Генетичні маркери, асоційовані з відповіддю на інтерферон-альфа

Реферат: Винахід стосується застосування інтерферону-альфа (IFN-α) для одержання лікарського засобу для лікування індивіда-людини, хронічно інфікованого гепатитом С генотипу 1 і тестованого позитивно щонайменше на один маркер відповіді на IFN-α. UA 106756 C2 (12) UA 106756 C2 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, якої стосується винахід Даний винахід стосується генетичних маркерів, розташованих на хромосомі 19 людини, які є прогностичними для позитивної відповіді на терапію інтерфероном-альфа. Рівень техніки винаходу Ідентифікація якої-небудь публікації у даному розділі або у будь-якому розділі даної заявки не є підтвердженням того, що така публікація являє собою відомий рівень техніки даного винаходу. Сімейство білків інтерферону-альфа (IFN-α) типу I проявляє клінічно важливі противірусні антипроліферативні та імуномодуляторні активності, і різні білки IFN-α були схвалені для лікування ряду захворювань, включаючи гепатит і злоякісні пухлини. У зв'язку з коротким часом напівжиття у плазмі крові початково схвалених білків IFN-α, були розроблені тривало діючі версії: зокрема, пегінтерферон-альфа-2a, що постачається на ринок Hoffman-La Roche (Nutley, NJ) під комерційною назвою PEGASYS®; пегінтерферон-альфа-2b, що постачається на ринок Schering-Plough (Kenilworth, NJ) під комерційною назвою PegIntron®; і Albuferon®, злитий білок людського сироваткового альбуміну та інтерферону-альфа-2b, який знаходиться на пізній стадії клінічної розробки компанії Human Genome Sciences. Білки IFN-α впливають на ряд клітинних функцій, включаючи реплікацію ДНК і синтез РНК та білків у нормальних і патологічних клітинах. Таким чином, цитотоксичні ефекти терапії IFN-α не обмежуються пухлинними або зараженими вірусом клітинами, але також проявляються у нормальних здорових клітинах у такій самій мірі. У результаті, під час терапії IFN-α виникають небажані, але звичайно оборотні побічні ефекти, особливо якщо для досягнення терапевтичного ефекту необхідні високі дози. Наприклад, введення білків IFN-α може привести до зниження кількості еритроцитів, лейкоцитів і тромбоцитів, і високі дози часто викликають грипоподібні симптоми (наприклад, гарячку, стомлюваність, головні болі і озноб), шлунковокишкові порушення (наприклад, анорексію, нудоту і діарею), зміни настрою і зміну ферментів печінки. Такі побічні ефекти можуть мати особливо важливе значення через тривалий час лікування, звичайно необхідний при терапії на основі IFN-α. Наприклад, рекомендована тривалість комбінованої терапії пегінтерфероном-альфа/рибавірином при інфекції вірусом гепатиту С (HCV) складає від 24 до 48 тижнів, в залежності від генотипу HCV і початкового рівня вірусного навантаження. Тривалість лікування при визначених онкологічних показаннях може бути навіть більш тривалою, ніж підтверджено у нещодавно завершеному клінічному випробуванні пегінтерферону-альфа-2b як ад’ювантної терапії при резектованій меланомі III стадії, в якому пацієнти одержували 6 мкг/кг пегінтерферону-альфа-2b підшкірно протягом 8 тижнів (індуктивна фаза), з подальшими 3 мкг/кг на тиждень підшкірно, при планованій тривалості лікування 5 років (фаза стабілізації) (Eggermont A.M.M. et al., Lancet 372:117-126 [2008]). Крім можливості проблематичних побічних ефектів, терапевтичний ефект лікування IFN-α може значно варіювати серед пацієнтів з визначеним захворюванням. Наприклад, комбінована терапія пегінтерфероном-альфа-2b/рибавірином при HCV дає значення стійкої вірусологічної відповіді (SVR) приблизно від 20 до 93% у різних групах пацієнтів, що визначаються генотипом HCV і початковим рівнем вірусного навантаження. Також пацієнти з HCV африканського походження мають значно більш низькі показники стійкої вірусологічної відповіді (SVR), ніж пацієнти європейського походження. Дивіться, наприклад, публікації McCone, J. et al., th Hepatology 48(4):430A-43 IA, Abstr. No. 268 (59 Ann. Mtg. Am. Assoc. Study Liver Dis., AASLD, San Francisco, CA, USA, Oct. 31 - Nov. 4, 2008); Reid, A.E., Curr. Hepatitis Rep., Vol. 7, No. 3, pp. 120-126 (2008); Jacobson, I. M. et al. Hepatology 46 (4): 971-981 (2007). Також Eggermont et al., вище, повідомляли про більш сприятливі кінці захворювання у пацієнтів з ранньою III стадією меланоми, ніж у пацієнтів з більш пізньою стадією захворювання, зокрема, про зниження сукупного ризику рецидиву приблизно на 18-25%. Таким чином, з врахуванням побічного ефекту і варіабельної відповіді та профілів чутливості, що спостерігаються при терапії IFN-α, існує потреба у способі визначення пацієнтів, на яких терапія IFN-α найбільш ймовірно буде надавати сприятливу дію. Даний винахід направлений на задоволення даної потреби. Суть винаходу Даний винахід базується на відкритті того, що декілька однонуклеотидних поліморфізмів (SNP) хромосомної області людини 19q13.13 міцно асоційовані з відповіддю на лікування пегінтерфероном-альфа/рибавірином у пацієнтів, хронічно інфікованих HCV генотипу 1. Один з SNP являє собою поліморфізм С/Т, що ідентифікується як rs12979860 у базі даних SNP NCBI. Поліморфізм rs12979860 розташований на 3 т.п.н. вище гена інтерлейкіну 28B (IL28B), який кодує інтерферон-лямбда 3 (IFN-λ3). Наявність алеля С асоційована з кращою 1 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 відповіддю на лікування, причому генотип С/С асоційований з підвищенням ймовірності стійкої вірусологічної відповіді (SVR) у 2 рази, у 3 рази та у 2 рази, у порівнянні з генотипом Т/Т у пацієнтів з HCV європейського, африканського та іспанського походження, відповідно. Крім того, оскільки генотип С/С представлений зі значно більш високою частотою у популяції європейського походження, ніж у популяції африканського походження, поліморфізм rs12979860 пояснює важливий компонент міжпопуляційної відмінності при відповіді пацієнтів з HCV на комбіновану терапію пегильованим інтерфероном-альфа/рибавірином. Частота алеля С rs1279860 істотно знижена у групі пацієнтів, хронічно інфікованих HCV, у порівнянні з довільно вибраною популяційною групою з невідомим статусом гепатиту С, що дозволяє припустити, що алель С також асоційований з більш високою ймовірністю спонтанного кліренсу гепатиту С генотипу 1. Автори винаходу тут також визначили зв'язки між rs12979860 та іншими SNP на 19q13.13, які самі асоційовані з SVR. Два з вказаних SNP знаходяться у гені IL-28B: rs28416813, поліморфізм G/С, розташований на 37 основ вище стартового кодону ATG, і rs8103142, поліморфізм А/G, розташований у кодуючій послідовності, який приводить у результаті до явища амінокислотного поліморфізму Lys або Arg у положенні 70 амінокислотної послідовності IFN-λ3, представленої на фіг.4 (SEQ ID NO: 10). Алель А поліморфізму rs8103142 кодує Lys у положенні 70 IFN-λ3, тоді як поліморфізм G дає у результаті Arg у положенні 70. На основі нещодавно опублікованої кристалічної структури IFN-λ3 (Gad, H. H. et al., JBC 2009, розміщеної он-лайн 20 травня 2009 року як Manuscript M109.002923), автори винаходу припускають тут, що варіація Arg/Lys знаходиться у петлі AB, області, яка ймовірно бере участь у зв’язуванні IFN-λ3 з IFN-λR1. SNP у гені IL28B представляють особливий інтерес як кандидатні поліморфізми, що виражають причинну обумовленість, як кандидатні каузальні поліморфізми, оскільки експресія IFN-λ3 викликається інфікуванням HCV та іншими вірусами, і IFN-λ3 проявляє антивірусну активність in vivo (Sheppard, Р et al., Nature Immunol. 4(1):63-68 (2003); Kotenko, S. V., et al., Nature Immunology 4(1):р. 69-77 (2003); Ank, N., et al., J. Interferon & Cytokine Res. 26:373-379 (2006)). Зокрема, асоціація алеля Arg70 з більш слабкою відповіддю на IFN-α, дозволяє припустити, що наявність даного алеля негативно впливає на здатність суб'єкта виробляти важливі компоненти імунної відповіді на HCV, які беруть участь у забезпеченні SVR при терапії на основі IFN-α. Це може відбуватися у результаті зниженої функції ізоформи Arg70, у порівнянні з ізоформою Lys70, у результаті впливу ізоформи Arg70 на функцію ізоформи Lys70, або через комбінацію обох ефектів. Беручи до уваги той факт, що знижені рівні ізоформи Arg70 у сироватці крові є найбільш правдоподібним поясненням фенотипу з більш слабкою відповіддю, автори винаходу виявили, що людська клітинна лінія, сконструйована для експресії myc-міченої версії ізоформи Lys70 або ізоформи Arg70, секретує у значно більших кількостях ізоформу Lys70. SNP, асоційовані з відповіддю на терапію IFN-α, описані у таблиці 1 нижче, в якій перераховані поліморфні сайти (PS), де розташовується SNP, що ідентифікується за допомогою позначення бази даних SNP NCBI, альтернативні алелі, які виявлені у PS, алель, який асоційований з кращою відповіддю на терапію IFN-α, і гетерозиготні та гомозиготні генотипи, що містять вказаний алель, які позначаються тут як маркери відповіді на IFN-α. Таблиця 1 PS rs12979860 rs28416813 rs8103142 rs12980275 rs8099917 rs12972991 rs8109886 rs4803223 rs12980602 45 SNP Т/С G/С А/G А/G А/С Т/G А/С Т/С А/G Маркери відповіді на IFN-α Алель кращої Гетерозиготний маркер відповіді відповіді на IFN-α С генотип С/Т G генотип G/С А генотип А/G А генотип А/G А генотип А/С Т генотип Т/G С генотип С/А Т генотип Т/С А генотип А/G Гомозиготний маркер відповіді на IFN-α генотип С/С генотип G/G генотип А/А генотип А/А генотип А/А генотип Т/Т генотип С/С генотип Т/Т генотип А/А Автори винаходу припускають тут, що тестування суб'єктів на наявність одного або більше маркерів відповіді на IFN-α таблиці 1 буде корисним для ряду фармакогенетичних продуктів і методів, які включають визначення пацієнтів, які найбільш ймовірно будуть відповідати на терапію IFN-α при захворюванні, що піддається лікуванню IFN-α,для визначення суб'єктів, 2 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 хронічно інфікованих HCV, яким може бути корисним доповнення комбінованої терапії інтерфероном-альфа/рибавірином, терапією, яка збільшує рівні ізоформи Lys70 IFN-λ3, знижує рівні ізоформи Arg70 IFN-λ3 або надає обидва ефекти, і для допомоги лікарям у прийнятті рішення, чи призначати противірусну терапію пацієнту з гострою інфекцією HCV. Таким чином, в одному варіанті здійснення винахід надає фармацевтичну композицію, що містить інтерферон-альфа (IFN-α), для лікування суб'єкта, який має захворювання, що піддається лікуванню IFN-α, і позитивний результат тесту щонайменше на один маркер відповіді на IFN-α. В іншому варіанті здійснення винахід надає застосування IFN-α в одержанні лікарського препарату для лікування суб'єкта, який має захворювання, що піддається лікуванню IFN-α, і позитивний результат тесту щонайменше на один маркер відповіді на IFN-α. У ще одному варіанті здійснення винахід надає фармацевтичний продукт, який містить фармацевтичну композицію IFN-α та інструкцію-вкладиш, яка включає фармакогенетичне показання, при якому рекомендується фармацевтична композиція. Фармакогенетичне показання включає два компоненти: захворювання, що піддається лікуванню IFN-α у фармацевтичній композиції, і пацієнтів, які мають захворювання і які генетично характеризуються наявністю щонайменше одного маркера відповіді на IFN-α. Винахід також надає спосіб тестування суб'єкта на наявність або відсутність щонайменше одного маркера відповіді на IFN-α, спосіб включає одержання зразка нуклеїнової кислоти суб'єкта і аналіз зразка для визначення генотипу суб'єкта щонайменше в одному з поліморфних сайтів у таблиці 1. В іншому варіанті здійснення винахід надає спосіб тестування суб'єкта на наявність або відсутність маркера відповіді на IFN-α у PS rs8103142, спосіб включає одержання біологічного зразка суб'єкта і аналіз біологічного зразка на наявність IFN-λ3 з Lys у положенні амінокислоти 70 або на наявність IFN-λ3 з Arg у положенні амінокислоти 70. У деяких варіантах здійснення стадія аналізу включає взаємодію біологічного зразка з моноклональним антитілом, яке здатне розрізняти IFN-λ3 з Lys у положенні амінокислоти 70 і IFN-λ3 з Arg у положенні амінокислоти 70. У деяких варіантах здійснення спосіб тестування суб'єктів на наявність або відсутність маркера відповіді на IFN-α додатково включає створення звіту за результатами дослідження, в якому вказаний генотип суб'єкта у поліморфному сайті, що аналізується, і за бажанням надання звіту за результатами дослідження суб'єкту або лікарю, який лікує суб'єкта, з приводу захворювання, що піддається лікуванню IFN-α. У ще одному аспекті винахід надає набір для виявлення маркера відповіді на IFN-α у зразку нуклеїнової кислоти. Набір включає комплект з одного або більше олігонуклеотидів, сконструйованих для ідентифікації кожного з алелів у поліморфному сайті маркера відповіді IFN-α. У деяких варіантах здійснення зразок нуклеїнової кислоти є зразком, одержаним у пацієнта, який має захворювання, що піддається лікуванню IFN-α. В одному варіанті здійснення захворювання є хронічною HCV-інфекцією, суб'єкт раніше переніс трансплантацію печінки, і зразок нуклеїнової кислоти є зразком біопсії трансплантованої печінки. В іншому варіанті здійснення зразок нуклеїнової кислоти є зразком донорської печінки, яку тестують для трансплантації пацієнту з хронічною HCV-інфекцією. У ще одному варіанті здійснення винахід надає спосіб вибору терапії для лікування суб'єкта, який має захворювання, що піддається лікуванню IFN-α, що включає визначення, чи має суб'єкт щонайменше один маркер відповіді на IFN-α, і вибір терапії, виходячи з результатів стадії тестування, при якому, якщо суб'єкт має маркер відповіді на IFN-α, терапія, що вибирається, включає початкове лікування або продовжене лікування IFN-α, і, якщо суб'єкт не має маркера відповіді на інтерферон IFN-α, терапія, що вибирається, або включає введення IFN-α у комбінації щонайменше з одним іншим терапевтичним агентом, який не є IFN-α, або виключає лікування на основі IFN-α. Винахід також надає метод скринінгу для відбору суб'єктів для початкового лікування або продовженого лікування IFN-α з групи суб'єктів, яка має захворювання, що піддається лікуванню IFN-α. Вказаний метод скринінгу включає тестування кожного члена групи захворювання на наявність щонайменше одного маркера відповіді на IFN-α і відбір для лікування щонайменше одного суб'єкта, який позитивно тестується на маркер відповіді на IFN-α. У кожному з наведених вище варіантів здійснення маркер відповіді IFN-α являє собою будьякий з маркерів відповіді на IFN-α у гетерозиготному і гомозиготному стані, представлених у таблиці 1. У переважних варіантах здійснення маркер відповіді на IFN-α являє собою один з маркерів відповіді у гомозиготному стані. В одному переважному варіанті здійснення маркер відповіді на IFN-α являє собою генотип А/А у PS rs8103142 або генотип G/G у rs28416813. В 3 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інших варіантах здійснення прогноз відповіді на IFN-α базується на наявності маркера відповіді на IFN-α щонайменше для двох PS з таблиці 1. У ще одному варіанті здійснення винахід надає спосіб прогнозування, чи відповість пацієнт з хронічною HCV-інфекцією на комбіновану терапію, що включає IFN-α-2 і рибавірин. Спосіб включає одержання зразка нуклеїнової кислоти суб'єкта, оцінку зразка нуклеїнової кислоти на наявність щонайменше одного маркера відповіді на IFN-α у гомозиготному стані з таблиці 1 і проведення прогнозу на основі результатів стадії оцінки. Якщо результати тесту на наявність маркера відповіді на IFN-α у гомозиготному стані позитивні, прогнозується, що суб'єкт, ймовірно, досягне SVR, і якщо результати тесту на наявність маркера відповіді на IFN-α у гомозиготному стані негативні (наприклад, суб'єкт має генотип С/Т або генотип Т/Т у поліморфному сайті rs12979860), прогнозується, що суб'єкт, ймовірно, не досягне SVR. В одному варіанті здійснення пацієнт раніше переніс трансплантацію печінки, і зразок нуклеїнової кислоти є зразком біопсії печінки, що трансплантується. У ще одному варіанті здійснення винахід надає спосіб лікування суб'єкта з хронічною HCVінфекцією. Спосіб включає визначення генотипу суб'єкта щонайменше для одного з поліморфних сайтів таблиці 1 і призначення схеми лікування, виходячи з одержаного генотипу. Якщо генотип являє собою генотип маркерів відповіді на IFN-α у гомозиготному стані, то схема лікування включає введення суб'єкту інтерферону-альфа у комбінації з рибавірином. У деяких варіантах здійснення схема лікування суб'єкта з маркером відповіді на IFN-α у гомозиготному стані включає введення суб'єкту терапевтично ефективних кількостей пегильованого інтерферону-альфа, рибавірину і щонайменше одного іншого антивірусного агента. У деяких варіантах здійснення інший противірусний агент є інгібітором протеази HCV або інгібітором полімерази HCV. Якщо одержаний генотип не є маркером відповіді на IFN-α у гомозиготному стані (тобто є гетерозиготним або гомозиготним по алелю слабкої відповіді), то у деяких варіантах здійснення схема лікування, що призначається, включає один або більше противірусних агентів, які не є інтерфероном-альфа, і у деяких переважних варіантах здійснення такі противірусні агенти вибирають з інгібіторів протеази HCV, інгібіторів полімерази HCV і лікарських засобів, які збільшують рівні ізоформи IFN-λ3 Lys70, знижують рівні ізоформи IFN-λ3 Arg70 або роблять і те, і інше. У ще одному варіанті здійснення винахід надає фармацевтичний продукт, що містить фармацевтичну композицію IFN-λ3 Lys70 та інструкцію-вкладиш, в якій вказано, що фармацевтична композиція рекомендується для лікування суб'єкта, який інфікований HCV і має позитивний результат тесту на наявність алеля G в rs8103142. Фармацевтична композиція IFNλ3 Lys70 включає поліпептид IFN-λ3 Lys70 або вектор експресії, який кодує поліпептид IFN-λ3 Lys70. У переважних варіантах здійснення в інструкції-вкладиші додатково вказано, що фармацевтична композиція IFN-λ3 Lys70 призначена для застосування у комбінації з терапією на основі IFN-α. У ще одному варіанті здійснення винахід надає фармацевтичну композицію, яка специфічно нейтралізує активність IFN-λ3 Arg70, але не IFN-λ3 Lys70. У деяких варіантах здійснення фармацевтична композиція включає моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується і нейтралізує поліпептид, що містить амінокислоти 23-196 фіг.4 (SEQ ID NO: 10), в якому аргінін заміщений лізином у положенні амінокислоти 70, але не зв'язується з поліпептидом, що містить амінокислоти 23-196 SEQ ID NO: 10, в якому лізин представлений у положенні амінокислоти 70. В інших варіантах здійснення нейтралізуюча фармацевтична композиція включає молекулу, яка інгібує експресію IFN-λ3 Arg70, але не IFN-λ3 Lys70. У деяких варіантах здійснення молекула є антисмисловою РНК, siРНК або рибозимом. У деяких варіантах здійснення будь-яка(який) з наведених вище композицій і способів, в яких захворювання, що піддається лікуванню IFN-α, є хронічною HCV-інфекцією, хронічна HCVінфекція являє собою інфекцію з початковим високим рівнем вірусного навантаження, з генотипом HCV, вибраним з групи, що складається з генотипу 1 (G1 HCV), генотипу 3(G3 HCV) або генотипу 4 (G4 HCV). У всіх згаданих вище варіантах здійснення IFN-α переважно являє собою пегильований IFNα-2a або пегильований IFN-α-2b, і в особливо переважних варіантах здійснення IFN-α являє собою PEGASYS® (пегінтерферон α-2a) або PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b). У всіх згаданих вище варіантах здійснення пацієнт із захворюванням, що піддається лікуванню IFN-α, не відповідав відповідним чином на попередню терапію IFN-α. У всіх згаданих вище варіантах здійснення позитивний результат тесту на маркер відповіді на IFN-α може бути використаний у комбінації з наявністю одного або більше інших предикторів позитивної відповіді на терапію IFN-α для виявлення пацієнтів, які, ймовірно, будуть відповідати на початкову або продовжену терапію IFN-α. 4 UA 106756 C2 5 10 У ще одному варіанті здійснення винахід надає спосіб оцінки ймовірності того, що пацієнт, який має хронічну інфекцію HCV генотипу 1, досягне стійкої вірусологічної відповіді з використанням комбінованої терапії пегильованим IFN-α-2 і рибавірином. Спосіб включає одержання набору генетичних і клінічних предикторів відповіді пацієнта, введення одержаних предикторів у комп'ютер, в якому запускають модель логістичної регресії на основі введених предикторів для розрахунку оцінки ймовірності, і передачу оцінки ймовірності пацієнту або лікарю пацієнта, де пацієнт ідентифікує себе як афроамериканець або європеєць, де ряд генетичних і клінічних предикторів відповіді складається з генотипу пацієнта у поліморфному сайті rs12979860, початкового рівня HCV-вірусного навантаження пацієнта, визначення пацієнтом своєї етнічної приналежності і оцінки початкового рівня фіброзу у пацієнта за шкалою METAVIR, і де логістична регресійна модель являє собою: Р 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1 [  (1,7  (1,1  (1,1  1  е(1,4 G)  V) E) F)3,8] де Р: ймовірність досягнення SVR; G: генотип rs12979860: TT=0, CT=1, CC=2; V: початковий рівень вірусного навантаження: більше або дорівнює 600000 МО/мл=0, менше 600000 МО/мл=1; Е: етнічна приналежність: африканське походження=0, європейське походження=1; і F: початковий рівень фіброзу: METAVIR F3-4=0, F0-2=1. У ще одному варіанті здійснення винахід надає спосіб лікування суб'єкта, у якого діагностована гостра інфекція HCV. Спосіб включає одержання генотипу суб'єкта для PS rs12979860 і прийняття рішення про лікування на основі одержаного генотипу. Якщо генотип є гомозиготним по Т, то лікувальним рішенням є почати пацієнту антивірусну терапію. Якщо генотип є гетерозиготним по С або гомозиготним по С, то лікувальним рішенням є відкласти антивірусну терапію доти, доки у суб'єкта не буде діагностована хронічна HCV-інфекція. Короткий опис креслень Фіг.1 ілюструє результати тестів тенденції зміни генотипу одного маркера відносно важливих детермінант стійкої вірусологічної відповіді (SVR) в об'єднаній групі пацієнтів європейського, афроамериканського та іспанського походження, які хронічно інфіковані HCV генотипу 1 і одержували лікування комбінованою терапією пегінтерфероном-альфа-2/рибавірином. На верхньому і середньому графіках представлені значення р всіх генотипованих SNP (вісь Y), одержані у результаті аналізу всього геному і хромосоми 19, відповідно, і червоні вертикальні лінії вказують SNP, які показують статистично значущий зв'язок з SVR по всьому геному, червона стрілка вказує SNP rs12979860. На нижньому графіку показане положення відомих генів на хромосомі 19, позначених вертикальними смужками, при цьому деякі гени вказані за назвою, і положення гена IL-28B вказане блакитною стрілкою. Додаткові деталі представлені у прикладах. Фіг.2 ілюструє зв'язок між генотипом поліморфного сайту rs12979860 (Т/Т, Т/С або С/С) (вісь Y) і процентом пацієнтів кожного генотипу, які досягли SVR (вісь X і кругова діаграма) у різних групах пацієнтів, які хронічно інфіковані HCV генотипу 1 і одержували лікування комбінованою терапією пегінтерфероном-альфа/рибавірином. Додаткові деталі представлені у прикладах. Фіг.3 ілюструє показник стійкої вірусологічної відповіді (SVR) і частоту алеля С rs12979860 у різних етнічних групах, при цьому показники SVR пацієнтів європейського, іспанського і афроамериканського походження взяті з двох клінічних досліджень, описаних тут у прикладах, і показник SVR пацієнтів східно-азіатського походження взятий з публікації Liu, CH. et al., Pegylated interferon-alfa-2a plus ribavirin for treatment-naive Asian patients with hepatitis С virus genotype 1 infection: а multicenter, randomized controlled trial. Clin Infect Dis Al, 1260-9 (2008). Додаткові деталі представлені у прикладах. Фіг.4 ілюструє референсну амінокислотну послідовність людського попередника 28B (IFNлямбда 3): референсна послідовність зі 196 амінокислот, NCBI NP_742151.2, GI:28144901 (SEQ ID NO: 10), причому прогнозований сигнальний пептид підкреслений і локалізація положень варіантних амінокислот, описаних у базі даних SNP NCBI станом на 15 червня 2009 року, вказана виділеними буквами у референсній послідовності, і позначення варіантного алеля вказане виділеною буквою під положенням варіантної амінокислоти. Фіг.5 ілюструє знижену секрецію ізоформи IFN-λ3 Arg70 у порівнянні з ізоформою IFN-λ3 Lys70, коли вони експресовані у вигляді myc-мічених конструкцій у клітинах T293, причому на фіг.5A зображений забарвлений Кумасі блакитним гель загального білка, представленого у супернатанті через 48 годин після трансфекції вказаною експресійною конструкцією, і на фіг.5B представлений вестерн-блотинг здвоєного гелю, дослідженого за допомогою антитіла анти-myc. 5 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Докладний опис винаходу I. Визначення З метою полегшення розуміння винаходу нижче наводяться наступні технічні і наукові терміни. За винятком випадків, особливо вказаних в іншому місці у цьому документі, всі інші технічні і наукові терміни, що застосовуються тут, використовуються у значенні, що звичайно розуміється фахівцем у галузі, якої стосується винахід, якщо терміни застосовують у контексті, подібному до контексту, що використовується тут. У даному контексті, включаючи додану формулу винаходу, визначення в однині включають відповідні їх згадки у множині, якщо з контексту не випливає чітко інше. "Приблизно", коли використовується для визначення параметра, що кількісно задається, наприклад, дози терапевтичного агента, що розглядається тут, або тривалості часу лікування, означає, що параметр може змінюватися на 10% більше або менше від вказаного числового значення для даного параметра. Наприклад, доза приблизно 1,5 мкг/кг PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b), що використовується при лікуванні пацієнтів з HCV, може змінюватися від 1,30 до 1,65 мкг/кг. "Алель" являє собою визначену форму гена або іншого генетичного локусу, відмінну від інших форм своєю специфічною нуклеотидною послідовністю, термін "алель" також включає один з альтернативних поліморфізмів (наприклад, SNP), що виявляють у поліморфному сайті. "Сприятливий результат" означає бажаний клінічний результат лікування IFN-α, включаючи без обмеження: зменшення одного або більше симптомів захворювання, зниження ступеню захворювання (наприклад, зниження вірусного навантаження), стабільний (тобто такий, що не погіршується) стан захворювання, сповільнення прогресування захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення стану захворювання, продовження виживаності (у порівнянні з очікуваною виживаністю за відсутності лікування), безрецидивну виживаність, ремісію (часткову або повну) і видужання (тобто усунення захворювання). Термін "складається по суті з" і варіанти, такі як "складаються по суті з" або "що складається по суті з", які використовують в описі та у формулі винаходу, показують включення будь-яких перерахованих елементів або групи елементів і необов'язкове включення інших елементів, подібної або іншої природи, ніж перераховані елементи, які не змінюють фактично початкові або нові властивості вказаного режиму дозування, способу або композиції. "Суб'єкт" або "тварина", або "пацієнт", або "ссавець" означає будь-якого суб'єкта, особливо суб'єкта-ссавця, якому потрібні або можуть бути корисні будь-які із заявлених композицій і способів. У переважних варіантах здійснення суб'єкт є людиною. У більш переважних варіантах здійснення суб'єкт є дорослою людиною, тобто щонайменше у віці 18 років. "Відповідь на IFN-α" означає бажаний клінічний результат лікування IFN-α, включаючи, але без обмеження: зменшення одного або більше симптомів захворювання, зниження ступеню захворювання (наприклад, зниження вірусного навантаження), стабільний (тобто такий, що не погіршується) стан захворювання, сповільнення прогресування захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення стану захворювання, продовження виживаності (у порівнянні з очікуваною виживаністю за відсутності лікування), безрецидивну виживаність, ремісію (часткову або повну) і видужання (тобто усунення захворювання). "Не лікований раніше IFN-α" означає, що суб'єкт або пацієнт, якого лікують або перевіряють відповідно до будь-якого з варіантів здійснення, описаних тут, не одержував раніше лікування яким-небудь IFN-α, включаючи який-небудь експериментальний або затверджений фармацевтичний продукт IFN-α. "Інтерферон-лямбда 3" або "IFN-λ3" означає поліпептид, що містить амінокислоти 23-196 SEQ ID NO: 10 (безперервно розташовані амінокислоти на фіг.4), і включає алельні варіанти SEQ ID NO: 10, що зустрічаються у природі, в яких референсна амінокислота в одному або більше варіантних положеннях, показаних на фіг.4, замінена варіантною амінокислотою. Поліпептид IFN-λ3 Lys70 є ізоформою IFN-λ3, що має лізин у положенні амінокислоти 70 фіг.3, і поліпептид IFN-λ3 Arg70 є ізоформою IFN-λ3, що має аргінін у положенні амінокислоти 70 фіг.4. У контексті терапевтичних композицій і способів, описаних тут, термін "поліпептид IFN-λ3 Lys70" включає похідні, в яких головний амінокислотний ланцюг ковалентно з’єднаний з іншими молекулами для забезпечення однієї або більше бажаних властивостей, таких як збільшений час напівжиття in vivo або знижена імуногенність. Необмежувальні приклади похідних поліпептиду IFN-λ3 Lys70, застосовних у даному винаході, включають глікозиловані похідні, пегильовані похідні і гібридні білки поліпептиду IFN-λ3 Lys70 і неінтерфероновий білок, такий як людський сироватковий альбумін або IgG. У контексті терапевтичних композицій і способів, описаних тут, термін "поліпептид IFN-λ3 Lys70" також включає цистеїнові мутанти, в яких один або більше з семи залишків цистеїну SEQ ID NO: 10 заміщений іншою амінокислотою, щоб 6 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полегшити рекомбінантне одержання композиції IFN-λ3 Lys70, що містить приклад одного дисульфідного зв'язку, як описано у патенті США № 7517961. Переважні цистеїнові мутанти включають заміну другого або третього залишків Cys SEQ ID NO: 10 серином, аланіном, треоніном, валіном або аспарагіном. "Фармацевтична композиція IFN-λ3 Lys70" означає фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або середовище для лікарського засобу і або (1) поліпептид IFN-λ3 Lys70, або (2) вектор експресії, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид IFN-λ3 Lys70, функціонально зв'язану з промоторною послідовністю, яка здатна запустити експресію поліпептиду IFN-λ3 Lys70 щонайменше в одній тканині людини. У переважних варіантах здійснення тканина людини є печінковою тканиною. "Виділений" звичайно використовується, щоб відобразити стан очищення біологічної молекули, такої як РНК, ДНК, олігонуклеотид або білок, і в такому контексті означає молекулу, яка по суті не містить інших біологічних молекул, таких як нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, вуглеводи або інші речовини, такі як продукти розпаду клітин і середовища зростання. Як правило, термін "виділений" не призначений для позначення повної відсутності інших біологічних молекул або речовин, або відсутності води, буферів або солей, якщо тільки вони не представлені у кількостях, які по суті не заважають способам даного винаходу. "Локус" стосується положення на хромосомі або молекулі ДНК, що відповідає гену, фізичній ознаці, такій як поліморфний сайт, або положенню, пов'язаному з фенотипічною ознакою. "Нуклеотидна пара" являє собою набір з двох нуклеотидів (які можуть бути однаковими або різними), які виявляються у поліморфному сайті на двох копіях хромосоми суб'єкта. "Олігонуклеотид" стосується нуклеїнової кислоти, яка звичайно має у довжину від 5 до 100 безперервних основ, і найчастіше 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30 або 20-25 безперервних основ у довжину. Послідовність олігонуклеотиду може бути розроблена для специфічної гібридизації з будь-якою з алельних форм локусу; такі олігонуклеотиди позначаються як алель-специфічні зонди. Якщо локус являє собою PS, що містить SNP, комплементарний алель для такого SNP може знаходитися у будьякому положенні в алель-специфічному зонді. Інші олігонуклеотиди, що застосовуються у використанні на практиці винаходу, специфічно гібридизуються з областю-мішенню поряд з PS, своїм 3'-кінцем, розташованим на відстані приблизно від одного і не більше 10 нуклеотидів від PS, переважно приблизно 5 нуклеотидів. Такі олігонуклеотиди, що гібридизуються поряд з PS, використовуються у методах подовження праймеру, опосередкованого полімеразою і позначаються тут як "олігонуклеотиди подовження праймерів". У переважному варіанті здійснення 3'-кінець олігонуклеотиду подовження праймеру являє собою дезоксинуклеотид, комплементарний нуклеотиду, що безпосередньо прилягає до PS. "Парентеральне введення" означає внутрішньовенну, підшкірну або внутрішньом'язову ін'єкцію. "Фармацевтично прийнятний" стосується молекулярних субстанцій і композицій, які "звичайно вважаються безпечними" - наприклад, які фізіологічно переносяться і звичайно не викликають алергічної або подібної небажаної реакції, такої як шлунковий розлад і т.п., при введенні людині. В іншому варіанті здійснення вказаний термін стосується молекулярних субстанцій і композицій, схвалених регуляторним органом федерального або державного уряду, або перерахованих у фармакопеї США, або в іншій загальновизнаній фармакопеї для застосування у тварин, і зокрема, у людини. "Поліморфний сайт" або "PS" стосується положення у генетичному локусі або у гені, в якому виявляється поліморфізм, наприклад, однонуклеотидний поліморфізм (SNP), поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів (RFLP), число, що варіює, тандемних повторів (VNTR), динуклеотидний повтор, тринуклеотидний повтор, тетрануклеотидний повтор, простий повтор послідовності, вбудований елемент, що переміщується, такий як Alu, і делеція або вставка одного або більше нуклеотидів. У цікавлячій популяції звичайно PS передують і за ними йдуть високо консервативні послідовності, і таким чином, положення PS звичайно виявляють відносно консенсусної послідовності нуклеїнової кислоти, що складається з тридцяти - шістдесяти нуклеотидів, що передують і завершують PS, яка у випадку SNP звичайно позначається як "контекстна послідовність SNP". Положення PS також може бути визначене за його локалізацією у консенсусній або референсній послідовності відносно ініціюючого кодону (ATG) трансляції білка. Фахівець у даній галузі розуміє, що локалізація конкретного PS може виявитися не точно у тому самому положенні, як у референсній або контекстній послідовності, у кожного суб'єкта цікавлячої популяції через присутність у суб'єкта однієї або більше вставок або делецій, у порівнянні з консенсусною або референсною послідовністю. Крім того, для фахівця у даній галузі є звичайною процедурою створення надійних, специфічних і точних тестів для 7 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 виявлення альтернативних алелів у поліморфному сайті у будь-якого даного суб'єкта, якщо фахівцю у даній галузі відомі альтернативні алелі у PS, які треба виявити, і контекстна або референсна послідовність, або обидві вказані послідовності, в яких присутній PS. Таким чином, фахівцю у даній галузі буде зрозуміло, що визначення локалізації будь-якого PS, описаного тут, на основі конкретного положення у референсній або у контекстній послідовності (або з врахуванням кодону ініціації у такій послідовності) є лише для зручності, і що будь-яке специфічно пронумероване положення нуклеотиду у даному значенні включає будь-яке положення нуклеотиду того самого PS, який фактично розташовується у тому самому локусі у суб'єкта, якого перевіряють на наявність або відсутність генетичного маркера винаходу із застосуванням якого-небудь з методів генотипування, описаних тут, або інших методів генотипування, добре відомих у даній галузі. "Лікувати" або "лікування" означає введення терапевтичного агента, такого як композиція, що містить будь-який з білків інтерферону-альфа, описаних тут, всередину або зовнішньо суб'єкту, який потребує терапевтичного агента. Суб'єкти, які потребують агента, включають суб'єктів, які вже мають або характеризуються високим ризиком розвитку стану або порушення, що піддається лікуванню агентом, а також суб'єктів, які вже мають або характеризуються високим ризиком розвитку одного або більше несприятливих ефектів лікування першим терапевтичним агентом, які можуть бути ослаблені другим терапевтичним агентом. Звичайно терапевтичний агент вводять у терапевтично ефективній кількості, яка означає оптимальну кількість, щоб одержати один або більше сприятливих результатів. Терапевтично ефективна кількість визначеного агента може змінюватися відповідно до факторів, таких як стан хвороби, вік і вага пацієнта, якого лікують, і сприйнятливість пацієнта, наприклад, здатність відповідати на терапевтичний агент. Чи був досягнутий сприятливий результат або клінічний результат може бути оцінено за допомогою якого-небудь клінічного вимірювання, що звичайно використовується лікарями або іншими медичними співробітниками, щоб визначити наявність, тяжкість або стан прогресування заданого захворювання, симптому або побічного ефекту. Як правило, терапевтично ефективна кількість агента буде приводити у результаті до поліпшення відповідного клінічного вимірювання (вимірювань) у порівнянні з початковим станом, або у порівнянні з очікуваним станом за відсутності лікування, щонайменше на 5%, звичайно щонайменше на 10%, частіше щонайменше на 20%, найчастіше щонайменше на 30%, переважно щонайменше на 40%, більш переважно щонайменше на 50%, найбільш переважно щонайменше на 60%, в ідеальному випадку щонайменше на 70%, у більш ідеальному випадку щонайменше на 80% та у найбільш ідеальному випадку щонайменше на 90%. У той час, як варіант здійснення даного винаходу (наприклад, спосіб лікування або готовий виріб) може не досягати бажаного клінічного сприятливого впливу або результату у кожного пацієнта, він повинен забезпечувати його у статистично значущого числа пацієнтів, яке визначають за допомогою будь-якого статистичного критерію, відомого у даній галузі, наприклад, t-критерію 2 Стьюдента, χ - критерію, U-критерію Мана-Уїтні, критерію Крускала-Уоліса (Н-критерій), критерію Джонкхієра-Терпстра і критерію Уїлкоксона. "Вірусне навантаження" у контексті лікування хронічної HCV-інфекції означає кількість РНК HCV у сироватці крові пацієнта (що також позначається у даній галузі і тут як РНК HCV у сироватці крові і вірусне навантаження HCV). Вірусне навантаження визначають переважно за допомогою кількісного аналізу ПЛР-РЧ, наприклад, такого як аналіз, описаний тут у розділі "Приклади", або за допомогою будь-якого іншого аналізу, в якому використовується інший, але загальноприйнятий у даній галузі метод, який забезпечує аналогічний або подібний результат. Більш переважно, аналіз ПЛР-РЧ, що застосовується для вимірювання вірусного навантаження HCV суб'єкта, має нижню межу виявлення (LLQ) приблизно 29 міжнародних одиниць/мл (IU/мл) або менше. Кількісне визначення вірусного навантаження HCV пацієнта на початковому рівні та у різні моменти часу під час застосування антивірусної терапії використовується, щоб визначити, чи має пацієнт високий початковий рівень вірусного навантаження, вказаний у даному документі, і встановити фенотип вірусологічної відповіді пацієнта, включаючи будь-який з фенотипів вірусологічної відповіді, описаних тут. "Початковий рівень вірусного навантаження" означає рівень РНК HCV у сироватці крові до початку терапії одним або більше противірусними агентами. "Високий початковий рівень вірусного навантаження" означає кількість РНК HCV, відповідно до якої, як звичайно розуміють у даній галузі, пацієнта класифікують як такого, який відчуває складності у лікуванні хронічної вірусної інфекції HCV. Два значення початкового рівня вірусного навантаження, які використовували для класифікації пацієнтів як важких для лікування, у контексті непрямої терапії пегінтерфероном-альфа/рибавірином, становлять >600000 МО/мл і >800000 МО/мл. 8 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Останнім часом вірусне навантаження, що застосовується для класифікації пацієнтів як складних для лікування, становить >400000 МО/мл. "Рівень, що не визначається, РНК HCV" означає, що РНК HCV не визначався при використанні тесту ПЛР-РЧ з нижньою межею виявлення (LLD) приблизно 10 МО/мл або менше, або із застосуванням будь-якого іншого тесту, в якому застосовується інша методика, але який є загальноприйнятим у даній галузі і забезпечує еквівалентну або подібну чутливість. "Вірусологічна відповідь" у контексті лікування хронічної HCV-інфекції означає зниження рівня РНК HCV у сироватці крові після початку антивірусної терапії. У деяких варіантах здійснення антивірусна терапія включає інтерферон-альфа. В інших варіантах здійснення терапія включає інтерферон-альфа і один або більше додаткових противірусних агентів. Комбінована терапія, яка включає інтерферон-альфа, часто позначається у даній галузі як терапія на основі інтерферону-альфа. В інших варіантах здійснення вірусологічна відповідь, яку вимірюють, є відповіддю на антивірусну терапію, яка не включає інтерферон-альфа. Переважні фенотипи вірусологічної відповіді являють собою швидку вірусологічну відповідь (RVR), ранню вірусологічну відповідь (EVR), вірусологічну відповідь на лікування (ETR), стійку вірусологічну відповідь (SVR), повільну відповідь, нульову відповідь, відсутність відповіді (NR) і рецидив. Визначення і моменти часу для оцінки вказаних фенотипів відповіді описані нижче. У деяких варіантах здійснення лікування HCV включає ввідний період непрямої антивірусної терапії, такої як комбінована терапія пегінтерферономальфа/рибавірином, з подальшою "прямою антивірусною терапією", яка використовується тут, що означає, що терапія включає введення щонайменше одного прямого противірусного агента, такого як інгібітор протеази HCV, необов'язково у комбінації з одним або більше непрямими противірусними агентами, такими як пегильований інтерферон і рибавірин. У таких багатофазних схемах лікування моменти часу вірусологічної відповіді, описані нижче, не включають ввідний період лікування; скоріше, вони стосуються тривалості лікування з прямою антивірусною терапією. "Швидка вірусологічна відповідь" або "RVR" у контексті непрямої антивірусної комбінованої терапії, яка, наприклад, включає пегильований інтерферон-альфа і рибавірин, означає рівень, що не визначається, РНК HCV у сироватці крові у кінці чотирьох тижнів лікування. "Рання вірусологічна відповідь" або "EVR" означає зменшення РНК HCV у сироватці крові більше або таке, що дорівнює 2 log у кінці 12 тижнів антивірусної терапії, при цьому "повна EVR" означає рівень, що не визначається, РНК HCV у сироватці крові у кінці 12 тижнів антивірусної терапії. "Відповідь на лікування" або "ETR" означає рівень, що не визначається, РНК HCV у сироватці крові після закінчення антивірусної терапії, і переважно після закінчення будь-якої зі схем лікування, описаних тут або при закінченні будь-якої схеми лікування, рекомендованої в інструкції-вкладиші, схваленій регуляторними органами. Необмежувальними прикладами моментів часу ETR є 12, 16, 24, 36 і 48 тижнів. "Стійка вірусологічна відповідь" або "SVR" означає рівень, що не визначається, РНК HCV у сироватці крові при завершенні антивірусної терапії і максимум через 24 тижні після закінчення антивірусної терапії. У деяких варіантах здійснення SVR вимірюють через 12 тижнів після закінчення антивірусної терапії. SVR також описується у публікації Dr. Steven L. Flamm у the Journal of the American Medical Association, Vol. 289, No. 18, pp. 2413 to 2417 (2003). "Повільна відповідь" у контексті комбінованої терапії пегильованим інтерферономальфа/рибавірином означає знижений більше або такий, що дорівнює 2 log, але рівень, що ще визначається, РНК HCV у сироватці крові у кінці 12 тижня антивірусної терапії і рівень, що не визначається, РНК HCV у сироватці крові у кінці 24 тижня антивірусної терапії. "Нульова відповідь" означає зменшення менше 1 log рівня РНК HCV у сироватці крові і/або зменшення менше 2 log рівня РНК HCV у сироватці крові після 4 тижнів і після 12 тижнів антивірусної терапії відповідно. "Відсутність відповіді" або "NR" означає наявність рівня, що визначається, РНК HCV протягом як мінімум 12 тижнів антивірусної терапії. Фенотип, що відповідає відсутності відповіді, звичайно встановлюють, якщо рівень РНК HCV у сироватці крові визначається у кінці 4 тижня та у кінці 12 тижня антивірусної терапії. "Рецидив" означає наявність рівня, що визначається, РНК HCV у будь-який час після відповіді на лікування (ETR), включаючи, але без обмеження у 12 або у 24 тижні після ETR. II. Застосування маркерів відповіді на IFN-α винаходу Фенотипічний ефект маркерів відповіді, що описуються тут, забезпечує використання вказаних маркерів у ряді комерційних застосувань, включаючи, але без обмеження, клінічні випробування досліджуваних або раніше схвалених лікарських засобів інтерферону-альфа у 9 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 пацієнтів, вибраних на основі наявності або відсутності одного або більше вказаних маркерів, фармацевтичні композиції і фармацевтичні продукти, що містять інтерферон-альфа для лікування пацієнтів, які мають щонайменше один з вказаних маркерів відповіді, діагностичні методи і фармакогенетичні методи лікування, які включають індивідуалізацію лікарської терапії пацієнта, виходячи з того, має пацієнт один або більше вказаних маркерів. Корисність будь-якого з комерційних застосувань, заявлених тут, не вимагає, щоб взаємозв'язок між наявністю генетичного маркера винаходу і появою бажаної відповіді на інтерферон-альфа спостерігався у 100% суб'єктів, які одержують інтерферон-альфа; також не вимагає, щоб діагностичний спосіб або набір мав визначену міру специфічності або чутливості у визначенні наявності або відсутності маркера відповіді у кожного суб'єкта, також не вимагає, щоб діагностичний спосіб, заявлений тут, був 100% точним при прогнозуванні для кожного суб'єкта, чи буде він мати сприятливу відповідь на інтерферон-альфа. Таким чином, автори винаходу мають на увазі тут, що терміни "визначити", "визначення" і "прогнозування" не треба інтерпретувати як такі, що вимагають остаточного або визначеного результату; навпаки, вказані терміни потрібно тлумачити як такі, що вказують, що заявлений спосіб забезпечує точний результат для більшості суб'єктів або що результат або прогноз для будь-якого даного суб'єкта більш ймовірно є правильним, ніж неправильним. Переважно, точність результату, передбачена діагностичним способом винаходу, являє собою точність, яку фахівець у даній галузі або регуляторний орган розглядав би як придатну для конкретного застосування, в якому використовується метод. Аналогічним чином, корисність заявлених фармацевтичних продуктів і способів лікування не вимагає, щоб вони викликали заявлений або бажаний ефект у кожного суб'єкта; все, що потрібно, це щоб лікар, при висловленні своєї професійної думки відповідно до всіх застосовуваних норм, визначав, що шанс досягнення заявленого ефекту лікування даного суб'єкта згідно із заявленим способом або за допомогою заявленого фармацевтичного продукту є досить високим, щоб обґрунтувати призначення лікування або фармацевтичного продукту. А. Тестування на маркери відповіді на IFN-α винаходу Наявність або відсутність маркера відповіді на IFN-α може бути виявлена за допомогою будь-якого з ряду методів генотипування, що звичайно застосовуються у даній галузі. Як правило, у таких методах генотипування використовуються один або більше олігонуклеотидів, які комплементарні області, що містить або розташована поряд з PS, що представляє інтерес. Послідовність олігонуклеотиду, що застосовується для генотипування визначеного PS, що представляє інтерес, звичайно розробляють на основі контекстної послідовності PS. Локалізація у конкретного суб'єкта будь-якого з поліморфних сайтів, вказаних у таблиці 1, являє собою положення, що відповідає локалізації PS, що представляє інтерес, у референсній кодуючій або геномній послідовності ДНК, що оточує PS, який представляє інтерес, або в одній з контекстних послідовностей, описаних у таблиці 2 нижче, або в їх комплементарних послідовностях. Більш довгі контекстні послідовності, що використовуються при конструюванні олігонуклеотидів для генотипу PS таблиці 1, являють собою контекстні послідовності, зареєстровані у базі даних SNP NCBI станом на 19 травня 2009 року. Референсні кодуючі і амінокислотні послідовності IFN-λ3 являють собою послідовності, представлені у GenBank з номером доступу AY129149 (Version Y129149.1, GI:25527104) у базі даних нуклеотидних послідовностей NCBI станом на 19 травня 2009 року. PS rs12979860 rs28416813 rs8103142 rs12980275 rs8099917 rs12972991 Таблиця 2 Контекстні послідовності для SNP, асоційованих з відповіддю на IFN-α 1 Коротка контекстна послідовність SEQ ID NO CTGAACCAGGGAGCTCCCCGAAGGCG 1 YGAACCAGGGTTGAATTGCACTCCGC CAGAGAGAAAGGGAGCTGAGGGAATG 2 SAGAGGCTGCCCACTGAGGGCAGGGG TCCTGGGGAAGAGGCGGGAGCGGCAG 3 YTGCAGTCCTTCAGCAGAAGCGACTC CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAAAC 4 RGACGTGTCTAAATATTTGCCGGGGT CTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAAT 5 KTCACCCAAATTGGAACCATGCTGTA AGAACAAATGCTGTATGATTCCCCCT 6 MCATGAGGTGCTGAGAGAAGTCAAAT 10 UA 106756 C2 rs8109886 rs4803223 rs12980602 TATTCATTTTTCCAACAAGCATCCTG MCCCAGGTCGCTCTGTCTGTCTCAAT CCTAAATATGATTTCCTAAATCATAC RGACATATTTCCTTGGGAGCTATACA TCATATAACAATATGAAAGCCAGAGA YAGCTCGTCTGAGACACAGATGAACA 7 8 9 1 Контекстні послідовності, описані у базі даних SNP NCBI на 20 травня 2009 року; Y означає С або Т, S означає G або С, R означає G або А, K означає G або Т, M означає А або С. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Як зрозуміло фахівцю у даній галузі, зразки нуклеїнової кислоти, що містять визначений PS, можуть являти собою комплементарні двохланцюжкові молекули, і таким чином, посилання на визначений сайт на смисловому ланцюгу також стосується відповідного сайту на комплементарному антисмисловому ланцюгу. Аналогічним чином, посилання на визначений генотип, одержаний для PS на обох копіях одного ланцюга хромосоми, є рівнозначним відносно комплементарного генотипу, одержаного для того самого PS на обох копіях іншого ланцюга. Таким чином, генотип А/А для PS rs8103142 на кодуючому ланцюгу гена IL28B еквівалентний генотипу Т/Т вказаного PS некодуючого ланцюга. Контекстні послідовності, перераховані тут, а також їх комплементарні послідовності, можуть бути використані для побудови зондів і праймерів для генотипування поліморфних сайтів таблиці 1 у зразку нуклеїнової кислоти, одержаному від суб'єкта-людини, яка представляє інтерес, із застосуванням будь-якого з множини методів, добре відомих у даній галузі, який дозволяє визначити, є суб'єкт гетерозиготним або гомозиготним по алелю кращої відповіді, встановленому у таблиці 1. Молекули нуклеїнової кислоти, що використовуються у таких методах, звичайно включають РНК, геномну ДНК або кДНК, одержану з РНК. Як правило, методи генотипування включають аналіз зразка нуклеїнової кислоти, виділеної з біологічного зразка, одержаного у суб'єкта, для визначення природи нуклеотиду або нуклеотидної пари, представленої в одному або більше поліморфних сайтах, що представляють інтерес. Зразки нуклеїнової кислоти можуть бути одержані практично з будьякого біологічного зразка. Наприклад, придатні зразки включають сироватку суцільної крові, сім’яну рідину, слину, сльози, калові маси, сечу, піт, букальний матеріал, шкіру і волосся. Соматичні клітини є переважними, оскільки вони дозволяють проводити визначення природи обох алелів, представлених у PS, що представляє інтерес. Зразки нуклеїнової кислоти можуть бути одержані для аналізу із застосуванням методу, відомого фахівцям у даній галузі. Переважно, такі методи дають у результаті виділення геномної ДНК, досить чистої для визначення генотипу бажаного поліморфного сайту (сайтів) молекули нуклеїнової кислоти. Для збільшення чутливості і специфічності вказаного визначення, часто бажано ампліфікувати зі зразка нуклеїнової кислоти область-мішень, що містить PS, який треба генотипувати. Методи виділення і ампліфікації нуклеїнової кислоти можна знайти, наприклад, у публікації Sambrook, et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (2001). Будь-який метод ампліфікації, відомий фахівцю у даній галузі, може бути використаний у здійсненні даного винаходу, включаючи, але без обмеження, методи полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Реакція ПЛР може бути проведена з використанням матеріалів і методів, відомих фахівцям у даній галузі (Дивіться загалом, PCR Technology: Prrnczals and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N. Y., 1992); PCR Protocols: А Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Matilla et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1: 17 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); і патент США № 4683202. Інші придатні методи ампліфікації включають лігазну ланцюгову реакцію (LCR) (дивіться Wu and Wallace, Genomics 4: 560 (1989) і Landegren et al., Science 241:1077 (1988)), ампліфікацію за допомогою транскрипції (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173 (1989)), реплікацію послідовностей, що самопідтримується (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)); ізотермічні методи (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-6 (1992)); і ампліфікацію, що базується на послідовності нуклеїнових кислот (NASBA). Ампліфіковану область-мішень аналізують, щоб визначити природу щонайменше одного з алелів, представлених у PS в області-мішені. Якщо обидва алелі локусу представлені в ампліфікованій мішені, фахівцю у даній галузі буде зрозуміло, що тільки один алель буде 11 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначатися у PS у суб'єктів, які є гомозиготними у вказаному PS, тоді як два різних алелі будуть виявлятися, якщо суб'єкт є гетерозиготним по вказаному PS. Алель можна ідентифікувати безпосередньо, шляхом позитивної ідентифікації, або за допомогою логічного висновку, шляхом негативної ідентифікації. Наприклад, якщо відомо, що SNP відповідає гуаніну або цитозину у референсній популяції, PS можна визначити шляхом позитивної ідентифікації як гуанін або цитозин, якщо суб'єкт є гомозиготним по вказаній ділянці, або як і гуанін, і цитозин, якщо суб'єкт є гетерозиготним по вказаній ділянці. Альтернативно, PS можна визначити шляхом негативної ідентифікації, як такий, що на є гуаніном (тобто цитозин/цитозин), і не є цитозином (тобто гуанін/гуанін). Ідентифікація алеля або пари алелів (наприклад, двох нуклеотидів у випадку SNP) у PS у зразку нуклеїнової кислоти, одержаному у суб'єкта, може бути виконана з використанням будьякої методики, відомої фахівцям у даній галузі. Переважні методики дозволяють швидкий, точний аналіз множини PS з мінімальною обробкою проб. Деякі приклади придатних методик включають, але без обмеження, пряме секвенування ДНК ампліфікованої області-мішені, капілярний електрофорез, гібридизацію алель-специфічних зондів, аналіз одноланцюжкового конформаційного поліморфізму, електрофорез у градієнті денатуруючого гелю, гельелектрофорез з градієнтом температури, виявлення невідповідностей у послідовностях; олігонуклеотидні мікрочипи, специфічне подовження праймерів, виявлення за допомогою білків та інші методики, добре відомі у даній галузі. Дивіться, наприклад, Sambrook, et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (2001); Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York) (1997); Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 2766-2770 (1989); Humphries et al., in MOLECULAR DIAGNOSIS OF GENETIC DISEASES, Elles, ed., pp. 32 1-340, 1996; Wartell et al., Nucl. Acids Res. 18:2699-706 (1990); Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662; Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232-6 (1989); Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7575 (1985); Myers et al. (1985) Nature 313:495; Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem. 265: 12753; Modrich, Ann. Rev. Genet. 25:229-53 (1991); патент США № 6300063; патент США № 5837832; патент США № 5459039; і HuSNP Mapping Assay, reagent kit and user manual, Affymetrix Part No. 90094 (Affymetrix, Santa Clara, CA). У переважних варіантах здійснення природу алеля (алелів) у PS визначають із застосуванням методу подовження праймеру із застосуванням полімерази. Такі методи описані у патентній і науковій літературі, і включають метод аналізу генетичної інформації або подовження на твердій фазі "Genetic Bit Analysis" (WO 92/15712) і аналіз генетичної інформації за допомогою лігази/полімерази (патент США № 5679524). Пов'язані методи розкриті у міжнародних патентах WO 91/02087, WO 90/09455, WO 95/17676, та у патентах США № 5302509 і № 5945283. Подовжені праймери, що містять ділянку, комплементарну поліморфізму, можна виявити за допомогою мас-спектрометрії, як описано у патенті США № 5605798. В іншому методі подовження праймеру використовується алель-специфічна ПЛР (Ruano, G. et al., Nucl. Acids Res. 17:8392 (1989); Ruano, G. et al., Nucl. Acids Res. 19:6877-82 (1991); WO 93/22456; Turki et al., J. Gun. Invest. 95:1635-41 (1995)). Крім того, множинні PS можна дослідити шляхом одночасного ампліфікування множини областей нуклеїнової кислоти із застосуванням наборів алель-специфічних праймерів, як описано у міжнародному патенті WO 89/10414. Ще в одному методі подовження праймеру для визначення і аналізу поліморфізму використовується подовження на одну основу (SBE) флуоресцентно-міченого праймеру, об'єднане з резонансним перенесенням енергії флуоресценції (FRET) між міткою основи, що додається, і міткою праймеру. Як правило, у методі, такому як метод, описаний Chen et al., Рroc. Nat. Acad. Sci. 94:10756-61 (1997), використовується локус-специфічний олігонуклеотидний праймер, мічений на 5'-кінці 5-карбоксифлуоресцеїном (FAM). Вказаний мічений праймер сконструйований так, що 3'-кінець безпосередньо прилягає до поліморфного сайту, що представляє інтерес. Мічений праймер гібридизується з локусом, і подовження на одну основу міченого праймеру здійснюється флуоресцентно-міченими дидезоксирибонуклеотидами (ddNTP) з термінацією послідовності у присутності барвника, причому дезоксирибонуклеотиди не представлені. Збільшення флуоресценції доданого ddNTP у відповідь на збудження при довжині хвилі міченого праймеру використовується, щоб зробити висновок про природу доданого нуклеотиду. Переважним тестом для генотипування є TaqMan® SNP Genotyping Assay від Applied Biosystems або тест, що характеризується приблизно такою ж надійністю, точністю і специфічністю. У всіх згаданих вище методах точність і специфічність тесту, розробленого для визначення природи алеля (алелів) в якому-небудь PS, звичайно підтверджують шляхом виконання тесту 12 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 на зразках ДНК, в яких природа алеля (алелів) у вказаному PS відома. Переважно, зразок, що представляє кожний можливий алель, включають у процес валідації. Для диплоїдних локусів, таких як локуси на аутосомній і на X-хромосомах, перевірочні зразки, як правило, включають зразок, який є гомозиготним по головному алелю PS, зразок, який є гомозиготним по мінорному алелю PS, і зразок, який є гетерозиготним у вказаному PS. Вказані перевірочні зразки, як правило, також включають як контролі, при виконанні тесту з дослідним зразком (тобто зразок, в якому природа алеля (алелів) PS невідома). Специфічність тесту також можна підтвердити шляхом порівняння результату тесту дослідного зразка з результатом, одержаним для того самого зразка за допомогою іншого типу тесту, наприклад, за допомогою визначення послідовності ампліфікованої області-мішені, яка, як вважають, містить PS, що представляє інтерес, порівняння встановленої послідовності з контекстними послідовностями, загальновідомими у даній галузі, такими як контекстні послідовності, надані в описі. Довжина контекстної послідовності, необхідна для доказу, що перевіряється правильне положення у геномі, буде змінюватися з врахуванням унікальності послідовності в областімішені (наприклад, може бути одна або більше високо гомологічних послідовностей, розташованих в інших областях геному). Фахівець у даній галузі може без великих зусиль визначити відповідну довжину контекстної послідовності для будь-якого PS, використовуючи відомі прийоми, такі як порівняння за допомогою програми BLAST контекстної послідовності з послідовностями із загальнодоступних баз даних. Для ампліфікованих областей-мішеней, які забезпечують перший рівень специфічності, розгляд контекстної послідовності приблизно з 3060 основ на кожній стороні PS у відомих зразках, як правило, є достатнім, щоб гарантувати специфічність виконання тесту для PS, що представляє інтерес. Іноді валідований тест може не дати однозначного результату для дослідного зразка. Звичайно, це результат зразка, що містить ДНК невідповідної чистоти або якості, і неоднозначний результат звичайно одержують при повторному очищенні або повторному виділенні зразка ДНК, або при тестуванні зразка за допомогою іншого типу аналізу. Крім того, при виконанні будь-якого з описаних тут методів, які вимагають визначення наявності або відсутності визначеного маркера відповіді на IFN-α, таке визначення може бути виконане шляхом одержання довідкової інформації зі сховища даних, яке містить достатню інформацію про набір генів пацієнта, щоб визначити, чи має пацієнт маркер, що представляє інтерес. Переважно, сховище даних реєструє, який маркер(и) відповіді на IFN-α присутній і відсутній у суб'єкта. Сховище даних повинно містити особисті історії хвороби, карту клінічних даних, файл (наприклад, не структурований ASCII файл), доступний комп'ютеру або іншому електронному або неелектронному носію, на якому може зберігатися відповідна інформація або генетичні дані. Карта клінічних даних, що використовується тут, є портативним запам'ятовуючим пристроєм, таким як магнітна карта, смарт-карта, яка має вбудований пристрій обробки даних, і який продається виробником, таким як, Siemens of Munich Germany, або карта флеш-пам'яті. Якщо сховище даних є сховищем даних з доступними файлами для комп'ютера; такі файли можуть бути розташовані на різних носіях, включаючи: сервер, клієнт, жорсткий диск, CD, DVD, персональний цифровий органайзер, такий як Palm Pilot, магнітна стрічка, zip-дисковод, комп'ютерний вбудований ПЗП (постійний запам'ятовуючий пристрій) або Інтернет, або всесвітня павутина. Інші носії для зберігання файлів, доступних комп'ютеру, будуть очевидні фахівцю у даній галузі. Винахід також передбачає, що тестування на маркер відповіді на IFN-α може обмежуватися визначенням, чи має суб'єкт алель, наприклад, нуклеотид, в іншому локусі, який має високий ступінь нерівноважного зчеплення (LD) з алелем кращої відповіді для будь-кого з SNP, перерахованих у таблиці 1. Два визначених алелі у різних локусах на одній хромосомі вважаються такими, що знаходяться в LD, якщо присутність одного з алелів в одному локусі передбачає присутність іншого алеля в іншому локусі. Такі варіанти, позначені тут як зчеплені варіанти, або замісні варіанти (proxy variants), можуть являти собою будь-який тип варіанту (наприклад, SNP, вставка або делеція), який має високий ступінь LD з алелем кращої відповіді, що представляє інтерес. Зчеплені варіанти легко ідентифікують шляхом визначення ступеню нерівноважного зчеплення (LD) між алелем кращої відповіді будь-якого з SNP таблиці 1 і кандидатним зчепленим алелем у поліморфному сайті, розташованим у хромосомній області 19q13.13 або в іншому місці на хромосомі 19. Кандидатний зчеплений варіант може бути алелем поліморфізму, який відомий у наш час. Інші кандидатні зчеплені варіанти можуть бути легко ідентифіковані фахівцем у даній галузі із застосуванням будь-якої методики, добре відомої у даній галузі, для знаходження поліморфізму. 13 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ступінь LD між алелем кращої відповіді з таблиці 1 і кандидатним зчепленим варіантом може бути визначений за допомогою будь-якого показника LD, відомого у даній галузі. Показники LD в області геному легко визначають дослідним шляхом у відповідним чином вибраних зразках з використанням різних методик, відомих у даній галузі для визначення того, чи існує між двома алелями (наприклад, між нуклеотидами у різних PS) нерівноважне зчеплення (дивіться, наприклад, GENETIC DATA ANALYSIS II, Weir, Sineuer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, MA 1996). Фахівець у даній галузі може без великих зусиль вибрати, який метод визначення LD буде підходити найкращим чином для популяційної групи визначеного розміру і для області геному. Одним з найчастіше використовуваних показників 2 нерівноважного зчеплення є r , який розраховують за допомогою формули, описаної Devlin et al. 2 (Genomics, 29(2):311-22 (1995)). Значення r є показником того, наскільки добре алель X у першому локусі прогнозує появу алеля Y у другому локусі на тій самій хромосомі. Показник досягає значення 1,0, тільки якщо прогноз є довершеним (наприклад, X, якщо, і тільки якщо, Y). Переважно, локус зчепленого варіанту знаходиться в області геному, що складається приблизно зі 100 тисяч пар нуклеотидів, більш переважно приблизно 10 т.п.н., яка перекриває будь-який з PS таблиці 1. Інші зчеплені варіанти являють собою варіанти, в яких LD з алелем 2 кращої відповіді має значення r , яке вимірюють у відповідній референсній популяції, щонайменше 0,75, більш переважно щонайменше 0,80, ще більш переважно щонайменше 0,85 або щонайменше 0,90, ще більш переважно щонайменше 0,95 і найбільш переважно 1,0. 2 Референсна популяція, що використовується для такого вимірювання r , може бути генеральною популяцією, популяцією, що використовує IFN-α, популяцією з діагностованим визначеним станом, для якого показана ефективність IFN-α (таким як хронічна HCV-інфекція), або популяція, члени якої ідентифікують свою приналежність до однієї етнічної групи, наприклад, європеєць, афроамериканець, іспаномовний, латиноамериканець, корінний американець і т.п., або може бути будь-якою комбінацією з вказаних категорій. Переважно, референсна популяція відображає генетичну різноманітність популяції пацієнтів, яких лікують IFN-α. У деяких варіантах здійснення лікар визначає, чи має пацієнт маркер відповіді на IFN-α, описаний тут, призначаючи діагностичний тест, який призначений для визначення, чи має пацієнт щонайменше один алель кращої відповіді в одному або більше поліморфних сайтах таблиці 1. Переважно, тест визначає природу обох алелів, тобто генотип, у вказаному PS. У деяких варіантах здійснення лабораторія тестування буде одержувати зразок нуклеїнової кислоти з біологічного зразка (такого як зразок крові або букальний мазок), одержаного у пацієнта. У деяких варіантах здійснення зразок крові у пацієнта бере лікар або медичний співробітник, або лаборант діагностичної лабораторії. У деяких варіантах здійснення пацієнту надається набір для приготування букального мазка з внутрішньої сторони щоки, який потім пацієнт віддає медичному співробітнику або відправляє безпосередньо у діагностичну лабораторію. У деяких варіантах здійснення у лабораторії тестування невідомі ідентифікаційні дані суб'єкта, чий зразок тестується; тобто зразок, що приймається лабораторією, роблять анонімним яким-небудь чином перед відправкою у лабораторію. Наприклад, зразок може бути ідентифікований просто за допомогою номера або якого-небудь іншого коду ("ID зразка") і результати діагностичного методу можуть бути повідомлені стороні, що призначила тест, з використанням ID зразка. У переважних варіантах здійснення зв'язок між ідентифікаційною інформацією суб'єкта і зразком суб'єкта відомий тільки суб'єкту або лікарю суб'єкта. У деяких варіантах здійснення після того, як одержані результати тесту, лабораторія тестування складає звіт за результатами дослідження, в якому вказана наявність або відсутність алеля кращої відповіді у генотипованому поліморфному сайті, і переважно вказано, є пацієнт гетерозиготним або монозиготним по алелю найкращої відповіді. У деяких варіантах здійснення звіт за результатами дослідження є письмовим документом, підготованим лабораторією тестування і відправленим пацієнту або лікарю пацієнта у вигляді друкованого документа або за допомогою електронної пошти. В інших варіантах здійснення звіт за результатами дослідження створюється за допомогою комп'ютерної програми і демонструється на відеомоніторі у кабінеті лікаря. Звіт за результатами дослідження також може включати в себе усне повідомлення результатів тесту безпосередньо пацієнту або лікарю пацієнта, або співробітнику з дозволеним допуском у кабінет лікаря. Аналогічним чином, звіт за результатами дослідження може містити запис про результати тесту, який лікар описав у файлі пацієнта. В одному переважному варіанті здійснення, якщо пацієнт є гомозиготним по алелю кращої відповіді, то у звіті за результатами дослідження додатково вказано, що пацієнт тестований позитивно на генетичний маркер, асоційований з можливою відповіддю на лікування IFN-α, тоді 14 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 як, якщо суб'єкт є гетерозиготним по алелю кращої відповіді або є гомозиготним по іншому алелю, то у звіті за результатами дослідження додатково вказано, що пацієнт негативно тестований на генетичний маркер, асоційований з можливою відповіддю на лікування IFN-α. У деяких варіантах здійснення результат тесту буде включати оцінку ймовірності досягнення сприятливої відповіді на IFN-α, яку одержують у результаті виконання моделі, яка зважує різні параметри пацієнта (наприклад, вік, стать, вагу, расу, результати тестів на інші фармакогенетичні маркери для IFN-α) і характеристики захворювання (наприклад, тяжкість захворювання), які пов'язані з відповіддю на IFN-α у популяції з відповідним захворюванням. Значення, що надається кожному параметру, базується на його внеску у порівнянні з іншими параметрами у пояснення міжсуб’єктної варіабельності відповіді на IFN-α у популяції із захворюванням, що розглядається. Лікар може використати вказану оцінку ймовірності відповіді як показник у виборі терапії або схеми лікування для пацієнта. Наприклад, при хронічній HCVінфекції, параметри пацієнта, асоційовані з досягненням SVR, включають расу, і параметри захворювання включають генотип HCV, початковий рівень вірусного навантаження, і ступінь фіброзу. Як правило, суб'єкт може бути перевірений на наявність маркера відповіді на IFN-α до початку терапії IFN-α, але передбачається, що таке тестування може бути проведене у будьякий час після введення суб'єкту першої дози IFN-α. Наприклад, лікуючий лікар може бути стурбований тим, що пацієнт не відповідає відповідним чином на лікування і хоче призначити тест суб'єкту, щоб визначити, чи обґрунтоване продовження лікування IFN-α. У деяких варіантах здійснення лікар може визначити, потрібно чи ні суб'єкту проводити тест на маркери відповіді на IFN-α. Наприклад, лікар може оцінювати, чи призначати пацієнту фармацевтичний продукт, який показаний для пацієнтів, позитивно тестованих на маркер відповіді на IFN-α. У варіантах здійснення, де пацієнт має рівень, що виявляється, РНК HCV у сироватці крові і переніс трансплантацію печінки, лікар може прийняти рішення про проведення біопсії трансплантованої печінки для перевірки маркера відповіді на IFN-α, щоб полегшити прийняття лікувальних рішень стосовно пацієнта. При прийнятті рішення, як використовувати результати тесту на маркер відповіді на IFN-α у лікуванні якого-небудь окремого пацієнта, лікар також може брати до уваги інші відповідні умови, такі як захворювання або стан, який лікують, вік, вагу, стать, спадковість і расу пацієнта, включаючи введення комбінації вказаних факторів і результатів тесту на генетичний маркер у модель, яка допомагає лікарю провести вибір терапії і/або схеми лікування для вказаної терапії. Визначення наявності або відсутності будь-якого з маркерів відповіді таблиці 1 може бути здійснене із застосуванням набору, який спеціально розроблений для даної мети. В одному варіанті здійснення набір винаходу містить ряд олігонуклеотидів, призначених для ідентифікації кожного з алелів у PS щонайменше одного маркера таблиці 1, у переважних варіантах здійснення PS являє собою rs12980275, rs28416813 або rs8103142. В іншому варіанті здійснення розробляється ряд олігонуклеотидів для ідентифікації алелів у будь-якій комбінації двох або більше PS таблиці 1. У переважному варіанті здійснення комбінація PS включає щонайменше PS rs28416813 і PS rs8103142. В іншому переважному варіанті здійснення комбінація PS включає кожний з поліморфних сайтів таблиці 1. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди у наборі є або алель-специфічними зондами, або алель-специфічними праймерами. В інших варіантах здійснення набір містить олігонуклеотиди для подовження праймеру. В інших варіантах здійснення набір олігонуклеотидів являє собою комбінацію алель-специфічних зондів, алель-специфічних праймерів і олігонуклеотиди для подовження праймеру. Набір може містити олігонуклеотиди, призначені для виявлення наявності інших генетичних маркерів, асоційованих з відповіддю на інтерферон-альфа. Олігонуклеотиди у наборах винаходу повинні бути здатні специфічно гібридизуватися з цільовою областю полінуклеотиду. Використовувана тут "специфічна гібридизація" означає, що олігонуклеотид утворює антипаралельну двохланцюжкову структуру з областю-мішенню у визначених умовах гібридизації, і у той же час не здатний утворити таку структуру з областями, що не є мішенями, при їх інкубації з полінуклеотидом у тих самих умовах гібридизації. У деяких варіантах здійснення область-мішень містить PS, що представляє інтерес, тоді як в інших варіантах здійснення область-мішень розташована на відстані від одного до 10 нуклеотидів поряд з PS. Склад і довжина кожного олігонуклеотиду у наборі буде залежати від природи геномної області, що містить PS, а також від типу тесту, який треба виконати за допомогою олігонуклеотиду, і вони можуть бути легко визначені фахівцем у даній галузі. 15 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Наприклад, полінуклеотид, який використовують у тесті, може складати продукт ампліфікації, і таким чином необхідна специфічність олігонуклеотиду існує стосовно гібридизації з областю-мішенню у продукті ампліфікації, скоріше ніж у геномній ДНК або кДНК, виділеній у суб'єкта. Як інший приклад, якщо набір призначений для генотипування двох або більше поліморфних сайтів одночасно, температури плавлення олігонуклеотидів для кожного PS у наборі звичайно будуть знаходитися у вузькому діапазоні, переважно менше 5 °C і більш переважно менше 2 °C. У деяких варіантах здійснення кожний олігонуклеотид у наборі повністю комплементарний своїй області-мішені. Олігонуклеотид називається "абсолютно" або "повністю" комплементарним іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо кожний нуклеотид однієї з молекул комплементарний нуклеотиду у відповідному положенні іншої молекули. У той час, як абсолютно комплементарні олігонуклеотиди переважні для виявлення поліморфізму, передбачаються відхилення від повної комплементарності, якщо такі відхилення не перешкоджають специфічній гібридизації молекули з областю-мішенню, як визначено вище. Наприклад, олігонуклеотидний праймер може мати некомплементарний фрагмент на 5'-кінці, при цьому частина праймеру, що залишилася, повністю комплементарна області-мішені. Альтернативно, некомплементарні нуклеотиди можуть бути розташовані врозкид у зонді або праймері, за умови, що одержаний зонд або праймер як і раніше здатний специфічно гібридизуватися з областю-мішенню. У деяких переважних варіантах здійснення кожний олігонуклеотид у наборі специфічно гібридизується зі своєю областю-мішенню у жорстких умовах гібридизації. Жорсткі умови гібридизації залежать від послідовності і варіюють в залежності від обставин. Загалом, жорсткі умови вибирають так, що температура приблизно на 5 °C нижча, ніж температурна точка плавлення (т.пл.) для конкретної послідовності при визначеній іонній силі і значенні pH. T.пл. являє собою температуру (при визначеній іонній силі, pH і концентрації нуклеїнової кислоти), при якій 50% зондів, комплементарних послідовності-мішені, гібридизуються з послідовністюмішенню у рівноважному стані. Оскільки послідовності-мішені звичайно представлені у надлишку, при т.пл. 50% зондів знаходяться у рівноважному стані. Як правило, жорсткі умови включають концентрацію солі щонайменше приблизно 0,01-1,0 M концентрації іонів натрію (або інших солей) при значенні pH 7,0-8,3, і температура складає щонайменше приблизно 25 °C для коротких олігонуклеотидих зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів). Жорсткі умови також можуть бути одержані при доданні дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Наприклад, умови 5×SSPE (750 мМ NaCl, 50 мМ фосфат натрію, 5 мМ ЕДТА, pH 7,4) і температура 25-30 °C призначені для гібридизації алель-специфічних зондів. Додаткові жорсткі умови можуть бути знайдені у керівництві Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9, and 11, і в NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, А PRACTICAL APPROACH, Haymes et al., IRL Press, Washington, D.C., 1985. Один необмежувальний приклад жорстких умов гібридизації включає гібридизацію в 4× буфері хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) приблизно при 65-70 °C (або альтернативно гібридизацію в 4×SSC плюс 50% формамід приблизно при 42-50 °C) з подальшим одним або більше промиваннями в 1×SSC, приблизно при 65-70 °C. Необмежувальний приклад високо жорстких умов гібридизації включає гібридизацію в 1×SSC приблизно при 65-70 °C (або альтернативно гібридизацію в 1×SSC плюс 50% формамід приблизно при 42-50 °C) з подальшим одним або більше промиваннями в 0,3×SSC приблизно при 65-70 °C. Необмежувальний приклад умов гібридизації зниженої жорсткості включає гібридизацію в 4×SSC приблизно при 50-60 °C (або альтернативно гібридизацію в 6×SSC плюс 50% формамід приблизно при 40-45 °C) з подальшим одним або більше промиваннями в 2×SSC приблизно при 50-60 °C. Мається на увазі, що жорсткі умови у межах від середніх значень до вказаних вище значень, наприклад, при 65-70 °C або при 42-50 °C, також включені у даний винахід. Буфер SSPE (1×SSPE являє собою 0,15 M NaCl, 10 мМ NaH2PO4 і 1,25 мМ ЕДТА, pH 7,4) може бути замінений на буфер SSC (1×SSC являє собою 0,15 M NaCl і 15 мМ цитрат натрію) у гібридизаційному і промивальному буферах; промивання виконують протягом 15 хвилин, кожне після того, як гібридизація завершена. Температура гібридизації для гібридів з передбачуваною довжиною менше 50 пар основ повинна бути на 5-10 °C нижча, ніж температура плавлення (т.пл.) гібриду, де т.пл. визначають відповідно до наведених далі рівнянь. Для гібридів довжиною менше 18 пар основ т.пл.(°С)=2(# основ А+Т)+4(# основ G+С). Для гібридів довжиною від 18 до 49 пар основ т.пл.(°С)=81,5+16,6(log10[Na+])+0,41(%G+С)-(600/N), де N являє собою число основ у гібриді, і 16 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [Na+] являє собою концентрацію іонів натрію у гібридизаційному буфері ([Na+] для 1×SSC=0,165 M). Олігонуклеотиди у наборах винаходу можуть складатися з рибонуклеотидів, дезоксирибонуклеотидів і ациклічних нуклеотидних похідних та інших функціонально еквівалентних похідних у будь-якому стані фосфорилування. Альтернативно, олігонуклеотиди можуть мати основний ланцюг, що не містить фосфатів, який може бути складений з ланок, таких як карбоксиметил, ацетамідат, карбамат, поліамід (пептидна нуклеїнова кислота (PNA)) і т.п. (Varma, в MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTEChNOLOGY, А COMPREHENSIVE DESK REFERENCE, Meyers, ed., pp. 6 17-20, VCH Publishers, Inc., 1995). Олігонуклеотиди можуть бути одержані за допомогою хімічного синтезу з використанням будь-якої придатної методики, відомої у даній галузі, або можуть бути одержані з біологічного зразка, наприклад, шляхом обмеженого розщеплення. Олігонуклеотиди можуть містити мітку, що детектується, відповідно до будь-якого способу, відомого у даній галузі, включаючи застосування радіоміток, флуоресцентних міток, ферментних міток, білків, гаптенів, антитіл, послідовностей, що маркірують і т.п. Олігонуклеотиди у наборі можуть бути вироблені і представлені на ринку у вигляді аналіт-специфічних реагентів (ASR) або можуть бути складовими компонентами схваленого діагностичного пристрою. У деяких варіантах здійснення набір олігонуклеотидів у наборі містить різні мітки, щоб забезпечити одночасне визначення ідентичності алелів у двох або більше поліморфних сайтах. Олігонуклеотиди також можуть складати необхідний ряд олігонуклеотидів, іммобілізованих на твердій поверхні, такій як мікрочип, кремнієві гранули (наприклад, технологія BeadArray від Illumina, San Diego, CA), або скляна пластина (дивіться, наприклад, WO 98/20020 і WO 98/20019). Набори, що містять такі іммобілізовані олігонуклеотиди, можуть бути призначені для виконання ряду тестів для визначення поліморфізму, включаючи, але без обмеження, тести на основі методу гібридизації зондів і подовження праймеру із застосуванням полімерази. Набори винаходу також можуть містити інші реагенти, такі як гібридизаційний буфер (наприклад, якщо олігонуклеотиди використовують як алель-специфічні зонди) або дидеоксинуклеотидні трифосфати (ddNTP; наприклад, якщо алелі у поліморфних сайтах визначають за допомогою подовження праймеру). Набори, призначені для застосування у тестах генотипування із застосуванням полімерази, також можуть містити полімеразу і реакційний буфер, оптимізований для виконання тесту із застосуванням полімерази. Набори винаходу також можуть містити реагенти для визначення, чи відбулася специфічна гібридизація або чи відбулося специфічне подовження праймеру, що опосередковується полімеразою. Такі реагенти для виявлення можуть включати біотин-мічені або флуоресцентномічені олігонуклеотиди або ddNTP, і/або мічене ферментом антитіло і один або більше субстратів, які виробляють сигнал, що детектується, коли на них впливає фермент. Фахівцю у даній галузі зрозуміло, що набір олігонуклеотидів і реагенти для виконання тесту надаються в окремих ємностях, вміщених за необхідності у контейнер набору, щоб зберегти біологічну або хімічну активність і забезпечити належне використання при проведенні тесту. В інших варіантах здійснення перевіряли якість кожного з олігонуклеотидів і всіх інших реагентів у наборі для оптимального виконання тесту, призначеного для визначення генотипу одного або більше PS таблиці 1. У деяких варіантах здійснення набір містить інструкцію про порядок роботи, в якій описано, як використовувати розшифрований генотип, щоб визначити у зразку нуклеїнової кислоти, що тестується, наявність або відсутність маркера відповіді. У деяких переважних варіантах здійснення набір олігонуклеотидів у наборі являє собою алель-специфічні олігонуклеотиди. Використовуваний тут термін "алель-специфічний олігонуклеотид" (ASO) означає олігонуклеотид, який здатний у досить жорстких умовах специфічно гібридизуватися з одним алелем PS в області-мішені, що містить PS, і у той самий час не гібридизуватися з тією ж областю, що містить інший алель. Фахівцю у даній галузі зрозуміло, що специфічність зв’язування алеля буде залежати від ряду умов жорсткості, що легко оптимізуються, включаючи концентрацію солі і формаміду, а також від температури на стадії гібридизації і на стадії промивання. Приклади умов гібридизації і промивання, що звичайно застосовуються для ASO-зондів і праймерів, можна знайти у публікації Kogan et al., "Genetic Prediction of Hemophilia А" in PCR PROTOCOLS, А GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, 1990, і Ruaflo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6296-300 (1990). Як правило, ASO буде повністю комплементарний одному алелю, і у той же час буде мати помилкове спарювання пари основ з іншим алелем. В ASO-зондах помилкове спарювання пари основ відбувається переважно у центральному положенні олігонуклеотидного зонда при його вирівнюванні з поліморфним сайтом в області-мішені (наприклад, приблизно 7-е або 8-е 17 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положення в 15mer, 8-е або 9-е положення в 16mer, і 10-е або 11-е положення в 20mer). Помилкове спарювання пари основ в ASO-праймерах знаходиться в 3'-кінцевому нуклеотиді, або переважно в 3'-передостанньому нуклеотиді. ASO-зонди і ASO-праймери, що гібридизуються з кодуючим або з некодуючим ланцюгом, передбачаються винаходом. У деяких варіантах здійснення набір містить пару алель-специфічних олігонуклеотидів для кожного PS, який досліджують, причому один член пари специфічний для одного алеля (наприклад, алель кращої відповіді) і інший член є специфічним для іншого алеля. У таких варіантах здійснення олігонуклеотиди у парі можуть бути різної довжини або можуть містити різні мітки, що детектуються, щоб дозволити користувачу набору визначити генотип у досліджуваному PS. В інших переважних варіантах здійснення олігонуклеотиди у наборі є олігонуклеотидами подовження праймеру. Для зупинки реакції подовження, що опосередковується полімеразою, вибирають суміші будь-яких вказаних олігонуклеотидів, щоб припинити подовження олігонуклеотиду у цікавлячому PS, або вибирають одну основу, відповідно, в залежності від протилежних нуклеотидів, представлених у PS. В одному варіанті здійснення набір містить пару алель-специфічних олігонуклеотидних зондів для генотипування щонайменше одного з поліморфних сайтів таблиці 1. В одному варіанті здійснення один ASO-зонд у парі містить нуклеотидну послідовність щонайменше з 15 нуклеотидів, яка ідентична або повністю комплементарна алелю кращої відповіді у контекстній послідовності, представленій у таблиці 2, і інший ASO-зонд у парі містить нуклеотидну послідовність щонайменше з 15 нуклеотидів, яка ідентична або повністю комплементарна іншому алелю у контекстній послідовності, представленій у таблиці 2. В одному переважному варіанті здійснення набір містить такі ASO-зонди для генотипування щонайменше одного PS, вибраного з групи, що складається з rs8103142 і rs8103142. В іншому переважному варіанті здійснення набір містить такі ASO-зонди для генотипування обох PS. В іншому варіанті здійснення набір містить такі ASO-зонди для генотипування кожного PS таблиці 1. В. Фармацевтичні композиції, фармацевтичні продукти і схеми лікування Суб'єкт, якого тестують або лікують за допомогою будь-якого зі способів і продуктів, описаних тут, є суб'єктом-людиною, яка потребує лікування інтерфероном-альфа. У деяких варіантах здійснення у суб'єкта діагностований або проявляється симптом, захворювання, що піддається лікуванню інтерфероном-альфа. В інших варіантах здійснення лікарський засіб інтерферону-альфа, який використовують, схвалений для застосування у лікуванні показання, яке було діагностовано у суб'єкта. В інших варіантах здійснення лікарський засіб інтерферонуальфа, який використовують, не схвалений для лікування діагностованого захворювання або виявленого симптому (симптомів), але лікуючий лікар вважає, що лікарський засіб може бути корисний у лікуванні суб'єкта. IFN-α, що використовується у фармацевтичних композиціях, фармацевтичних продуктах і способах даного винаходу, може бути будь-яким з багатьох підтипів білків IFN-α, що експресуються у людини і багатьох інших видів (Pestka, S. et al., Immunol. Reviews 202:8-32 (2004); Diaz, M.O., et al., J. Interferon Cytokine Res 16: 179-180 (1996)). У переважних варіантах здійснення білок IFN-α є білком, одержаним рекомбінантним способом, який складається або по суті складається зі зрілої амінокислотної послідовності одного з наведених далі підтипів IFN-α людини: IFN-α1, IFN-α2, IFN-α4, IFN-α5, IFN-α6, IFN-α7, IFN-α8, IFN-α10, IFN-α13, IFN-α14, IFNα16, IFN-α17, IFN-α21 (Bekisz, J. et al., Growth Factors 22(4):243-351 (2004)), а також алельних варіантів будь-якого з вказаних підтипів, наприклад, IFN-α2a, IFN-α2b і IFN-α2c. Підтипи IFN-α людини характеризуються 75-99% ідентичності амінокислотної послідовності і зрілою амінокислотою зі 166 a.к., за винятком IFN-α2, який складається зі 165 a.к. у результаті делеції у положенні 44 (Bekisz, J., et al., вище). Інші рекомбінантні білки IFN-α, передбачені для застосування у даному винаході, включають будь-який консенсусний білок IFN-α, в якому амінокислотна послідовність створена шляхом відбору для кожного положення амінокислоти, яка частіше за все зустрічається у такому положенні у різних нативних підтипах IFN-α. Особливо переважні композиції IFN-α для застосування у фармацевтичних продуктах і способах даного винаходу являють собою продукти інтерферону-альфа-2, схвалені державним регуляторним органом, включаючи будь-який з перерахованих: Roferon®-A (інтерферон-альфа 2A, рекомбінантний), що постачається Hoffmann La-Roche, Nutley NJ., і його пегильовані версії, такі як PEGASYS® (пегінтерферон-альфа-2a), що постачається Hoffmann La-Roche, Nutley N.J.; INTRON® А (інтерферон-альфа-2b, рекомбінантний), що постачається Schering Corporation, Kenilworth, NJ і його пегильовані версії, такі як PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b); INFERGEN® (інтерферон-альфаcon-1), консенсусний IFN-α початково розроблений Amgen, Thousand Oaks, CA і у наш час постачається Three Rivers Pharmaceuticals, Warrendale, PA. Інші 18 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтерферони, передбачені для застосування у даному винаході, включають: гібриди інтерферону-альфа і неінтерферонового білка, такі як Albuferon® (альбінтерферон-альфа-2b), який розробляється Human Genome Sciences, Rockville, MD і Norvartis, Basel, Switzerland; Locteron, композиція, що проходить клінічне випробування, з контрольованим вивільненням інтерферону-альфа (Biolex/OctoPlus); і Belerofon®, варіант природного альфа-інтерферону із заміною однієї амінокислоти, розроблений Nautilus Biotech. Будь-яка з зазначених вище композицій IFN-α також може продаватися під різними торговими назвами, такими як VIRAFERONPEG®, пегінтерферон-альфа-2b, який являє собою таку ж композицію, як і PegIntron®, пегінтерферон-альфа-2b. PEGASYS® пегінтерферон-альфа-2a одержують шляхом ковалентного зв’язування одного розгалуженого PEG-полімеру з молекулярною вагою 40 кДа за допомогою амідного зв'язку з бічним ланцюгом лізину молекули інтерферону-альфа-2b, дивіться, наприклад, Dhalluin, С. et al., Bioconjugate Chem. 16:504-517 (2005) і патент США № 7201897. Кінцевий продукт являє собою суміш шести основних монопегильованих позиційних ізомерів (Dhalluin, С, вище, Foser, S. et al., J. Prot. Exp. Purif. 30: 78-87 [2003]). PEGASYS® (пегінтерферон-альфа-2a) і його біоаналоги також позначаються тут як bPEG40K-інтерферон-альфа-2a. PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b) одержують при ковалентній взаємодії рекомбінантного інтерферону-альфа-2b з сукцинімідилкарбонатом PEG з середньою молекулярною вагою 12000 Да (SC-PEG12k) у 100 мМ фосфаті натрію, pH 6,5 (дивіться, наприклад, Grace, M. et al., J. Interferon Cytokine Res. 21:1103-1115 (2001); Wang, Y.S. et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54:547-570 (2000); і патент США № 5951974). Кінцевий продукт являє собою суміш головним чином монопегильованих видів, в яких PEG12k приєднаний до різних залишків інтерферону-альфа-2b за допомогою уретанового зв'язку, причому основний позиційний ізомер має уретановий зв'язок у положенні гістидин 34 (дивіться, наприклад, Wang, Y.S. et al., вище і патент США № 5951974). PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b) і його біоаналоги також позначені тут як PEG12k-інтерферон-альфа-2b. Інші продукти IFN-α, передбачені для застосування у винаході, які були схвалені раніше або представлені у наш час на ринку, включають: Berofor® alpha 2 (рекомбінантний інтерферональфа-2C, Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CT); інтерферон-альфа-n1, очищена суміш природних-альфа-інтерферонів, відома як Surniferon® (Sumitomo, Japan) або як Wellferon® інтерферон-альфа-n1 (INS), Glaxo-Wellcome Ltd., London, Great Britain; консенсусний інтерферон-альфа, такий як інтерферони, описані у патентах США № 4897471 і № 4695623 (особливо приклади 7, 8 або 9); ALFERON N Injection® [інтерферон-альфа-n3 (одержаний з лейкоцитів людини), суміш численних видів природних альфа-інтерферонів, що надається Hemispherx Biopharma, Inc., Philadelphia, PA]. Інші кон’югати інтерферон-альфа-полімер, що застосовуються у даному винаході, описані у патенті США № 4766106, патенті США № 4917888, європейській патентній заявці № 0236987, європейських патентних заявках №№ 0510356, 0593868 і 0809996 та у міжнародній публікації WO 95/13090. Також для застосування у даному винаході передбачена будь-яка фармацевтична композиція пегильованого інтерферону-альфа 2a або 2b, яка схвалена регуляторним органом на основі, щонайменше у частині, ідентичності передклінічних і/або клінічних даних, раніше представленій регуляторному органу у зв'язку із затвердженням будь-якого з описаних вище представлених на ринку продуктів пегильованого інтерферону-альфа, тобто PEGASYS® (пегінтерферон-альфа-2a) і PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b). Такі пізніше схвалені продукти можуть бути описані регуляторним органом у термінах, таких як генеричний, біоеквівалентний, біоаналог, або такий, що замінює, стосовно раніше схваленого продукту, вказані терміни можуть бути визначені або не визначені в явній формі регуляторним органом. Фармацевтичні композиції пегильованих інтерферонів-альфа, призначені для парентерального введення, можуть бути включені у склад з придатним буфером, наприклад, Tris-HCl, ацетатним або фосфатним, таким як буфер двохосновний фосфат натрію/одноосновний фосфат натрію, і фармацевтично прийнятними середовищами для лікарського засобу (наприклад, сахароза, трегалоза), носіями (наприклад, людський сироватковий альбумін), токсичними агентами (наприклад, NaCl), консервантами (наприклад, тимеросал, крезол або бензиловий спирт) і сурфактантами (наприклад, твін або полісорбати) у стерильній воді для ін'єкцій. Дивіться, наприклад, патент США № 6180096 і міжнародну патентну заявку WO2006/020720. Такі композиції можуть бути збережені у вигляді ліофілізованих порошків при охолоджуванні до 2-8 °C і можуть бути відновлені стерилізованою водою перед застосуванням. Такі відновлені водні розчини звичайно стабільні при зберіганні і використанні протягом 24 годин після відновлення. Дивіться, наприклад, патенти США №№ 19 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4492537, 5762923 і 5766582. Композиції ліофілізованого пегильованого інтерферону можуть бути надані у шприці-ручці, яка включає в себе скляний картридж, що містить розріджувач (тобто стерилізовану воду) в одному відділенні і порошок ліофілізованого пегильованого інтерферону-альфа у спеціальному відділенні. Приклади водних композицій пегильованого інтерферону описані у патенті США № 5762923. Такі композиції можуть зберігатися у заздалегідь заповнених, багатодозових шприцах, таких як шприци, що застосовуються для доставки лікарських засобів, таких як інсулін. Типові відповідні шприци включають системи, що містять заздалегідь заповнену пляшечку, прикріплену до ручкишприца, такого як NOVOLET Novo Pen, доступного у Novo Nordisk, а також заздалегідь заповнені ручки-шприци, які дозволяють користувачу легко ввести ін'єкцію самому собі. Даний винахід також передбачає застосування будь-якого зі згаданих вище інтерферонівальфа у комбінації з агоністом Toll-подібного рецептора (TLR), який, як припускають, індукує відповідь на інтерферон. Наприклад, агоністи TLR3, TLR7 і TLR9 проходять оцінку для застосування у лікуванні HCV. Захворювання і стани, які можуть лікувати за даним винаходом, звичайно є такими, які піддаються лікуванню IFN-α, тобто IFN-α забезпечує клінічно вимірний сприятливий результат у групі пацієнтів захворювання, наприклад, зменшення вірусного навантаження у HCVінфікованих пацієнтів. Типові захворювання і стани, що піддаються лікуванню IFN-α, включають, але без обмеження захворювання, що викликаються клітинною проліферацією, особливо вірусні інфекції і злоякісні пухлини. Переважно, захворювання являє собою захворювання, для якого IFN-α схвалений регуляторним органом, таким як Управління з контролю якості харчових продуктів і лікарських засобів США. Вірусні інфекції включають гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, інший гепатит не-А/неВ, вірус герпесу, вірус Епштейна-Барр (EBV), цитомегаловірус (CMV), простий герпес, вірус герпесу людини тип 6, папіломавіруси, поксвірус, пікорнавірус, аденовірус, риновірус, людський Т-лімфотропний вірус типу 1 і 2, людський ротавірус, вірус сказу, ретровіруси, включаючи вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), енцефаліт і респіраторні вірусні інфекції. У переважних варіантах здійснення вірусна інфекція являє собою HCV або HBV. В особливо переважному варіанті здійснення вірусна інфекція являє собою хронічну HCV-інфекцію. У переважних варіантах здійснення маркери відповіді на IFN-α даного винаходу застосовуються спільно з будь-якою схемою лікування монотерапії IFN-α або комбінованої терапії, схваленої регуляторним органом при показанні хронічний HBV або хронічний HCV, і в особливо переважних варіантах здійснення спільно з будь-якою зі схем дозування і лікування хронічного гепатиту С, описаних у листку-вкладиші для продуктів Roferon®-A (інтерферональфа 2A, рекомбінантний), PEGASYS® (пегінтерферон-альфа-2a), INTRON® А (інтерферональфа-2b, рекомбінантний) і PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b). Схвалені схеми комбінованої терапії при хронічній HCV-інфекції звичайно включають рибавірин, нуклеозидний аналог, на додаток до білка IFN-α. Для продукту PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b) такі схвалені комбіновані схеми рекомендують терапію протягом 24 тижнів для пацієнтів, хронічно інфікованих HCV генотипу 2 або 3, і до 48 тижнів для пацієнтів, хронічно інфікованих HCV генотипу 1, причому 24-тижнева терапія схвалена в Європі для підгрупи пацієнтів з генотипом 1 інфекції і пацієнтів з низьким вірусним навантаженням (менше 600000), які є HCV РНКнегативними на четвертому тижні лікування і залишаються HCV РНК-негативними на 24-му тижні лікування. В інших варіантах здійснення маркери відповіді на IFN-α використовуються спільно з тестуванням вірусологічної відповіді для визначення відповідної тривалості лікування комбінованою терапією інтерфероном-альфа/рибавірином пацієнтів, інфікованих HCV генотипу 1. Пацієнти, позитивно тестовані на маркер відповіді на IFN-α, у гомозиготному стані, і які мають рівень, що не визначається, РНК HCV на 4 і на 12 тижнях лікування, можуть бути кандидатами для лікування тривалістю 12-36 тижнів, наприклад, 12, 18, 24, 30 або 36 тижнів. У деяких переважних варіантах здійснення тривалість лікування, що вибирається, становить 24 тижні для пацієнта, який не одержував раніше лікування, хронічно інфікованого HCV генотипу 1 з високим початковим рівнем вірусного навантаження, який позитивно тестований на маркер відповіді на IFN-α у гомозиготному стані і має рівень, що не визначається, РНК HCV у кожний з тижнів лікування 4 і 12. В особливо переважних варіантах здійснення інтерферон-альфа являє собою пегильований інтерферон-альфа-2a або -2b, або злитий білок альбумін-інтерферон-альфа-2a або -2b. Комбіновані схеми на основі IFN-α, що включають нуклеозидний аналог, інший, ніж рибавірин, також розглядаються для лікування HCV-інфекції у суб'єктів, позитивно тестованих на маркер відповіді на IFN-α. Приклади таких нуклеозидних аналогів включають похідні 20 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 рибавірину, такі як тарибавірин (також відомий як вірамідин та ICN 3142), який розробляється Valeant Pharmaceuticals International (Aliso Viejo, CA), і сполуки, описані у патентах США №№ 6403564 і 6924270. Маркери відповіді на IFN-α даного винаходу також можуть бути використані для відбору пацієнтів, хронічно інфікованих HCV, які, очевидно, одержать найбільшу користь від лікування терапією на основі IFN-α (з рибавірином або без нього) у комбінації з одним або більше додатковими противірусними агентами. Необмежувальні приклади противірусних агентів, що застосовуються у таких схемах комбінованого лікування, включають інгібітор протеази HCV, інгібітор протеази NS3, інгібітор полімерази HCV, інгібітор HCV NS5A, інгібітор IRES, інгібітор NS4B, інгібітор хелікази HCV, інгібітор входу, інгібітор продукції віріонів HCV та інші інтерферони. В одному варіанті здійснення противірусний агент являє собою інгібітор протеази HCV. Інгібітори протеази HCV, що використовуються у таких комбінованих схемах лікування, описані в опублікованих міжнародних патентних заявках №№ WO2009/038663, WO2007/092616 і WO2002/18369 і в опублікованій патентній заявці США 2007/0042968. Інші інгібітори протеази HCV, що використовуються у способах і комбінованих терапіях даного винаходу, включають боцепревір (SCH503034) і SCH900518 (Schering-Plough); телапревір (VX-950), VX-500 і VX-813 (Vertex Pharmaceuticals); MK-7009 (Merck); і ITMN-191 (R7227) (Intermune and Roche); TMC-435 (Medivir/Tibotec); MK-7009 (Merck); GS-9132 і ACH-1095 (Gilead/Achillon); PHX1766 (Phenomix); ABT-450 HCV (Abbott/Enanta Pharmaceuticals); і BILN 2061 і BI 201335 (Boehringer Ingelheim). Додаткові приклади інгібіторів протеази HCV, що використовуються у способах і комбінованих терапіях даного винаходу, включають інгібітори, розкриті у публікаціях Landro et al, Biochemistry, 36(31):9340-9348 (1997); Ingallinella et al, Biochemistry, 37(25}: 8906-8914 (1998); Llinas-Brunet et al, Bioorg Med Chem Lett, 8(13): 1713-1718 (1998); Martin et al, Biochemistry, 37(33):11459-11468 (1998); Dimasi et al, J Virol, 71(10):7461-7469 (1997); Martin et al, Protein Eng, 10(5):607-614 (1997); Elzouki et al, J Hepat, 27(1):42-48 (1997); BioWorld Today, 9(217):4 (10 листопада 1998 року); у патентних публікаціях США №№ US2005/0249702 і US2007/0274951; і в міжнародних патентах №№ WO 98/14181, WO 98/17679, WO 98/17679, WO 98/22496, WO 99/07734 і WO 05/087731. Інші приклади інгібіторів протеази HCV, що використовуються у даних композиціях і способах, включають, але не обмежуються наведеними нижче сполуками: 21 UA 106756 C2 , 5 22 UA 106756 C2 5 і . В іншому варіанті здійснення противірусний агент являє собою інгібітор протеази NS3. Інгібітори серинової протеази NS3, що використовуються у даних способах і комбінованих терапіях даного винаходу, включають без обмеження інгібітори, розкриті у патентах США №№ 7494988, 7485625, 7449447, 7442695, 7425576, 7342041, 7253160, 7244721, 7205330, 7192957, 23 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7186747, 7173057, 7169760, 7012066, 6914122, 6911428, 6894072, 6846802, 6838475, 6800434, 6767991, 5017380, 4933443, 4812561 і 4634697; у патентних публікаціях США №№ US20020068702, US20020160962, US20050119168, US20050176648, US20050209164, US20050249702 і US20070042968; та у міжнародних патентних публікаціях №№ WO 03/006490, WO 03/087092, WO 04/092161 і WO 08/124148. У ще одному варіанті здійснення противірусний агент являє собою інгібітор полімерази HCV. Інгібітори полімерази HCV, що використовуються у способах та у комбінованих терапіях даного винаходу, включають, але не обмежуються цим: VP-19744 (Wyeth/ViroPharma), PS1-7851 (Pharmasset), R7128 (Roche/Pharmasset), PF-00868554 (Pfizer), VCH-759 і VCH-916 (ViroChem/Vertex), HCV-796 (Wyeth/ViroPharma), IDX184 (Idenix), NM-283 (Idemx/Novartis), R1626 (Roche), MK-0608 (Isis/Merck), GS 9190 (Gilead), ABT-333 (Abbott), А-848837 і А-837093 (Abbott), GSK-71185 (Glaxo SmithKline), ANA598 (Anadys), GSK-625433 (Glaxo SmithKline), XTL2125 (XTL Biopharmaceuticals), та інгібітори полімерази HCV, розкриті у публікаціях Ni et al., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 7(4):446 (2004); Tan et al, Nature Reviews, 1:867 (2002); і Beaulieu et al., Current Opinion in Investigational Drugs, 5:838 (2004), та у міжнародних патентних публікаціях №№ WO 08/082484, WO 08/082488, WO 08/083351, WO 08/136815, WO 09/032116, WO 09/032123, WO 09/032124 і WO 09/032125. В іншому варіанті здійснення противірусний агент є інгібітором NS5A HCV. Необмежувальні приклади інгібіторів NS5A HCV, застосовні у способах і комбінованих терапіях даного винаходу, являють собою AZD2836 (А-831) і AZD7295 (А-689) (Arrow Therapeutics); і BMS-790052 (BristolMyers Squibb). В одному варіанті здійснення противірусний агент є інгібітором NS4B, таким як гідрохлорид клемізолу та інші солі клемізолу. В одному варіанті здійснення противірусний агент є інгібітором реплікази HCV, включаючи інгібітори, розкриті у патентній публікації США № US20090081636. В іншому варіанті здійснення противірусний агент є інгібітором хелікази HCV, таким як тріоксален. В іншому варіанті здійснення противірусний агент являє собою інгібітор входу HCV, включаючи, але без обмеження, ITX5061 і ITX4520 (iTherx), PRO 206 (Progenies) і селгосивір (MX-3253), MIGENIX. В іншому варіанті здійснення противірусний агент є сполукою РНКi, наприклад, TT-033 (Tacere Therapeutics, Inc., San Jose, CA). У ще одному варіанті здійснення противірусний агент являє собою інший інтерферон типу 1 (наприклад, IFN-бета або IFN-омега), інтерферон типу II (наприклад, IFN-гамма) або інтерферон типу III (наприклад, Il-28 або Il-29). Приклади інтерферонів типу III, передбачених для застосування у способах і комбінованих терапіях даного винаходу, включають, але не обмежуються цим, PEG-IFN-лямбда (ZymoGenetics/Brisol Myers Squibb). Приклади інших додаткових противірусних агентів, передбачених для застосування у способах і комбінованих терапіях даного винаходу, включають, але не обмежуються цим, TT033 (Benitec/Tacere Bio/Pfizer), Sirna-034 (Sirna Therapeutics), GNI-104 (GENimmune), IDX-102 TM (Idenix), Levovirin (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, California); Humax (Genmab), ITX-2155 (Ithrex/Novartis), PRO 206 (Progenies), HepaCide-I (NanoVirocides), MX3235 (Migemx), SCV-07 (SciClone Pharma), KPE02003002 (Kemin Pharma), Lenocta (VioQuest Pharmaceuticals), IET TM Interferon Enhancing Therapy (Transition Therapeutics), Zadaxin (SciClone Pharma), VP 50406 TM (Viropharma, Incorporated, Exton, Pennsylvania); ISIS 14803 (ISIS Pharmaceuticals, Carlsbad, TM TM California); Heptazyme (Ribozyme Pharmaceuticals, Boulder, Colorado); Thymosin (SciClone TM Pharmaceuticals, San Mateo, California); Maxamine (Maxim Pharmaceuticals, San Diego, California); NKB-122 (JenKen Bioscience Inc., North Carolina); Alinia (Romark Laboratories), INFORM-1 (комбінація R7128, ITMN-191 і рибавірину); і мікофеноляту мофетил (FloffmanLaRoche, Nutley, New Jersey), SCY-635 (SCYNEXIS), ANA773 (Anadys), CYT107 (Cytheris), SPC3649 (Santaris Pharma), Alinia (нітазоксанід) (Romark); оглуфаніду динатрій (Implicit Bioscience), CTS-1027 (Conatus); NOV-205 (Novelos Therapeutics), IMO-2125 (Idera Pharmaceuticals) і CF102 (CAN-FITE). Винахід також передбачає лікування пацієнтів з HCV, які є гетерозиготними або гомозиготними по алелю G rs8103142, терапевтичним агентом, який збільшує рівні ізоформи Lys70 IFN-λ3, знижує рівні ізоформи Arg70 IFN-λ3 або надає обидва ефекти. Ілюстративні приклади терапевтичних агентів, які могли б збільшити рівень ізоформи Lys70 IFN-λ3, включають поліпептид IFN-λ3 Lys70 і вектор експресії, який кодує поліпептид IFN-λ3 Lys70. Поліпептид IFN-λ3 Lys70 може бути одержаний за допомогою методик, добре відомих у 24 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даній галузі техніки, дивіться, наприклад, Dellgren, с. et al., Genes and Immunity 10: 125-131 (2009) і патент США № 7517961. Переважно, вектор експресії являє собою вектор, який впливає на експресію поліпептиду IFN-λ3 Lys70, що кодується у гепатоцитах печінки людини. Така таргентна генотерапія печінки з використанням аденоасоційованих вірусних векторів була описана, дивіться, наприклад, публікацію Hasbrouck, NC et al, Gene Therapy 15:870-875 (2008) і матеріали, використані при експертизі заявки, Nancy Smyth Templeton, Gene and Cell Therapy: rd Therapeutic Mechanisms and Strategies, 3 Edition, опубліковано CRC Press (2008), Mark А. Findeis, Nonviral vectors for gene therapy: methods and protocols, опубліковано Humana Press (2001). Агенти, які могли б знизити рівень ізоформи Arg70 IFN-λ3, включають антисмислові РНК, малі інтерферуючі РНК (siРНК) і рибозими. Фахівець у даній галузі може легко розробити і перевірити такі агенти із застосуванням методик, відомих у даній галузі. Дивіться, наприклад, nd Stanley Т. Crooke, Antisense drug technology: principles, strategies, and applications, 2 Edition: 2, опубліковано CRC Press (2007) Kevin J. Scanlon, Therapeutic applications of ribozymes, опубліковано Humana Press (1998). Інший агент, який міг би знизити рівень ізоформи Arg70 IFN-λ3, являє собою моноклональне антитіло, яке зв'язується і нейтралізує ізоформу Arg70, але не ізоформу Lys70. Виділення таких антитіл повинно бути легко здійсненним, оскільки положення амінокислоти 70, як вважають, представлене на зовнішній поверхні IFN-λ3. Алель С rs12979860 також асоційований з більш високою ймовірністю природного кліренсу HCV у пацієнтів з гострим гепатитом С, який стосується перших 6 місяців після зараження HCV. Під час гострої фази симптоми не розвиваються у 60-70% інфікованих людей. Однак, деякі пацієнти мають симптоми гострої інфекції гепатиту С, які включають знижений апетит, стомлюваність, болі у животі, жовтяницю, свербіж і грипоподібні симптоми, що приводить до раннього виявлення захворювання. В інших пацієнтів виявляють гострий гепатит С внаслідок перевірки на HCV-інфекцію після відомого впливу джерела інфекції, такого як травма від голки. Вірус гепатиту С звичайно виявляється у крові за допомогою ПЛР протягом від одного до трьох тижнів після інфікування, і антитіла до вірусу звичайно виявляються протягом від 3 до 15 тижнів. Оскільки у 50% пацієнтів відбувається спонтанна елімінація вірусу під час гострої фази, лікарі звичайно надто неохоче і вимушено піддають пацієнта, у якого виявлений гострий гепатит, витратам і побічним ефектам антивірусної терапії, якщо і перш ніж у пацієнта не розвинеться хронічна HCV-інфекція, тобто інфекція пізніше більше 6 місяців. Визначення генотипу пацієнта у PS rs12979860 може бути іншим фактором, який потрібно враховувати лікарю, приймаючи рішення, починати антивірусну терапію або відкласти терапію на шість місяців після виявлення гострої HCV-інфекції. Якщо генотип пацієнта є гетерозиготним або гомозиготним по С, лікар може прийняти рішення відкласти терапію на шість місяців. Якщо генотип пацієнта є гомозиготним по Т, лікар може вважати, що рання противірусна терапія виправдана, оскільки спонтанна елімінація вірусу у пацієнта є малоймовірною. Дози і схеми дозування інших агентів, що використовуються у комбінованих терапіях даного винаходу для лікування HCV-інфекції, можуть бути визначені лікуючим лікарем, з врахуванням схвалених доз і схеми дозування, вказаних у листку-вкладиші; і віку, статі і загального стану здоров'я пацієнта. Агенти, що вводяться у комбінованій терапії HCV, можуть бути введені одночасно (тобто в одній і тій самій композиції або в окремих композиціях один відразу після іншого) або послідовно. Це особливо зручно, якщо компоненти комбінації надаються у різних схемах дозування, наприклад, один компонент вводять один раз на день і інший компонент вводять кожні шість годин, або якщо переважні фармацевтичні композиції є різними, наприклад, одна являє собою таблетку і інша являє собою капсулу. Набір, що містить окремі лікарські форми, відповідно, є переважним. Якщо IFN-α являє собою PEG12k-інтерферон-альфа-2b, такий як PegIntron® (пегінтерферон-альфа-2b) або його біоаналог, переважна схема лікування хронічної HCVінфекції включає 1,5 мкг/кг PEG12k-інтерферону-альфа-2b один раз на тиждень у комбінації з денними дозами 800-1400 мг рибавірину. Доза рибавірину враховує вагу пацієнта: 800 мг/день для пацієнтів вагою 40-65 кг, 1000 мг/день для пацієнтів вагою більше 65 і до 85 кг, 1200 мг/день для пацієнтів вагою більше 85 і до 105 кг, і 1400 мг/день для пацієнтів вагою більше 105 кг. У деяких варіантах здійснення рекомендована тижнева доза PEG12k-інтерферону-альфа-2b становить 0,5, 0,75 або 1,0 мкг/кг, і денна доза рибавірину становить 600-1400 мг рибавірину, виходячи з ваги пацієнта. Якщо IFN-α являє собою bPEG40K-інтерферон-альфа-2a, такий як PEGASYS® (пегінтерферон-альфа-2a) або його біоаналог, переважна схема лікування хронічної HCVінфекції включає 180 мкг/тиждень bPEG40K-інтерферону-альфа-2a у комбінації з денною дозою 25 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рибавірину 1000 мг для пацієнтів вагою менше 75 кг і 1200 мг для пацієнтів вагою більше або рівною 75 кг. У деяких варіантах здійснення рекомендована тижнева доза bPEG40Kінтерферону-альфа-2a є щонайменше на 25% менше 180 мкг. У деяких переважних варіантах здійснення схема комбінованого лікування, що застосовується для лікування пацієнтів, які хронічно інфіковані HCV генотипу 1 з високим вірусним навантаженням і позитивно тестуються щонайменше на один маркер відповіді на IFNα, включає ввідний період лікування від приблизно 2 до 17 тижнів, під час якого інтерферональфа, такий як PEG12k-інтерферон-альфа-2b і bPEG40K-інтерферон-альфа-2a, вводять у комбінації з рибавірином, за яким йде другий період лікування від приблизно 12 до приблизно 28 тижнів, під час якого вводять трьохкомпонентну комбінацію інтерферону-альфа, рибавірину та інгібітору протеази, такого як боцепревір або телапревір. Такі двофазні схеми лікування описані у публікації міжнародної патентної заявки WO 2009/038663. В особливо переважних варіантах здійснення ввідний період становить приблизно 4 тижні і другий період лікування становить приблизно 24 тижні. Злоякісні пухлини, що піддаються лікуванню IFN-α, включають меланому, хронічний мієлолейкоз (CML), нирково-клітинний рак (RCC), волосатоклітинний лейкоз, саркому Капоші, множинну мієлому, базально-клітинну карциному, злоякісну меланому, поверхневий рак сечового міхура (SBC), рак яєчників, фолікулярну лімфому, неходжкінську лімфому, шкірну Тклітинну лімфому, кондилому гострокінцеву, грибоподібний мікоз, карциноїдний синдром, колоректальний рак, папіломатоз гортані і старечий кератоз. Переважні злоякісні новоутворення і, відповідно, схеми дозування описані у схемах для хронічного гепатиту С, вказаних у маркіровці та в інструкції-вкладиші продуктів Roferon®-A (інтерферон-альфа 2A, рекомбінантний) і INTRON® А (інтерферон-альфа-2b, рекомбінантний). У переважних варіантах здійснення маркери відповіді на IFN-α даного винаходу застосовуються спільно з пегильованим IFN-α для лікування пацієнтів з меланомою, хронічним мієлолейкозом (CML) або нирково-клітинним раком (RCC), включаючи, наприклад, схеми лікування, описані у патентах США №№ 6923966 (меланома), 6605273 (RCC) і 6362162 (CML); Bukowski R., et al., Cancer 95(2):389-396 (2002); Bukowski R., et al., J. Clin Oncol. 20(18):3841-348 (2002); Garcia-Manero, G. et al., Cancer 97(12):2010-2016 (2003); Garcia-Manero, G. et al., Cancer 98(3): 437-457 (2003); Michallet, M. et al., Leukemia 18:309-315 (2004); Motzer, R.J. et al., J. Clin Oncol. 19(5): 1312-1319 (2001); Motzer, RJ. et al., Ann. Oncol. 13:1799-1805 (2002); Lipton, J.H., et al., Blood 100:782a Abstract 3091 (2002); Hochhaus, А., et al., Blood 100:164a Abstract 616 (2002); і Dummer et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:712 Abstract 2861 (2003). В одному переважному варіанті здійснення маркери відповіді на IFN-α винаходу використовуються для виявлення пацієнтів з меланомою високого ступеню ризику, які є придатними кандидатами для терапії IFN-α, особливо пацієнти на стадії IIB (пошкодження >4 мм, але без залучення лімфовузлів) і на стадії III (пошкодження >4 мм та із залученням лімфовузлів) первинної шкірної меланоми. Переважно терапія IFN-α використовується як ад’ювантна терапія після того, як пацієнти були прооперовані з приводу меланоми стадії IIB або стадії III. У більш переважних варіантах здійснення IFN-α, що використовується як ад’ювантна терапія, являє собою пегильований IFN-α. Пацієнти з меланомою, яких лікують відповідно до поліпшених способів даного винаходу, включають пацієнтів з вперше виявленим захворюванням, у яких не виявляли захворювання після операції, але які мають високий ризик системного рецидиву захворювання. Термін "пацієнти високого ризику", який використовується тут, означає пацієнтів з меланомою, у яких товщина ушкоджень за Бреслоу >4 мм, а також пацієнтів з будь-якою товщиною ушкоджень за Бреслоу з первинним або рекурентним залученням лімфовузлів. Лікування пегильованим IFN-α за даним винаходом буде продовжуватися до п'яти років, якщо тільки немає клінічних даних про прогресування захворювання, неприйнятної токсичності або побажань пацієнтів припинити терапію. Якщо пегильований IFN-α, що застосовується для лікування пацієнта з меланомою високого ризику, являє собою PEG12k-інтерферон-альфа-2b, такий як PegIntron® (пегінтерферон-альфа2b) або його біоаналог, переважна схема лікування включає введення пацієнту початкової дози 3,0-9,0 мікрограмів на кілограм один раз на тиждень (QW), переважно у межах від 4,5 до 6,5 мікрограмів на кілограм QW, більш переважно у межах 5,5-6,5 мікрограмів на кілограм QW і найбільш переважно приблизно 6,0 мікрограмів на кілограм QW. У деяких переважних варіантах здійснення пацієнт з меланомою високого ризику спочатку одержував лікування 6,0 мікрограмів на кілограм PEG12k-інтерферону-альфа-2b QW протягом восьми тижнів і потім 3,0 мікрограми на кілограм або менше PEG12k-інтерферону-альфа-2b QW протягом періоду часу тривалістю п'ять років мінус вісім тижнів початкового лікування. Якщо пацієнт одержує дозу менше 3,0 26 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мікрограмів на кілограм, наприклад, для підтримки переносимості пацієнтом лікування, дозу переважно зменшують на 1 мікрограм на кілограм під час кожного зменшення, наприклад, від 3,0 до 2,0 до 1,0. Якщо пегильований IFN-α, що застосовується для лікування пацієнта з меланомою високого ризику, являє собою bPEG40K-інтерферон-альфа-2a, такий як PEGASYS® (пегінтерферональфа-2a) або його біоаналог, схема лікування включає введення пацієнту дози приблизно від 50 мікрограмів до 500 мікрограмів QW, переважно приблизно від 200 мікрограмів до 250 мікрограмів QW. При введенні комбінованої терапії, яку вибирають для лікування пацієнта на основі наявності або відсутності маркера відповіді на IFN-α, терапевтичні агенти у комбінації або фармацевтичній композиції, або у композиціях, що містять терапевтичні агенти, можуть бути введені у будь-якому порядку, наприклад, послідовно, паралельно, спільно, одночасно і т.д. Кількості різних терапевтичних агентів такої комбінованої терапії можуть являти собою різні кількості (різні розміри дозування) або однакові кількості (однакові розміри дозування). У деяких варіантах здійснення агенти у комбінації вводять у дозах, що звичайно застосовуються, коли такі агенти використовують у вигляді монотерапії для лікування захворювання або стану пацієнта, тоді як в інших варіантах здійснення агенти вводять у дозах більш низьких, ніж дози, що звичайно застосовуються, коли такі агенти використовують у вигляді монотерапії для лікування захворювання або стану. У деяких варіантах здійснення терапевтичні агенти, що використовуються у комбінованій терапії, представлені у тій самій фармацевтичній композиції, яка може бути застосовна для перорального введення, внутрішньовенного введення, підшкірного введення або парентерального введення. Автори винаходу також припускають, що маркери відповіді на IFN-α, описані тут, могли б бути використані при звертанні за дозволом регуляторного органу для реалізації на ринку нового фармацевтичного продукту інтерферону-альфа з фармакогенетичним показанням, тобто показанням, яке включає компонент захворювання і компонент маркера відповіді IFN-α. Компонент захворювання являє собою захворювання, що піддається лікуванню IFN-α, і компонент генетичного маркера являє собою пацієнта, який позитивно тестований щонайменше на один з маркерів відповіді на IFN-α, описаних тут. Аналогічним чином, автори винаходу припускають тут, що вказані маркери відповіді на IFN-α є корисними при звертанні за дозволом регуляторного органу стосовно такого фармакогенетичного показання для схвалених у наш час лікарських засобів IFN-α, які лікарі призначають з небажанням при визначених захворюваннях, виходячи зі співвідношення одержуваної користі/ризику препарату для лікування таких захворювань у загальній популяції. Звертання за дозволом регуляторного органу стосовно фармакогенетичного показання звичайно передбачає вимірювання числа випадків бажаної відповіді на лікарський препарат у двох окремих групах пацієнтів, які одержували лікування ліками. Кожний суб'єкт в одній з груп має захворювання і генетичні профілі, за якими пацієнта відносять до фармакогенетичного показання, що пропонується. Суб'єкти в іншій групі можуть бути вибрані випадковим чином незалежно від того, чи мають вони компонент генетичного маркера фармакогенетичного показання, що пропонується. З іншого боку, суб'єктів розподіляють в іншу групу таким способом, який дає у результаті "контрольну" групу, в якій процент суб'єктів, які відповідають і не відповідають компоненту генетичного маркера аналогічний тому, що спостерігається у загальній популяції, або у популяції пацієнтів з компонентом захворювання фармакогенетичного показання, що пропонується. Фармацевтичний продукт, для якого одержують дозвіл, може бути введений двом групам у проспективному клінічному дослідженні. Альтернативно, може бути зроблений ретроспективний фармакогенетичний аналіз пацієнтів, які одержували лікування лікарським засобом у минулому. Фармацевтичний продукт, для якого ведуть пошук фармакогенетичного показання, може оцінюватися з іншими терапевтично активними агентами, наприклад, інший лікарський засіб з ефективністю для лікування захворювання або стану у пропонованому фармакогенетичному показанні, або агент, який призначений для зменшення числа випадків небажаного ефекту, що викликається лікарським засобом. У деяких варіантах здійснення фармакогенетичне показання, для якого одержують дозвіл регуляторного органу, може включати інші маркери (генетичні маркери або біомаркери) або предиктори відповіді на лікарський засіб. Наприклад, швидка вірусологічна відповідь HCV (RVR) на комбіновану терапію пегильованим інтерфероном-альфа і рибавірином є хорошим предиктором досягнення SVR. Фармакогенетичне дослідження може бути розроблене після консультації з представниками регуляторного органу або державної організації, затвердження якої необхідне перед 27 UA 106756 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 просуванням на ринку фармакогенетичного фармацевтичного продукту у визначеній країні. Переважно, регуляторний орган уповноважений урядом великої промислово-розвиненої країни, такої як Австралія, Канада, Китай, країна - член Європейського союзу, Японія і т.п. Найбільш переважно, регуляторний орган уповноважений урядом Сполучених Штатів і тип заявки, яка подається для затвердження, буде залежати від юридичних вимог, встановлених в останній прийнятій версії Закону про харчові продукти, лікарські препарати і косметичні засоби, які застосовні до фармацевтичного продукту і також можуть включати інші міркування, такі як вартість складання обов'язкової звітності і маркетингова стратегія для фармацевтичного продукту. Наприклад, якщо фармацевтична композиція у фармацевтичному продукті була раніше затверджена для компонента захворювання, фармакогенетичного показання, що пропонується, то заявка може являти собою паперову NDA, додаткову NDA або скорочену NDA, але може бути потрібно, щоб заявка була повною NDA, якщо фармацевтична композиція не була затверджена раніше; причому вказані терміни мають значення, застосовні до них фахівцями у фармацевтичній галузі або як визначено у законі “Про цінову конкуренцію на ринку лікарських засобів і відновлення терміну дії патенту" від 1984. Один очікуваний результат фармакогенетичного клінічного випробування з використанням маркерів відповіді на IFN-α винаходу являє собою схвалений для представлення на ринку фармацевтичний продукт, який включає (1) фармацевтичну композицію інтерферону-альфа і (2) інструкцію-вкладиш, яка включає фармакогенетичне показання, для якого рекомендована фармацевтична композиція. Інструкція-вкладиш звичайно знаходиться у листку-вкладиші, також часто називаному листок-вкладиш в упаковці або етикетка для лікарського засобу. Як обговорювалося вище, фармакогенетичне показання мають два компоненти: компонент захворювання і компонент маркера відповіді на IFN-α. Таким чином, інструкція-вкладиш описувала б групи пацієнтів, які генетично визначаються, в яких була показана ефективність лікарського препарату стосовно одного або більше захворювань, симптомів або медичних станів. У деяких варіантах здійснення в інструкції-вкладиші буде розглядатися, як ідентифікувати суб'єктів які складають групу, що генетично визначається. Наприклад, у деяких варіантах здійснення в інструкції-вкладиші визначено, що лікарський препарат показаний суб'єктам, позитивно тестованим на один або більше маркерів відповіді на IFN-α, описаних тут. З іншого боку, в інструкції-вкладиші може говоритися, що лікарський засіб протипоказаний суб'єктам, негативно тестованим на один або більше з усіх вказаних маркерів відповіді IFN-α. У деяких переважних варіантах здійснення інструкція-вкладиш включає назву щонайменше одного затвердженого діагностичного тесту, який використовують для виявлення наявності або відсутності передбаченого компонента генетичного маркера фармакогенетичного показання. Як описано вище, фармакогенетичне показання для фармакогенетичного фармацевтичного продукту винаходу може включати додаткові маркери або предиктори відповіді на фармацевтичну композицію IFN-α і/або вимогу використовувати лікарський засіб у комбінації з одним або більше іншими терапевтично активними агентами. Інструкція-вкладиш може містити інформацію про рекомендовані дози і схеми лікування. У деяких варіантах здійснення фармакогенетичний фармацевтичний продукт надається у вигляді композиції або в упаковці, яка має характерний зовнішній вигляд, який виробник ввів для ідентифікації фармацевтичного продукту як фармакогенетичного продукту, щоб допомогти фармацевтам і лікарям відрізнити вказаний продукт від інших продуктів, що продаються, які містять такий же або подібний активний інгредієнт IFN-α, який, однак, не має фармакогенетичного показання. Використання оформлення фармацевтичних композицій і упаковки фармацевтичного продукту як частини створення характерного бренду фармацевтичних продуктів добре відоме у даній галузі, і включає форму і колір таблеток або капсул, а також символи або логотипи, проштамповані на них або на пакувальному матеріалі фармацевтичного продукту. У переважних фармакогенетичних фармацевтичних продуктах винаходу фармацевтична композиція включає пегильований інтерферон-альфа-2a, пегильований інтерферон-альфа-2b або альбінтерферон-альфа-2b. Більш переважно, фармацевтична композиція включає bPEG40K-інтерферон-альфа-2a або PEG12k-інтерферон-альфа-2b. Переважне фармакогенетичне показання для фармацевтичних продуктів винаходу включає застосування фармацевтичної композиції для лікування пацієнтів, які хронічно інфіковані HCV генотипу 1 і мають позитивний результат тесту щонайменше на один з маркерів відповіді на IFN-α у гомозиготному стані, описаних тут. У деяких переважних варіантах здійснення пацієнти мають високе початкове вірусне навантаження HCV, як визначено вище. У більш переважних варіантах здійснення в інструкції-вкладиші вказано, що фармацевтична композиція інтерферону-альфа показана у комбінації щонайменше з одним іншим противірусним агентом 28