Застосування каротиноїду фітоїну з біомаси гриба blakeslea trispora як радіопротекторного засобу

Реферат: Винахід належить до застосування каротиноїду фітоїну у складі ліпідного комплексу, що екстраговано з біомаси гриба Blakeslea trispora як радіопротекторного засобу. UA 100930 C2 (12) UA 100930 C2 UA 100930 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі медицини, зокрема до фармакології, і може бути використаний у фармацевтичній промисловості при виробництві лікувальних та профілактичних препаратів радіопротекторної дії. Відома речовина, що має радіопротекторну дію [1], що містить ліпофільний комплекс чорноплідної горобини. Недоліком цього винаходу є відсутність відомостей про активну діючу речовину (або речовини) ліпофільного комплексу чорноплідної горобини, що саме впливають на його радіопротекторні особливості. Оскільки, варіабельність показників чорноплідної горобини може бути досить суттєвою за різних погодних та інших умов її вирощування, то і ефективність використання ліпофільного комплексу може буди надто різною, що призводить до неможливості гарантування постійно позитивного ефекту від даної речовини. Як прототип, прийнято патент на винахід [2], відповідно до якого як радіопротекторний засіб використовують розторопшу плямисту Silybum marianum. Даному винаходу властиві такі ж самі недоліки, як і попередньому, а саме - неможливість визначення саме тієї активної речовини (або комплексу речовин) з чіткою хімічною формулою та ефективною дозою, що гарантовано сприяло б радіопротекторному захисту. Задачею пошуку ефективного радіопротекторного засобу було визначення складового інгредієнта у структурі природного комплексу, що має високу лікувальну та біологічну активність. Поставлена задача вирішується тим, що як радіопротекторний засіб застосовується каротиноїд фітоїн у складі ліпідного комплексу, що екстраговано з біомаси гриба Blakeslea trispora. Використання як радіопротекторного засобу каротиноїду фітоїну у складі ліпідного комплексу, який екстраговано з біомаси штаму міцеліального гриба Blakeslea trispora, що синтезує фітоїн [3,4], гарантує натуральне рослинне походження цього компонента та забезпечує радіопротекторному засобу велику привабливість і біологічну цінність, а також гарантує наявність в екстракті комплексу ліпідів, які синтезуються грибом, та є природним середовищем, в якому синтезується каротиноїд фітоїн. Ефективність застосування ліпідного комплексу з фітоїном, що отримано з біомаси гриба Blakeslea trispora, та визначення способу радіопротекторного захисту здійснювали в дослідах на моделях біологічних мембран. Біологічні мембрани грають найважливішу роль в життєдіяльності клітин. Висока чутливість ліпідів і фосфоліпідів, що є основними структурними компонентами біологічних мембран, до окислювального стресу, у тому числі і обумовленому променевою дією, є наслідком високого вмісту в них ненасичених жирних кислот. Як моделі біологічних мембран було використано ліпосоми, що отримано з фосфоліпідів жовтків курячих яєць. Фосфоліпіди здатні утворювати у воді ліпосомні емульсії, що дозволяє досліджувати в модельних експериментах протипроменеві та антиокислювальні властивості різних водонерозчинних і водорозчинних сполук, у тому числі і водонерозчинного фітоїну. Для отримання ліпосом 20 мг фосфоліпіду, розчиненого у хлороформі, вносили в конічну пробірку і висушували під вакуумом. Потім до висушеного зразка додавали 2 мл сольового розчину, що містить 0,15 М NaCl, 0,005 М КС1, 0,0012 М КН2РО4, 0,0012М Na2HPO4 при рН 7,4. Суміш збовтували, поміщали в ультразвукову баню на 30 секунд, потім доводили загальний об'єм до 10 мл, перемішували, ще раз обробляли ультразвуком і отримували суспензію ліпосом з концентрацією фосфоліпіду 2 мг/мл. Для отримання ліпосом, в структурі яких містяться різні концентрації фітоїну, змішували в певних співвідношеннях розчини фосфоліпіду в хлороформі і фітоїну у складі ліпідного комплексу з біомаси гриба Blakeslea trispora, отриману суміш висушували, суспендували в сольовому розчині з подальшим обробленням ультразвуком, отримуючи суспензії ліпосомів з фітоїном у співвідношеннях фітоїн:фосфоліпід, рівних 1:10 і 1:100. Дія іонізуючого випромінювання на молекули води в аерованих умовах індукує появу активного ОН* радикала, який є активним окисником, що здатний при опроміненні ліпосомної емульсії індукувати в ліпосомах процеси перекисного окислення фосфоліпідів. Для проведення радіаційно-індукованого окислення ліпосом 1 мл ліпосомальної емульсії, що містить 2 мг/мл фосфоліпіду і різні концентрації фітоїну, опромінювали в дозі 500 Гр в умовах аерації γ60 квантами Со при потужності дози 84,8 Гр/хв в сольовому розчині. За рахунок радикала ОН*, який виникає в результаті розкладання органічних перекисних ++ сполук у присутності іонів Fe , в ліпосомах також індукуються реакції перекисного окислення фосфоліпідів. Перекисне окислення ліпосом ініціювали збільшенням до 1 мл ліпосом 0,05 мл 1 UA 100930 C2 ++ 5 10 15 20 25 1,0 мМ розчину FeSO4, що створювало кінцеву концентрацію Fe , рівну 50 мкМ. Суміш ретельно перемішували і інкубували впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі. ++ Ефективність радіаційного і Ре -індукованого окислення ліпосомної емульсії оцінювали по виходу малондіальдегіду (МДА), який є одним з кінцевих продуктів перекисного окислення ліпідів. Після завершення опромінення або реакції індукованого окислення до 1 мл ліпосомної емульсії додавали 2 мл комбінованого розчину, що складається з 15 %-ної трихлороцтової кислоти, 0,375 % тіобарбітурової кислоти (ТБК), 0,25 М НСl, а також 0,005 % ЕДТА і 0,00025 % іонолу. Отриману суміш прогрівали в киплячій водяній бані впродовж 20 хвилин, потім охолоджували і освітлювали центрифугуванням впродовж 15 хвилин при 2000 об/хв. Оптичну густину забарвлених ТБК-продуктів визначали при 532 нм. Концентрацію ТБК-продуктів розраховували за даними визначення оптичної густини, враховуючи, що молярний коефіцієнт -1 . -1 екстинкції цих продуктів при 532 нм складає 156000 моль см . Присутність у суспензійному середовищі хімічних агентів може знижувати індуковане ++ випромінюванням або Fe утворення МДА, що свідчить про наявність у цих сполук протипроменевих або антиокислювальних властивостей. Приймаючи за 100 % рівень підвищення МДА при індукованому окисленні ліпосом над рівнем спонтанного окислення фосфоліпідів при відсутності фітоїну, а також враховуючи ту обставину, що наявність у складі ліпосом фітоїну може модифікувати спонтанний рівень їх окислення, ефективність захисту (Е3) ок у відсотках від індукованого окислення ліпосом розраховували за формулою: . (ЕЗ)ок=(СФок-СФк) 100 / (Сок-Ск), де СФК, СФок - концентрації МДА, що визначені у ліпосомах з присутністю фітоїну, відповідно, до і після індукованого окислення ліпосом; Ск, Сок - концентрації МДА, що визначені у контрольних ліпосомах (без фітоїну), відповідно, до і після індукованого окислення ліпосом. Результати зазначено у Таблиці. Таблиця Протипроменеві та антиокислювальні властивості фітоїну Співвідношення фітоїн:фосфоліпід 1:100 1:10 30 35 40 45 50 % захисту від опромінення 37,2±5,2 62,0 ± 10,4 ++ % захисту від Fe індукованого окислення 1.8,7±11,5 50,9 ± 6,6 Проведені експерименти показали, що фітоїн захищає ліпосоми від окислювального стресу, що індукується дією опромінення або іонами двовалентного заліза. Переваги запропонованого препарату полягають у тому, що він містить активну діючу речовину визначеного складу та структури, що дозволяє ефективно дозувати радіопротекторний засіб і найбільш активно сприяти захисту від радіоактивного випромінювання. Вибране джерело сировини складається з інгредієнтів натурального походження, що посідає велике значення для лікувально-профілактичної і терапевтичної дії засобу. Радіопротекторний засіб одержують таким чином. Висушену біомасу гриба Blakeslea trispora отримують з фітоїнового штаму, наприклад, за патентом [3] відповідно до технології ферментації, що описано, наприклад, у патенті [4]. Потім біомасу екстрагують в олії, наприклад, за технологією, що описана у патенті [5]. Отриманий ліпідно-олійний розчин з фітоїном вводять у склад лікарських форм, що мають жирову форму, після чого здійснюють їх переробку у кінцеву споживчу форму - розчини, желатинові капсули тощо. Джерела інформації: 1. Патент України № 19231, А61К 36/73, А61Р 17/16, дата публікації 25.12.1997, Бюл. № 6. 2. Патент України № 29568, А61К 35/78, дата публікації 15.11.2000, Бюл. № 6. 3. Патент України № 85489, C12N 1/11, С12Р 23/00, C12N 15/01, C12R 1/645, дата публікації 11.03.2008, Бюл. № 5. 4. Патент України № 86556, С12Р 23/00, C12N 1/14, дата публікації 27.04.2009, Бюл. № 8. 5. Патент України № 82090, С07С 403/00, A23L 1/302, А61К 31/07, С09В 61/00, С12Р 23/00, дата публікації 15.02.2006, Бюл. № 2. 2 UA 100930 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Застосування каротиноїду фітоїну у складі ліпідного комплексу, що екстраговано з біомаси гриба Blakeslea trispora як радіопротекторного засобу. 5 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3