Штам гетероталічного гриба blakeslea trispora – продуцент лікопіну

Штам гетероталічного гриба Blakeslea trispora, депонований у депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАНУ ім. Д.К.Заболотного за № IMB F 100041, - продуцент лікопіну. (19) (21) 20041210870 (22) 28.12.2004 (24) 15.02.2006 (46) 15.02.2006, Бюл. № 2, 2006 р. (72) Тюрєнков Алєксєй Алєксандровіч, RU, Туріянський Юрій Давидович, Кунщикова Інна Сергіївна, Стенько Алла Степанівна, Кунщикова Євгенія Олександрівна, Безкоровайна Надія Карпівна, Горна Маргарита Степанівна (73) Тюрєнков Алєксєй Алєксандровіч, RU, Туріянський Юрій Давидович, Кунщикова Інна Сергіївна, 3 75002 4 льтивуванні (+) і (-) статевих форм [5, 6]. ологічними властивостями. Відома біотехнологія одержання лікопіну на Морфологічні властивості: основі гриба Bl.trispora штам 8А(+) та 8А(-) шляхом ЛК1(+) форма має добре розвинений повітрякультивування на живильному середовищі з доданий міцелій, від сірувато-жовтого до жовтого кованням стимулятора лікопіногенезу - амінометилльору. Субстратний міцелій такого ж кольору. Інперидину та природного стимулюючого агента тенсивне спороутворення. Нестатеве (тютюнова крошка) як інгібіторів циклаз - ферменспороутворення тільки спорангіальне, представтів, що припиняють синтез на стадії лікопіну не лене стилоспорангіями і спорангіями. Стилоспорангії 50-100мкм в діаметрі. Спорангії еліптичноперетворюючи його в -каротин. При цьому вихід лікопіну становив 0,49-0,7г/л середовища.[7]. Нешаровидні 12 16-10 14мкм, триспорові, багаточидоліками є подовжена ферментація (110год.), висельні; спорангіоспори також еліптичні 14 8мкм, користання стимуляторів лікопіногенезу (токсичсвітло-тютюнового кольору і мають довгасту покних), та недостатньо ефективна екстракція з ресленість. біомаси. Використання стимуляторів лікопіногенеЛК1(-) статева форма: повітряний міцелій роззу 2-аміно-6-метилпіридину є більш ефективним, винений нерівномірно - від слаборозвиненого до ніж два попередніх, але практичне їх використання пухнастого, спороутворення слабо виражене, в масштабних промислових виробництвах небамайже відсутнє. Субстратный міцелій дуже щільжане через високу токсичність. ний, товстий, добре знімається має яскравоНайбільш близьким до запропонованого винамалиновий колір. ходу штам гриба Вl. trispora ВСБ129(-) і ВСБ130(+), При сумісному вирощуванні (+) і (-) статевих який одержано в результаті багатоступеневої сеформ зона зигоспороутворення відсутня (чорні лекції і форми якого при глибинному спільному зиготи), але утворюється широка (2-3см) зона ясккультивуванні накопичують до 35мг лікопіну на 1г раво-малинового кольору. За цією ознакою вели сухої маси або 0,8г/л культурального середовища селекцію високоактивного лікопінового штаму за без додаткового внесення стимулятора лікопіногемаркером (Іус+). незу. Живильним середовищем штаму слугувало Фізіологічні властивості: оптимальним живильмінеральне середовище з глюкозою, що можливо ним середовищем для гриба є сусло-агар. Добре лише в умовах лабораторії, але в промислових росте гриб на 5-6% кукурудзяному агарі, м'ясопепумовах біотехнологія на мінімальному середовищі тонному агарі (ΜΠΑ), гірше - на середовище Чапе(середовище з мінеральних солей) нереальна. ка. Оптимальна температура культивування 28°С. Цей штам проходив випробування в умовах вироГриб вирощується на косяках із сусло-агаром або бництва на середовищах з кукурудзяним екстракна чашках Петрі 16-21 добу. том та зеленою патокою і активність його складаДля зберігання культури гриба використовула від 0,9 до 1,8%. За таких умов низького виходу ється зерно ячменю, проса, вівса після 3-4 кратної цільового продукту подальше його використання промивки та стерилізації при 0,75атм 30. Оптимавважали недоцільним [8]. льними умовами зберігання є грунт після спеціаЗадачею винаходу, що запропоновано, є льної обробки. Із культури готується споровоотримання нового штаму мікроскопічного гриба міцеліальна суспензія і висівається на середовиBl.trispora, з певними ознаками і високою активнісще. Для глибинного культивування (на колбах і в тю як штаму-продуценту лікопіну. цеху) використовують посівні і ферментаційні сеЗадача вирішується за допомогою селекції та редовища наступного складу. використання нового штаму - продуценту лікопіну Посівне середовище (в %): мікроскопічного гриба Blakeslea trispora ЛК1(+) та соєве борошно - 2,3 ЛК1(-). кукурудзяне борошно - 4,7 Штам Bl.trispora ЛК1(+) та ЛК1(-) має родовід КН2РО4 - 0,005 від клонів штаму Bl.trispora ТКСТ(+) ТКСТ(-) і вітамін В1 - 0,0002 отримано шляхом двох етапів селекції. 1). Етап вода водопровідна до 1л рн=6.0-6,5 одержання ріфампіцинрезистентних (Rif) клонів на Стерилізація при 120-122°С 40'. твердому (сусло-агар) середовищі з додаванням Середовище розливається в колби ємністю 1000-2000 мкг/мл ріфампіцину; 2). Етап селекції 750см3 по 200см3 одержаних Rif клонів на середовищі з 30% олійним Ферментаційне середовище (в %): розчином токоферол ацетату. зелена патока -8-10-12-14 Селекція проводилась паралельно на двох (+) кукурудзяний екстракт - 8-12-14-16 та (-) статевих формах. вода водопровідна до 100% Характеристика штаму ЛК1(+) і ЛК1(-) рн=6.0-6,5 Гриб Blakeslea trispora відноситься до мукороСтерилізація при температурі 120-122° 40'. вих грибів класу Mucoraceae (раніше вид Штам ЛК1(+) і ЛК1(-) - прототрофний та резисChoanephora, реідентифікованим у вид Blekeslea тентний до ріфампіцину 50.000од. trispora на основі досліджень Kirka в 1984р. та Отримання цільового продукту - лікопіну ілюсописаних у визначнику "A monograph of the трується наступними прикладами. Choanephoraceae, Mycological paper, Kew, England, Приклад 1 1984, №152, p. 1-61). Штам ЛК1(+) і ЛК1(-) депоноОтримання лікопіну при вирощуванні штаму вано у колекції інституту, мікробіології та вірусологриба Bl.trispora ЛК1(+) і ЛК1(-) в лабораторних гії НАНУ ім. Д.К. Заболотного під № ІMB F 100041 умовах. 09 грудня 2004р. Вище названий штам відрізняСпорово-міцеліальною суспензією, взятої із ється від інших за своїми морфологічними та фізікосяків 16-21 добового віку засівались маточні 5 75002 6 колби з посівним середовищем (приведене вище). Приклад 2 Вирощування продовжується на качалках при 180Отримання лікопіну при вирощування ЛК1(+) і 220об/хв на протязі 3 діб при 28°С. Після цього ЛК1(-) в умовах ферментерів у промисловому вивизначається накопичення біомаси і в залежності робництві. від цього засіваються колби ферментаційним сеСпорово-міцеліальною суспензією гриба редовищем (приведене вище) у співвідношенні 1:6 Bl.trispora ЛК1(+) та ЛК1(-) засівають маточні колби - 1:7 (+) і (-) статевих форм відповідно. Культивуі вирощуються на посівному середовищі (вказане вання продовжується на качалках при 180вище) на качалках при 180-220об/хв., окремо (+) і 220об/хв на протязі 3діб при 28°С. (-) статеві форми на протязі 3-х діб при 28°С. Після Масову частку лікопіну визначають спектроцього засівають посівні апарати з посівним серефотометричним методом. Наважку біомаси (м) довищем (з додаванням у нього 3% олії), яке виретельно розтирають в ступці з піском, куди додарощується 2-3 доби в залежності від накопичення ють декілька крапель хлороформу до одержання біомаси гриба. однорідної суміші червоного кольору. Одержана Через 3 доби (+) і (-) статеві форми з посівних суміш із гексаном переноситься на фільтрувальну апаратів пересівають в 10м3 ферментери з ферлійку (d=16) і промивається до повного знебарвментаційним середовищем та піногасником в кільлення суміші біомаси з піском. Розчин збирають у кості 0,05-0,25%. Заповнення ферментера 70% колбу з тубусом, потім переносять у мірну колбу, об'єму. Активність штаму складає 0,9-1,2г/л кульоб’єм розчину доводять гексаном до 100см3 (V). туральної рідини або 2,9-3,6% лікопіну в сухій біоОптичну густину одержаного розчину вимірюмасі. ють на КФК-3 в кюветі з товщиною шару 1см: Отже, одержані результати свідчать про те, - при довжині хвилі 502нм (Д502) що новий штам - продуцент лікопіну Bl.trispora Для контрольного розчину використовують геЛК1(+) та ЛК1(-), активність якого складає 0,9ксан. 1,2г/л культуральної рідини або 2,9-3,6% на 1кг Масову частку лікопіну (L) у відсотках обчиссухої біомаси, є більш активним в порівнянні з люють за формулою: штамом - прототипом при вирощуванні в рівних умовах.. 6 7,16 Д 10 , 502 1 49Д451 536,85V 100% Список літератури L m1000 1. Macio P. D, Devasagayam Τ. Ρ. Α., Kaiser S, Де L - масово частка лікопіну, %; Sies. Biochem. Soc. Transactions, 1990, v.l 8, N6, p. Д502 - оптична густина досліджуваного розчину 1055-1056. (показання приладу) при довжині хвилі 502нм; 2. American journal of epidemiology, 1999, v.149, V - об'єм досліджуваного розчину, см3; "Carotenoids vs. diabetes", p. 168-176. m - маса наважки біомаси, г; 3. Патент РФ №2039775 536,85 - молекулярна маса лікопіну; 4. A.c. СССР №1071636 100 - коефіцієнт перерахунку у відсотки. 5. Патент РФ №2112747 Загальний вихід лікопіну на колбах складає 6. Патент РФ №2126806 1,1-1,3г/л культуральної рідини.(90-96% каротино7. Патент WO 03038064 їдів) Комп’ютерна верстка Л. Купенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601