменше, два регіони гомології повинні кожний мати довжину, щонайменше, у 8 дезоксинуклеотидів. SSOMV може бути розроблений, щоб бути комплементарним кодуючій або некодуючій ниті цільового гена. Коли бажана мутація - це заміна однієї основи, переважним є, щоб обидва мутаторні нуклеотиди бути пирімидинами. Тією мірою, яка відповідає досягненню бажаного функціонального результату, переважним є, що як мутаторний нуклеотид, так і нуклеотидмішень у комплементарній ниті були пирімидинами. Особливо переважним є SSOMV, який кодує трансверсійні мутації, тобто, C або T мутаторні нуклеотиди не відповідають, відповідно, C або T нуклеотиду у комплементарній ниті. Додатково до олігодезоксинуклеотиду, SSOMV може містити 5' блокуючих замісників, які приєднано до 5' кінцевих атомів вуглецю через лінкер. Хімія лінкеру не є критичною, окрім його довжини, яка повинна переважно, бути, щонайменше, становити б атомів, і того, що лінкер повинен бути гнучкий. Можуть бути використані різноманітні нетоксичні замісники, такі, як, наприклад, біотин, холестерин або інші стероїди, або неінтеркалюючий катіонний флуоресцентний барвник. Особливо переважними як реактиви, для одержання SSOMV є реактиви, що продають, як Су3.ТМ. і Су5.ТМ. від Glen Research, Sterling Va., що є блокованими фосфороамідами, що після інкорпорації в олігонуклеотид призводять до утворення барвників 3,3,3',3'-тетраметил N,N'-ізопропіл заміщених індомонокарбоціаніну і індодикарбоціаніну, відповідно. Су3 є найбільш переважним. Коли індокарбоціанін - це N-заміщений оксиалкіл, він може бути традиційно зв'язаний із 5' кінцевим олігодезоксирибонуклеотидом як через фосфодиестер з 5' кінцевим фосфатом. Хімія лінкеру між барвником та олігодезоксирибонуклеотидом не є критичною і його вибирають для синтетичної зручності. Коли комерційно доступний Су3 фосфорамідіт використовують як описано, одержана 5' модифікація складається з блокуючого замісника та лінкера разом, що є N-гідроксипропілом, N'фосфатидилпропілом 3,3,3',3'-тетраметил індомонокарбоціаніну. У переважному втіленні, індомонокарбоціаніновий барвник є тетразамісником при 3 і 3' положеннях індольних циклів. Без обмежень щодо теорії ці заміщення запобігають інтеркаляції барвника. Ідентичність замісників, оскільки щодо цих положень не є критичною. SSOMV може додатково мати 3' блокуючих замісників. Знову хімія 3' блокуючого замісника не є критичною. Модифіковані Ферменти Гени, що кодують ферменти, залучені в біосинтезі жирних кислот, є переважними мішенями для мутації. У деяких втіленнях ген мішень кодує ацил ACP тіоестеразу. В інших втіленнях ген мішень кодує кето ацил синтазу (KAS). Можуть бути розроблені мутації, який скорочують або елімінують активність ферменту або які змінюють активність ферменту (наприклад, змінюють селективність субстрату). В деяких втіленнях, модифіковано ген А9-стеароїл ацил-АСР десатурази. У певних втіленнях ген FAD2, що кодує А12 десатурази, направлений на зменшення рівнів ліноленової кислоти (18:3) і лінолеїнової кислоти (18:2) і на зростання рівнів олеїнової кислоти (18:1). У конкретних втіленнях за даним винаходом природну ацил ACP тіоестеразу мутують. В одному прикладі, ацил ACP тіоестеразу Brassica napus мутовано в регіоні, що відповідає залишкам амінокислоти 91-397 SEQ ID, НI:2. У переважних втіленнях, одна або більше мутацій присутні у положеннях в регіоні, що відповідає залишкам амінокислоти 128-147 SEQ ID, НІ:2, залишкам амінокислоти 175-206 SEQ ID, НІ:2, залишкам амінокислоти 254-297 SEQ ID, НІ:2, залишкам амінокислоти 333-335 SEQ ID, НІ:2, або залишкам амінокислоти 365-397 SEQ ID, НІ:2. В інших втіленнях за даним винаходом мутують природний фермент кето ацил синтазу (KAS). В одному прикладі, фермент KAS - це фермент KAS Il і його мутовано в регіоні, що відповідає залишкам амінокислоти 325-385 SEQ ID, НІ:3. У переважних втіленнях, одна або більше мутацій присутні у положеннях в регіоні, що відповідає залишкам амінокислоти 325-352 SEQ ID, НІ:3 або залишкам амінокислоти 355-385 SEQ ID, НІ:3. В більш переважних втіленнях, одна або більше мутацій знаходяться в регіоні, що відповідає залишкам амінокислоти 325-340 SEQ ID, НІ:3, залишкам амінокислоти або навіть 331-337 SEQ ID, НІ:3. В деяких втіленнях, мутовано амінокислоту, що відповідає консервативному лейциновому залишку у положенні 337 SEQ ID, НІ:3. У конкретних втіленнях мутовано амінокислоту, що відповідає консервативному лейциновому залишку у положенні 337 SEQ ID, НІ:3 мутовано до фенілаланіну, тирозину, триптофану або гістидину. В інших втіленнях, мутовано амінокислоту, що відповідає консервативному фенілаланільному залишку у положенні 331 SEQ ID, НІ:3. У певних втіленнях, мутовано амінокислоту, що відповідає консервативному лейциновому залишку у положенні 331 SEQ ID, НІ:3, до гліцину, аланіну, серину, треоніну, цистеїну, або валіну. Доставка олігонуклеооснов відновлення генів в рослинні клітини 19 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Будь-який загальновідомий метод може бути використаний в способах за даним винаходом, щоб трансформувати рослинну клітину олігонуклеоосновами відновлення генів. Ілюстративні способи включають використання мікроносіїв або мікроволокон, електропорацію, і мікроін'єкцію, як описано нижче. В деяких втіленнях, металеві мікроносії (мікрокапсули) використовують, щоб ввести великі фрагменти ДНК в рослинні клітини, що мають целюлозні клітинні стінки, торпедним проникненням (біолистична доставка), що добре відомо фахівцям у цій галузі. Загальні методи вибору мікроносіїв і пристрої для торпедування описано в патентах США №№ 4,945,050; 5,100,792 і 5,204,253. Конкретні умови використання мікроносіїв у способах за даним винаходом описано в Міжнародній Публікації WO 99/07865, US09/129,298. Наприклад, льодяні холодні мікроносії (60 мг/мл), змішані дуплексні мікроносії (60 мг/мл), 2,5 M CaCl2 і 0,1 M спермидіну додавали у такому порядку; суміш обережно перемішували, наприклад, вихровим струшуванням, протягом 10 хвилин і залишали при кімнатній температурі на 10 хвилин, після чого мікроносії розбавляли в 5 об'ємах етанолу, центрифугували і повторно суспендували в 100% етанолі. Ілюстративні концентрації компонентів в адгезійному розчині містили 8-10 мг/мл мікроносіїв, 14-17 пг/uX змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,1-1,4 M СаСІ2 і 18-22 мМ спермідину. В одному приклад, концентрації компонентів становлять 8 мг/мл мікроносіїв, 16,5 мг/мл змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,3 M СаСІ2 і 21 мМ спермідину. Олігонуклеооснови відновлення генів можуть також бути введені в клітини рослин для практики даного винаходу, з використанням мікроволокон, щоб проникнути у клітинну стінку і клітинну мембрану. Патент США. № 5,302,523 Coffee et al. описує використання 30 x 0,5 мкг і 10 х 0,3 мкг волокон карбіду кремнію, щоб полегшити трансформацію суспензії культур маїсу Black Mexican Sweet. Будь-яка механічна методика, яка може бути використана, щоб ввести ДНК для трансформації рослинної клітини, з використанням мікроволокон, може бути застосована для доставки використовуватися, щоб доставити олігонуклеооснови відновлення генів. Один приклад мікроволоконної доставки олігонуклеооснови відновлення генів є таким. Стерильні мікроволокна (2 мкг) суспендували в 150 мкл рослинного культурального середовища, що містило близько 10 мкг змішаного дуплексного олігонуклеотиду. Суспензію культури відстоювали та рівні об'єми упакованих клітин та стерильної суспензії волокно/нуклеотид перемішували вихровим методом протягом 10 хвилин і покривали. Селективні середовища наносили негайно або із затримкою до, приблизно, 120 годин, відповідний для конкретного експерименту. В альтернативному втіленні, олігонуклеооснови відновлення генів можуть бути доставлені шляхом електропорації рослинної клітини протопласту, одержаного з частини рослини. Протопласти формують шляхом ферментної обробки частини рослини особливо листя, згідно методам, добре відомим фахівцям у цій галузі. (Див., наприклад, Gallois et al, 1996, in Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, in Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J.) Протопласти не повинні бути культуровані в 5 ростових середовищах до електропорації. Ілюстративні умови електропорації складають 3 x 10 протопластів в повному об'ємі 0,3 мл з концентрацією олігонуклеооснови відновлення генів 0,64 мкг/мл. В ще одному альтернативному втіленні, олігонуклеооснови відновлення генів можуть бути доставлені у рослинну клітину частинками або мікроін'єкцією рослинної клітини. Так звану техніку частинок здійснюють, по суті, як описано у Frame et al., 1994, Plant J. 6:941-948. олігонуклеооснови відновлення генів додають до частинок і використовують для трансформації рослинних клітин. Олігонуклеооснови відновлення генів можуть являти собою ко-інкубовані послідовності, що містять плазміди, що кодують протеїни, здатні до формування рекомбіназ та/або комплексів відновлення генів в рослинних клітинах, таким чином, щоб каталізувати відновлення генів між олігонуклеотидом і послідовністю-мішенню в гені-мішені. Селекція рослин, що мають модифікований фермент Рослини чи частини рослин, що експресують модифікований фермент, можуть бути ідентифіковані будь-яким з цілого ряду засобів. В одному способі, стратегія со-конверсії використовує олігонуклеооснови відновлення генів (RONs), для направлення як на селектовну конверсію (тобто, маркер) так і не-селектовну конверсію (наприклад, ген-мішень, що розглядається) в одному і тому ж експерименті. Наприклад, ген ALS (або AHAS) в канолі може бути модифікований змінами однієї амінокислоти, щоб забезпечити опір (через конверсію гена) доімідазолінового (IMX) класу гербіцидів in vitro. Одночасна доставка олігонуклеооснов відновлення генів, що направлена на конверсію гена ALS і інші гена(и)/аллель(і)-мішені і відбір клітин, що виникають, на IMI, ідентифікує конверсію компетентної популяції. Таким чином, 20 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 клітини, до яких RONs не були доставлені або не могли передати конверсію, вказані RON, були б еліміновані. Оскільки не передбачається, що доставка RONs, що направлена на неродинні гени, є селективною, при деякій частоті, також передбачалося б, що регенеровані клітини, що мають конверсію ALS, мали би конверсію в одному з інших генах-мішенях. Події конверсії були б вирішені єдиним аналізом нуклеотидного поліморфізму (SNP). Тому, геномну ДНК екстрагували з листового матеріалу окремих рослин, регенерованих з протопластів, що вважали конверсійно компетентними і піддавали скринінгу індивідуальних проб ДНК, з використанням технології детекції SNP, наприклад, алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції (ASPCR), для кожної мішені. Передбачувані позитивні рослини для кожної мішені можуть бути затверділи та переміщені у грунт. Щоб незалежно підтвердити зміну послідовностей в позитивних рослинах, відповідний регіон гену-мішені можу бути PCR ампліфікований чи секвенований безпосередньо, або клонований та багаторазово інсертно секвенований. Коли багаторазові зміни будуть здійснені в тому самому ж гені, конвертант може бути зворотно схрещений до його попередника, що дозволяє відділення конвертованого ALS резистентного гена від гена-мішені. Альтернативно, введення мутації в ген, що розгладяться, може бути ідентифіковано будьяким з цілого ряду методів молекулярних біології, що розробляють, щоб знайти одинарні нуклеотидні мутації в екстрагованій нуклеїновій кислоті (наприклад, способи ампліфікації, такі, як, наприклад PCR і аналіз розширення єдиного нуклеотидного праймера). Більші мутації бути детектовані ампліфікацією і секвенуванням регіону гена-мішені, що має бути мутований. Альтернативно, рослини або рослинні клітини, що містять модифікований фермент, можуть бути ідентифіковані, наприклад, аналізом складу жирних кислот, які продукує рослина. Таким чином, рослину можна вирощувати, а олію екстрагувати і аналізувати, використовуючи способи, відомі в цій галузі (наприклад, газову хроматографію). Одержання трансгенних рослин, що експресують два тіоестеразних трансгена Трансгенні рослини, що експресують два трансгени, що кодують тіоестерази, є переважними для ацильних субстратів з різною довжиною середньоланцюгових жирних кислот, можуть бути одержані способами, відомими в цій галузі. Тому, рослинні тіоестерази можуть походити з різноманітності джерел. Рослини, що продукують істотні кількості середньоланцюгових жирних кислот, є переважними джерелами ДНК послідовностей, що кодують середньоланцюгові переважні тіоестеразні рослини. Наприклад, окремі різновиди видів Cuphea акумулюють тригліцериди, що містять середньоланцюгові жирні кислоти в їх насінні, наприклад, procumbens, lutea, hookeriana, hyssopifolia, wrightii і inflate. Додатково, було показано, що в'яз (Ulmus americand), містить істотні середньоланцюгові жирні кислоти. Додатково, члени сімейства Lauraceae: наприклад, Pisa (Actinodophne hookeri), Sweet Bay (Laurus nobilis), і California Bay (Umbellularia californica) продукують насіння, що містить середньоланцюгові жирні кислоти. Додаткові джерела включають Myristicaceae, Simarubaceae, Vochysiaceae, та Salvadoraceae, і тропічні види Erisma, Picramnia та Virola, про які було повідомлено, що вони накопичують жирні кислоти С14. Деякий приклади рослин, що містять середньо-ланцюгові переважні тіоестерази та їх переважний субстрат, показані в Таблиці 1. Таблиця 1 Тіоестерази та їх субстрати Довжина ланцюгу тіостеаразного субстрату С8 С10 С12 45 50 Ілюстративні джерела тіостеарази Cuphea hookeriana, Cuphea palusmpus Cuphea hookeriana, Ulmus americana Umbellularia californica Інші рослини можуть також бути джерелами бажаних тіоестераз, які є переважними конкретних довжин ланцюгів жирних ацилів. Такі додаткові рослинні тіоестерази можуть бути ідентифіковані за допомогою аналізу складу триацилгліцеридів різних рослинних олій. Присутність конкретної тіоестерази може бути підтверджена випробуваннями, що використовують відповідний ацил-АСР субстрат. Наприклад, випробування для СIO-переважної ацил-АСР тіоестерази, описано в WO 91/16421 і може бути використано для такого аналізу. Конструкти рослинної експресії ДНК послідовності, що кодує рослинну тіоестеразу, що розглядається, можуть бути використані в широкій різноманітності рослин, зокрема, рослин, що використовують для одержання олій масел для харчового та промислового застосування. Переважними рослинами є олійні рослини, включаючи, але не обмежуючись наведеним, рапс 21 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (канолу і вищі види ерукової кислоти), соняшник, сафлору, бавовну, Cuphea, сою, арахіс, кокосовий горіх і олійні пальми та кукурудзу. Конструкти експресії, для яких клітиною-хазяїном є рослинна клітина, включають регуляторні регіони (наприклад, промотори і регіони закінчення), які функціональні в рослинах. Таким чином, відкрита рамка зчитування (ORP), що кодує протеїн, що має бути експресований в одержаній в результаті трансгенній рослині, приєднується своїм 5' кінцем до транскрипційного початкового регуляторного регіону чи промотору, такого, як, наприклад промотор, знайдений в природному гені. Наявні численні інші початкові регуляторні регіони, які забезпечують широку різноманітність конститутивної чи індуцибельної транскрипції структурних функцій гена. Серед початкових транскрипційних регіонів, що використовують для рослин, є такі регіони, що пов'язані із структурними генами, як наприклад для CaMV 35S та нопалін і маннопін синтаз, або з напіном, ACP промоторами та інш. Регіони початку транскрипції/трансляції, відповідні таким структурним генам, знайдені безпосередньо над 5' відповідних стартових кодонів. Якщо бажаним є конкретний промотор, як, наприклад, промотор, природний промотору рослини, що розглядається, або модифікованого промотору, тобто, що мають регіони початку транскрипції, отримані від одного генного джерела, і регіони початку трансляції, отримані від іншого генного джерела, включаючи послідовність, що кодує тіоестерази рослин, що розглядаються, або модифікованих промоторів, як, наприклад, подвійні промотори CaMV 35S, послідовності можуть бути з'єднані шляхом використання стандартних методів. Для більшості застосувань, де бажаною є експресія середньоланцюгових тіоестераз в рослинах, переважним є використання специфічних до насіння промоторів. Додатково, в залежності від способу введення рекомбінантного конструкта у природну клітину-хазяїн, можуть потребуватися додаткові компоненти в конструкті експресії. Наприклад, ДНК, що кодує селективний маркер для трансформатних клітин, може бути включена в конструкт експреси. Тому, той, конструкт може забезпечити для резистентності цитотоксичному агенту (наприклад антибіотику, важкому металу, токсину, і т.п.), комплементацію, що забезпечує прототрофію ауксотрофічному хазяїну, імунітет до вірусів та інш. В залежності від числа різних природних видів хазяїв, вводять конструкт експресії або його компоненти, можу бути використаний один або більше маркерів становити, де різні умови для селекції використовують для різних хазяїв. Різні методи трансформації клітин відомі в рівні техніки. Зазвичай використовують трансформацію, наприклад через зараження Agrobacterium, мікроін'єкцію, бомбардування ДНК частинками, і електропорацію. Додатково, оскільки доступні більш нові способи трансформації культур, такі способи можна також використовувати. Приклади трансформацій рослин можна знайти в патенті США № 5,667,997. Для того, щоб експресувати більш, ніж один трансген, конструкт експресії може бути генерований для кожного трансгена. Рослини можуть потім бути трансформовані першим конструктом експресії, що містить перший трансген і селектовний рослинний маркер. Регенеранти вирощують на селективному середовищі та вони можуть бути піддані скринінгу на експресію трансгена, з використанням, наприклад, Вестерн-блоттінг методів. Рослини, що експресують трансген, дозрівають і з них одержують насіння, з якого може бути згенеровано друге поколінні рослини (Т2). Генерацію Т2 використовують для другого раунда трансформацій, тепер другим конструктом експресії, що містить другий трансген і другий селектовний рослинний маркер. (Способи видалення чи інактивації селектовних рослинних маркерів відомі в рівні техніки (наприклад, як описано в WO92/01370). Регенеранти вирощують на селективному середовищі до зрілості та одержують з них насіння, з якого вирощують наступне покоління рослин (Т3). Покоління Т3 піддають скринінгу на збільшення вмісту середньо-ланцюгових жирних кислот в порівнянні з рослиною дикого типу. Генерація генетично модифікованих олійних рослин, з бажаним балансом середньоланцюгових жирних кислот і моно ненасичених жирних кислот У деяких втіленнях зменшені рівні ліноленової кислоти (18:3) і лінолеїнової кислоти (18:2), а також збільшені рівні олеїнової кислоти (18:1) одержують в генетично модифікованій рослині за допомогою зменшення експресії або активності А12 десатурази (Ген FAD2); переважно, генмішень FAD2 є рапсовим, бавовняним, лляним, арахісовим, пальмовим, сафлоровим, соєвим, соняшниковим, Cuphea, або кукурудзяним FAD2 геном. У переважних втіленнях, експресія або активність FAD2 зменшено за допомогою створення стоп-кодону в кодуючій послідовності гена; або за допомогою делеції або додавання нуклеотиду, щоб створити мутацію зсуву рамки. 9 В певних переважних втіленнях, ген А -стеароїл ацил-АСР десатурази модифіковано в генетично модифікованій рослина для збільшення рівнів пальмітолеїнової кислоти (С16:1) та/або олеїнової кислоти (18:1); переважно, генетично модифіковану рослину вибраний з групи, що складається з рапсу, бавовни, льону, арахісу, пальми, сафлори, сої, соняшника, Cuphea і 22 UA 107442 C2 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кукурудзи. У деяких переважних втіленнях експресія та/або активність А -стеароїл ацил-АСР десатурази збільшено, щоб продукування мононенасичених жирних кислот і зменшення насичених жирних кислотах; більш переважно, рівні С16:1 та/або С18:1 збільшені і рівні С16:0 та/або С18:0 зменшені в генетично модифікованій рослині порівняно із природною рослиною. В 9 інших втіленнях ген А -стеароїл ацил-АСР десатурази модифіковано таким чином, що 9 генетично модифікована рослина продукує збільшені рівні С16:1. У певних втіленнях ген A стеароїл ацил-АСР десатурази модифіковано таким чином, що він проявляє збільшену активність з пальмітоїл-ACP. Див., наприклад, Cahoon, E. В. and Shanklin, J, 2000. Substratedependent mutant complementation to select fatty acid desaturase variants for metabolic engineering of plant seed oil. Proa Nat. Acad. Sci. 97(22): 12350-12355. B зв'язаних втіленнях збільшене 9 продукування С1б:0 досягається трансформацією рапсу з геном А -стеароїл ацил-АСР з макадамії (Macadamia integrifolia) обліпихи (Hippophae rhamnoides) чи лядвенця (Doxantha unguis-cati). У певних втіленнях, активність або експресія гена KASII зменшують шляхом 9 використання способи, описані у цій заявці, додатково до модифікації гена А -стеароїл ацилАСР, щоб досягти навіть вищих рівнів 18:1 і 16:1 жирних кислот; в більш переважних втіленнях, ферменти PTE генетично модифікованої рослини також модифікують, як описано у цій заявці, щоб продукувати збільшені рівні коротколанцюгових жирних кислот; в більш переважних втіленнях А12 десатуразу модифікованої рослини також модифікують, щоб зменшити активність чи експресію. У деяких переважних втіленнях рослина; переважно, рапс, бавовна, льон, арахіс, пальма, сафлора, соя, соняшник, або кукурудза; генетично модифікована, щоб збільшити рівні коротко/середньо-ланцюгових жирних кислот, як описано у цій заявці, за допомогою (1) зміни специфічності субстрату пальмітоїл тіоестерази (PTE), щоб збільшити активність із капрілоїлАСР (С8), капроїл-АСР (С10), і лауроїл-АСР (С12) або за допомогою трансформації генів ацилАСР тіоестерази з коротколанцюговою специфічністю з Cuphea, кокосового горіха, пальми, бабассу, тукума (Astrocaryum vulgare), в'яза (Ulmus Americana), Japanese Zelkova (Zelkova serrata) або California bay (Umbellularia californica); і (2) зменшення активності гена KAS II. У деяких переважних втіленнях рослину генетично модифікують, щоб збільшити рівні коротко/середньо-ланцюгових жирних кислот за допомогою модифікації генів PTE та/або KAS Il як описано у цій заявці; і додатково модифікують, щоб зменшити рівні поліненасичених жирних кислот (переважно, зменшені рівні С18:2 і С18:3) за допомогою зменшення експресії чи 9 активності А12 десатурази; більш переважно, рослину додатково шляхом модифікації гена А стеароїл ацил-АСР десатурази для збільшення рівнів пальмітолеїнової кислоти (С16:1) та/або олеїнової кислоти (С18:0) і зменшення рівнів C16:0 та/або С18:0. Розрахунок прогнозованої температури плавлення метилових естерів жирних кислот. Прогнозована температура плавлення, Pтп, суміші метилових естерів жирних кислот може бути розрахована з використанням кількостей метилового естеру кожної кислоти, вираженої як маса/100 г суміші, за допомогою наступного рівняння. Pтп = [(A*MPA*FA) + (B*MPB*FB) - (C*MPC*FC) * (D*MPD*FD) + (E*MPE*FE) + (F*MPF*FF) -ν (G*MPG*FG) +(H*MPH*FH) + (I*MPI*FI) + (J*MPJ*FJ) + (K*MPK*FK) + (L*MPL*FL) + (M*MPM*FM)]*(0,01), де, А є відсотком (в/в) капронового ME (6:0) у суміші; В є відсотком (в/в) каприлового ME (8:0) у суміші; C є відсотком (в/в) капринового ME (10:0) у суміші; D є відсотком (в/в) лауринового ME (12:0) у суміші; E є відсотком (в/в) мирістиринового ME (14:0) у суміші; F є відсотком (в/в) пальмітинового ME (16:0) у суміші; G є відсотком (в/в) стеаринового ME (18:0) у суміші; H є відсотком (в/в) олеїнового ME (18:1) у суміші; І є відсотком (в/в) лінолевого ME (18:2) у суміші; J є відсотком (в/в) ліноленового ME (18:3) у суміші; K є відсотком (в/в) арахідонового ME (20:0) у суміші; L є відсотком (в/в) бегенового ME (22:0) у суміші; M є відсотком (в/в) лігноцеринового ME (24:0) у суміші; у деяких втіленнях, передбачувану температуру плавлення можна використовувати для ідентифікації сумішей, що можуть бути застосовані як біодизелі. У цих втіленнях, прогнозовану температуру плавлення порівнюють з граничним значенням (тобто, з бажаною температурою плавлення біодизельного пального). Такі суміші, що мають а прогнозовану температуру 23 UA 107442 C2 5 10 плавлення меншу, ніж чи рівну граничному значенню, є придатними для застосування як біодизелі. Наступні приклади призначені для ілюстрації даного винаходу. Ці приклади жодним чином не призначені для обмеження обсягу винаходу. Приклад 1 Суміш 1 метилових естерів жирних кислот Суміш метилових естерів жирних кислот ("Суміш 1") що має склад метилових естерів жирних кислот, вказаний у таблиці, наведеній нижче, одержують шляхом змішування метилових естерів жирних кислот з використанням об'ємів, представлених у таблиці, наведеній нижче, з одержанням 100 г Суміші 1. Компонент капроновий ME (6:0) каприловий МЕ (8:0) каприновий МЕ (10:0) лауриновий МЕ (12:0) мирістириновий МЕ (14:0) пальмитиновий ME (16:0) стеариновий ME (18:0) олеїновий ME (18:1) лінолевий МЕ (18:2) ліноленовий МЕ (18:3) арахідоновий ME (20:0) бегеновий МЕ (22:0) лігнориновий ME (24:0) 15 20 Суміш 1 1% 20 30 20 4 2 2 15 1 1 1 1 1 Передбачувана температура кипіння Суміші 1, Ртп>, розрахована способами за даним винаходом, становить -41,6°C. Приклад 2 Суміш 2 метилових естерів жирних кислот Суміш метилових естерів жирних кислот ("Суміш 1") що має склад метилових естерів жирних кислот, вказаний у таблиці, наведеній нижче, одержують шляхом змішування метилових естерів жирних кислот з використанням об'ємів, представлених у таблиці, наведеній нижче, з одержанням 100 г Суміші 2. Компонент капроновий ME (6:0) каприловий ME (8:0) каприновий МЕ (10:0) лауриновий МЕ (12:0) мирістириновий ME (14:0) пальмитиновий ME (16:0) стеариновий ME (18:0) олеїновий ME (18:1) лінолевий МЕ (18:2) ліноленовий МЕ (18:3) арахідоновий ME (20:0) бегеновий МЕ (22:0) лігноцериновий ME (24:0) 25 30 мл/100 г 1,1 22,8 34,4 23,0 4,7 2,3 2,1 17,1 1,1 1,1 1,2 1,2 1,2 Суміш 2 1% 10 35 25 5 2 2 15 1 1 1 1 1 мл/100 г 1,1 11,4 40,1 28,7 5,8 2,3 2,1 17,1 1,1 1,1 1,2 1,2 1,2 Передбачувана температура кипіння Суміші 2, Ртп>, розрахована способами за даним винаходом, становить -24,3°С. Приклад 3 Суміш 3 метилових естерів жирних кислот Суміш метилових естерів жирних кислот ("Суміш 1") що має склад метилових естерів жирних кислот, вказаний у таблиці, наведеній нижче, одержують шляхом змішування метилових естерів жирних кислот з використанням об'ємів, представлених у таблиці, наведеній нижче, з одержанням 100 г Суміші 3. 24 UA 107442 C2 Компонент капроновий ME (6:0) каприловий ME (8:0) каприновий МЕ (10:0) лауриновий МЕ (12:0) мирістириновий ME (14:0) пальмитиновий ME (16:0) стеариновий ME (18:0) олеїновий ME (18:1) лінолевий МЕ (18:2) ліноленовий МЕ (18:3) арахідоновий ME (20:0) бегеновий МЕ (22:0) лігноцериновий ME (24:0) 5 10 Суміш 3 1 5 35 30 5 2 2 15 1 1 1 1 1 Передбачувана температура кипіння Суміші 3, Ртп>, розрахована способами за даним винаходом, становить -15,0°С. Приклад 4 Суміш 4 метилових естерів жирних кислот Суміш метилових естерів жирних кислот ("Суміш 1") що має склад метилових естерів жирних кислот, вказаний у таблиці, наведеній нижче, одержують шляхом змішування метилових естерів жирних кислот з використанням об'ємів, представлених у таблиці, наведеній нижче, з одержанням 100 г Суміші 4. Компонент капроновий ME (6:0) каприловий ME (8:0) каприновий МЕ (10:0) лауриновий МЕ (12:0) мирістириновий ME (14:0) пальмитиновий ME (16:0) стеариновий ME (18:0) олеїновий ME (18:1) лінолевий МЕ (18:2) ліноленовий МЕ (18:3) арахідоновий ME (20:0) бегеновий МЕ (22:0) лігноцериновий ME (24:0) 15 мл/100 г 1,1 5,7 40,1 34,5 5,8 2,3 2,1 17,1 1,1 1,1 1,2 1,2 1,2 Суміш 4 1% 5 30 30 5 7 2 15 1 1 1 1 1 мл/100 г 1,1 5,7 34,4 34,5 5,8 8,2 2,1 17,1 1,1 1,1 1,2 1,2 1,2 Передбачувана температура кипіння Суміші 4, Ртп>, розрахована способами за даним винаходом, становить -11,9°С. Приклад 5 Суміш олій А Суміш двох олій ("Суміш 4"), що має склад жирних кислот, вказаний нижче, одержують шляхом змішування кокосової олії та олії Cuphea lanceolate, що мають склад жирних кислот, вказаний нижче. 20 25 UA 107442 C2 Компонент капроновий ME (6:0) каприловий ME (8:0) каприновий МЕ (10:0) лауриновий МЕ (12:0) мирістириновий ME (14:0) пальмитиновий ME (16:0) стеариновий ME (18:0) олеїновий ME (18:1) лінолевий МЕ (18:2) ліноленовий МЕ (18:3) арахідоновий ME (20:0) бегеновий МЕ (22:0) лігноцериновий ME (24:0) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Суміш А 0,4% 5,5 25 36 14 7,7 2,1 6,0 2,6 0,1 0,1 0 0 Cuphea 0 0,6 83,2 2,1 2 3,4 0 3,4 4,6 0 0 Кокосова олія 0,5 7,1 6 47,1 18,5 9,1 2,8 6,8 1,9 0,1 0,1 0 0 Суміш А може бути одержана шляхом перемішування 75% від маси вищезазначеної кокосової олії з 25% від маси вищезазначеної олії Cuphea lanceolata. 25 грамів олії Cuphea lanceolata (25 грамів/0,92 грамів/мл = 27,2 мл) сполучають з 75 грамів соєвої олії (75 грамів/0,924 грамів/мл = 81,2 мл) з одержанням 1000 г Суміші А. Приклад 6 Перетворення олій на FAMES Різні види комерційних рослинних олій (включаючи соєву, канолову, кукурудзяну, макадамієву, оливкову, сафлорову,соняшникову, арахісову, волоського горіха, пальмову, кокосову та касторову олію) одержували з роздрібних джерел. 200 грамів кожної олії зважували у скляній судині з кришкою з різьбою та сполучали з 2 об'ємами (об.) натрій метоксидного реагенту (5% об. натрій метоксиду/метанол). Після перемішування протягом 2 годин при кімнатній температурі, 50 мл гексану додавали, ретельно перемішували та розділяли фази. Нижній шар, що містив гліцерин, видаляли та зливали. Верхній шар вакуумували у роторному випарнику для видалення гексану та будь-яких летких залишків. Кінцевий розчин FAME зберігали в атмосфері азоту при кімнатній температурі у ретельно закритій скляній судині. Приклад 7 Перетворення жирних кислот на FAMES 100 грамів жирних різних кислот, чи сумішей жирних кислот, зважували у скляній судині та поєднували з 200 мл безводного метанолу/1% сірчаної кислоти. Кожну суміш покривали азотом та контейнер ретельно закривали. Реакційну судину поміщали в інкубаторну піч на 4 години при 50°C. Протягом інкубування, суміш струшували для перемішування реагентів. Суміш переносили у скляну ділильну лійку та поєднували із 100 мл 5% (мас.) водного розчину хлориду натрію. Суміш ретельно струшували та розділяли фази шляхом відстоювання. Нижній водний шар видаляли та зливали. Верхній шар переносили у чисту суху судину та поєднували із 5 грамами безводного сульфату натрію. Цю суміш ретельно струшували до видалення усіх видимих крапель води. Суміш фільтрували через ватмановський фільтрувальний папір 1. Сульфат натрію та фільтрувальний пристрій промивали гексаном для відновлення додаткових FAME та промивні води додавали до неводної фракції. Поєднаний фільтрат та промивні води поміщ али у роторний випарник у вакуумі для видалення гексану та залишків летких речовин. Кінцевий розчин FAME переносили у судину з темного скла, пропускали азот, ретельно закривали тефлоновою кришкою та зберігали при 4°C. Інші естери синтезували з використанням протокольних заміщуючих етанолу, н-пропанолу, ізопропанолу, н-бутанолу, secбутанолу чи t-бутанолу замість метанолу, що використовували вище. Приклад 8 Холоднотемпературне тестування сумішей алкільних естерів Властивості при холодних температурах алкільних естерів та сумішей естерів аналізували за допомогою піпеткових аліквот чистих алкільних естері чи сумішей естерів, одержаних з олій чи жирних кислот, як описано вище, в 10 мм x 100 мм скляних тестових пробірках, до кінцевого об'єму 1,0 мл. Пробірки закривали поліпропіленовими кришками та поміщали у пластикові штативи. Пробірки на штативах занурювали на глибину 1-2 см вище верху проби, в охолоджений розчин 50% етиленгліколю/води. Серію Водяних бань використовували для послідовного тестування проб при 0, -10, -15, -20, та -25°C. Проби витримували при тестовій температурі протягом 1 години, а кожну пробирку витягали та перевіряли на присутність 26 UA 107442 C2 5 10 15 20 25 помутніння, затвердіння та характеристики застигання/текучості. Додатково, відібрані проби надсилали у незалежну аналітичну лабораторію (Intertek-Caleb-Brett Laboratories) та оцінювали на температуру застигання, температуру помутніння та пропускали через фільтр з використанням відповідних ASTM стандартних способів для дизельного пального (ASTM D-9706, ASTM D-2500-05, та ASTM D6371). Температури застигання естерів та сумішей естерів також визначали з використанням портативного аналізатора температур застигання дизельного пального, модель СРА-Т30 (Phase Technology Corp.). Пластиковий шприц на 10 мл наповнювали естером чи сумішшю естерів та вводили шляхом ін'єкції у прилад. Через 10 хвилин з приладу зчитували точні дані щодо температур застигання. Приклад 9 Температури плавлення олій насіння В100 та дизельного пального № 2 Серії В100 біодизельних пальних (алькільних естерів жирних кислот) одержували з рослинних олій, включаючи соєву, канолову, кукурудзяну, макадамієву, оливкову, сафлорову, соняшникову, арахісову олію, олію волоських горіхів, пальмову, кокосову та касторову олію, відповідно до процедур, описаних в Прикладі 6. Це пальне порівнювали з комерційно одержаним дизельним пальним № 2 на основі нафти (Shell Oil Co., San Diego, CA) на властивості текучості на холоді відповідно до процедур, описаних в Прикладі 8. Вплив інкубування кожної рідини при різних температурах між +20 та -20°C наведено у таблиці нижче, де показано, чи була рідина рідкою чи твердою після інкубування при даних температурах протягом 1 години (температура застигання). Дизельне пальне залишалося рідким до -15°С, але ставало твердим через 1 годину при -20°С. Навпаки, метилові естери жирних кислот на основі олій тверділи при значно нижчих температурах. Метиловий естер пальмової олії був твердий при +5°C. Естерами рослинних олій з найкращими властивостями були канолові та касторові, обидва з яких були твердими -15°С. Таким чином, жодні з метилових естерів рослинних олій не мали властивості при холодних температурах, що були однакові з дизельним пальним чи мали температуру застигання менш, ніж -20°C. Базова олія СОЄВА КАНОЛАОВА КУКУРУДЗЯНА МАКАДАМІЄВА ОЛИВКОВА САФЛОРОВА СОНЯШНИКОВА АРАХІСОВА ВОЛОСЬКОГО ГОРІХА ПАЛЬМОВА КОКОСОВА КАСТОРОВА ДИЗЕЛЬНЕ ПАЛЬНЕ % 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 RT L L L L L L L L L L L L L 0°C L L L S L L CL S L S L L L -10°C S L S S S S S S S S S L L -10°C S CL S S S S S S S S S S L -20°C S S S S S S S S S S S S L Абревіатура: L = рідкий S = твердий CL = помутнілий розчин RT - Кімнатна температура 30 35 40 45 Приклад 10 С8 та С10 FAMES зниження температури плавлення соєвої та канолової В100 Властивості при холодних температурах метилових естерів, одержаних з рослинної олії, покращували шляхом додавання метилових естерів коротколанцюгових жирних кислот. Метиловий естер соєвої олії був твердий при -10°C. Коли 30% (об.) С8 метилового естеру (метил октаноату) додавали до метилового естеру соєвої олії, суміш залишалася рідкою при 10°C. Коли С8 метиловий естер підвищували до 60% (об.) суміш залишалася рідкою до ~20°С. Додавання С10 метилового естеру (метил деканоату) мало ідентичний вплив на температуру застигання метилового естеру одержаного з сої. Властивості при холодних температурах метилових естерів, одержаних з канолової олії, також були покращені додаванням метилових естерів коротколанцюгових жирних кислот. Додавання 40% С8 метилового естеру до канолового метилового естеру знижувало температуру застигання, що спостерігалася, до -20°C. Додавання С10 метилового естеру до канолового мало подібний вплив на температури застигання, що спостерігалися. Додавання суміші С8/С10 естерів до канолових чи соєвих метилових естерів також знижувало температуру застигання суміші. 27 UA 107442 C2 Базова олія Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Соя Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола Канола % 100 90 80 70 60 50 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 С8МЕ С10МЕ 0 10 20 30 40 50 0 10 20 ЗО 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 RT L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L 0°C L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L -10°С S S S S L L S S S L L L L L L L CL CL CL L L L L L L L L CL CL CL L L L -15°С S S S S S S S S S S S S L L L L S S CL CL CL CL L L L L L S S CUS CL CL CL -20°C S S S S S S S S S S S S L L L L S S S S CL CL CL L L L L S S S CL CL CL Абревіатура: L = рідкий S = твердий CL = помутнілий розчин RT = Кімнатна температура С8МЕ = метил октаноат C10ME - метил деканоат 5 10 15 Приклад 11 Властивості плавлення різноманітних біодизельних сумішей цільних олій В2-В100 Суміші дизельного пального з метиловими естерами, одержаними з рослинних олій, також піддавали тестуванню на властивості при холодних температурах. Дизельне пальне тестували при 2% (В2), 5% (В5), 20% (В20) (об.) метилового естеру, одержаного з рослинної олії, поряд із метиловим естером, одержаним з чистої рослинної олії (В100). Додавання метилового естеру, одержаного з рослинної олії до дизельного пального не мало значного впливу на температури застигання суміші, за виключенням сумішей В20. Канолова, касторова та соєва олії не впливали на температуру застигання В20, тоді як кукурудзяна, оливкова, сафлорова, соняшникова, арахісова, пальмова та кокосова олія підвищували температури застигання сумішей В20 порівняно із чистим дизельним пальним. 28