Мукоровий гриб blakeslea trispora штам pht 1+, pht 1- – продуцент фітоїну

1. Мукоровий гриб Blakeslea trispora штам Pht 1+; Pht 1 - - продуцент фітоїну, депонований в депозитарії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за № F-100053. 2. Мукоровий гриб за п. 1 з виходом фітоїну 1015%. 3. Мукоровий гриб за п. 1 з відсутністю забарвлення субстратного міцелію. UA (21) a200714381 (22) 20.12.2007 (24) 26.01.2009 (46) 26.01.2009, Бюл.№ 2, 2009 р. (72) СОРОКА ЯРОСЛАВ МИХАЙЛОВИЧ, U A, ДМИТРЕНКО ГАЛИН А МИКОЛАЇВНА, UA, СТЕНЬКО АЛЛА СТЕП АНІВН А, U A, ГОРНА МАРГ АРИТА СТЕПАНІВН А, U A, ТУРІЯНСЬКИЙ ЮРІЙ ДАВИДОВИЧ, UA, ТЮРЄНКОВ АЛЄКСЄЙ АЛЄКСАНДРОВІЧ, ТЮРЄНКОВ ВЛАДІМІР (73) АЛЄКСАНДРОВІЧ ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "НАУКОВО ВИРОБНИЧЕ ПІДПРИЄМСТВО "ВІТАН", U A (56) Thomas, D.M. Goodwin, T.W. Studies on carotenogenesis in Blakeslea trispora-I. - General observations on synthesis in mated and unmated strains., Phytochemistry, 6 (3), p.355-360, Mar 1967 [но-лайн], [найдено 12.11.2008]. Найдено із Інтернет: T C Lee, D B Rodriguez, I Karasawa, T H Lee, K L Simpson, and C O Chichester. Chemical alteration of carotene biosynthesis in Phycomyces blakesleeanus and mutants., Appl Microbiol, 1975 December; 30(6): 988–993. PMCID: PMC376580 [но-лайн], [найдено 12.11.2008]. Найдено із Інтернет: Daisuke Umeno, Alexander V. Tobias, and Frances H. Arnold. Diversifying Carotenoid Biosynthetic Pathways by Directed Evolution., Microbiol Mol Biol Rev, 2005 March; 69(1): 51–78. doi: 10.1128/MMBR.69.1.51-78.2005. PMCID: PMC1082795 [но-лайн], [найдено 12.11.2008]. Найдено із Інтернет: < URL: http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?tool =pmcentrez 2 (19) 1 3 85489 4 4. Мукоровий гриб за п. 1 з інтенсивним нестатевим спороутворенням. 5. Мукоровий гриб за п. 1 з наявністю білої зони без зигоспороутворення при сумісному вирощуванні на чашці. Винахід відноситься до біотехнології, а саме, одержання природного каротиноїду фітоїн у шляхом мікробіологічного синтезу, який може бути використаний у медицині, харчовій та косметичній індустріях. Фітоїн - природний каротиноїд з вираженою біотехнологічною активністю, має набір багатьох цінних якостей значний фармацевтичний потенціал (лікування та профілактика хвороб дихальних шляхів, шлунково-кишкового тракту, серцевосудинної системи, зору; має антиоксидантні, фотозахисні та антиканцерогенні властивості), а також широке застосування в харчовій та косметичній індустріях. Зокрема, в косметичній індустрії йому відводиться роль фактора попереджуючого глибоке проникнення УФ променів в шкіру, опіків шкіри, сприяє омолодженню шкіри [1-4]. Фітоїн (7, 8, 11, 12, 7', 8', 11', 12'-октагідро- g g -каротин) - безбарвний каротиноїд має ациклічний ізопреноїдний ланцюг С40Н64. Він є попередником біосинтезу лікопіну і b -каротину: фітоїн - фітофлуїн - z -каротин – нейроспорін - лікопін - b каротин. Фітоїн синтезується з двох молекул геранілгеранілпірофосфату (GGPP) за участю фітоїнсинтетази; геранілгеранілпірофосфат утворюється шляхом конверсії мевалонової кислоти або конденсацією пірувату та гліцеральдегід-3-фосфату. Фітоїн на відміну від лікопіну і b -каротину стійкий до світла та окиснення, чим має певні переваги у використанні. Фітоїн можна одержати із вищих рослин та водоростей. Серед них найбільш доступним джерелом є Dunaliella species. Культивування Dunaliella sp. можна проводити у відкритих солених озерах при інтенсивній інсоляції, а також в умовах вирощування в ферментерах. Вона синтезує від 1 до 30мг/л фітоїну. Вченим Ізраїлю шляхом хімічного мутагенезу вдалось одержати білі варіанти водорості Dunaliella sp.; що синтезують більше фітоїну [5], але тільки в комплексі з фітофлуїном. Здатність синтезувати каротиноїди мікроорганізмами відома, але це лише синтез комплексного набору каротиноїдів. Відомо більше 600 різних каротиноїдів і джерел їх походження та лише мала частка цих джерел може бути використана як продуцент біологічно-активних речовин. На сьогодні невідомо продуцентів фітоїн у серед мікроорганізмів. Задача винаходу, що запропоновано - одержання штаму-продуценту фітоїн у міцеліальним грибом Blakeslea trispora, який на сьогодні є продуцентом лікопіну і b -каротину. За допомогою селекції гриба Blakeslea trispora з використанням дифеніламіну (5-10мг/мл) нами одержано Pht 1+ і Pht 1-. Характеристика штаму Pht 1+ і Pht 1Гриб Blakeslea trispora відноситься до мукорових грибів класу Mucoraceae (Choanephora реідентифікований у вид Blakeslea trispora на основі досліджень Kirka у 1984р. та описаних у визначнику "A monograph of the Choanephoraceae. Mycological paper, Kew, England, 1984, №152, p.1-61). Штам депоновано у Колекції промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України під № F-100053 Морфологічні властивості Pht 1+ статева форма - добре розвинений повітряний міцелій від сірувато-білого до сіруватожовтого кольору. Субстратний міцелій такого ж кольору, добре розвинений, щільний. Спороутворення слабке. Pht 1- статева форма - повітряний міцелій розвинений, білого кольору, спороутворення інтенсивне нестатеве, тільки спорангіальне, представлене стилоспорангіями і спорангіями. Спорангії еліптично-шаровидні 12x16 - 10x12мкм, триспорові, багаточисельні. Субстратний міцелій проростає в середовище, липкий і погано відділяється від агаризованого середовища. При сумісному вирощуванні (+) і (-) статевих форм зона зигоспроутворення відсутня, але утворюється широка біла зона. Фізіологічні властивості: оптимальним живильним середовищем для гриба є сусло-агар, добре росте на кукурудзяному 6-5% агарі, МПА, гірше на середовищі Чапека. Температурний оптимум 28°С. Гриб вирощується на косяках із суслоагаром або чашках Петрі 7-10 діб. Для зберігання культури гриба використовують ґр унт після спеціальної обробки та стерилізації. Для глибинного культивування (в колбах) використовують посівне та ферментаційне середовища наступного складу. Посівне середовище, г/л: борошно кукурудзяне - 47,0; борошно соєве -28,0; КН2РО4 - 0,5; вода водопровідна - 1,0л; рН=6,3-6,4. Ферментаційне середовище, г/л: борошно кукурудзяне - 14,0; борошно соєве - 33,0; олія - 26,5; вода водопровідна - 1,0л; рН=6,3-6,4. Середовища розливають в колби ємністю 750мл по 100мл. Стерилізацію обох середовищ здійснюють в автоклаві при 120-122°С протягом 40хв. Штам - прототроф. Отримання цільового продукту - фітоїн у - ілюструється наступними прикладами Приклад №1 Отримання фітоїну при вирощуванні гриба Blakeslea trispora Pht 1+ і Pht 1- в лабораторних умовах. На чашках Петрі при сумісному вирощуванні агарових дисків з (+) і (-) статевими формами 7-й добового віку наносяться полярно і культивуються 5 85489 7 діб. На зоні дотику 2-х статевих форм утворюється широка біла смуга без зигоспороутворення. З цієї зони брали наважки 5-7мг, екстрагували в гексані та визначали фітоїн за допомогою спектрофотометру. Визначення концентрації фітоїну проводиться наступним чином: наважку 4-8мг фітоїнової біомаси переноситься у пробірку з 0,5-0,6г Na2SO4 безводного, додається 5см 3 гексану, ретельно розтирається біомаса скляною паличкою, пробірка закривається корковою чи поліпропіленовою пробкою і залишається для екстракції в темному місці на 1 годину. Після цього повторно розтирається суспензія біомаси з сульфатом натрію безводного і перемішується на вортексі. За допомогою спектрофотометру проводяться вимірювання оптичної густини при довжині хвилі l = 286нм (якщо оптична густина перевищує показник 2, то розчин розбавляється гексаном і об'єм розбавлення враховується під час розрахунку концентрації). В якості контролю використовується чистий гексан. Обробка результату Концентрацію (С) в % обчислюють за формулою: D×V С= , де: m × l × A1% D - оптична густина розчину, що досліджується; V - об'єм розведення, см 3; m - маса наважка зразку, г; l - товщина кювети для вимірювання, см; А1% - екстинкція одновідсоткового розчину, яка для фітоїну, розчиненого в гексані, становить 915 ( l = 286нм ). Паралельно визначається вологість біомаси: наважку біомаси 0,15-0,20г зважується з точністю до 5-го знаку і висушується в сушильній шафі 4045хв. Після сушки зважується зразок і визначається вологість. Контролем слугували такі ж наважки кожної із статевих форм, вирощених окремо. Якщо у окремо вирощеній (+) і (-) статеви х форм концентрація фітоїн у складала 0,35-0,38%, то при сумісному вирощуванні концентрація складала від 6 до 1115%. Тобто при спільному вирощуванні концент 6 рація фітоїну в 30 разів вища, ніж окремо взятих форм. Спектр поглинання фітоїну в наших дослідженнях порівнювали з даними, представленими Г. Бріттоном та ін. Спектри фітоїну отримані при скануванні екстрактів з біомаси штаму Pht 1 на спектрофотометрі Helios g , l max : 276; 286; 297 (а) і спектр представлений Г. Бріттоном та ін. [6] (Фіг.2). Приклад №2 Отримання фітоїну при вирощуванні Pht 1(+) і Pht l(-) в колбах на качалках. Споровоміцеліальною суспензією, яку змивали із косяків 7-добового росту, засівали маточні колби з посівним середовищем, що наведені вище. Вирощування продовжується на качалках при 180-200об/хв і t°=28°C. Визначали накопичення біомаси. Засівали в колби із ферментаційним середовищем в різних співвідношеннях статеви х форм (+) і (-) - 1:1,5; 1:3; 1:5; 1:7 відповідно і культивували від 3 до 7 діб. Концентрація фітоїну залежала від співвідношення двох статевих форм та тривалості ферментації. Оптимальними виявились співвідношення 1:5 при 7-добовій ферментації. Вихід фітоїну складав від 1,5 до 2,2г/л культуральної рідини або концентрації 10-15%. Джерела інформації 1. Villadsen I. A method of generating high carotenoid-producing microorganisms, microorganisms obtained by the method and a process for producing carotenoid containing cells or cell parts or purified carotenoid. WO 92/22648, 1992. 2. Harris A., Zelkha M., Paran E. Carotenoids as anti-hypertension agents. WO 02/058683 A2. 2002. 3. Zelkha M., Nir Z., Sedlov T. Carotenoid compositium and method for protection skin. WO 03/041678 A1. 2002. 4. Zelkha M., Sedlov Т., Nir L., An antiatherosclerosis compositium containing carotenoids and method for inhibiting Ldl oxidation. WO 02/058682 A2. 2002 5. Sondant E., Schickler H. et al. A carotenoid preparation. WO 00/13654. 2000. 6. Britton G., Liaaen-Jensen S., Pfander H. Carotenoids. - Basel: Birkhaeser Verlag, 329p. 2004. 7 Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 85489 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601