Склад поживного середовища для продукування поверхнево-активних речовин нафтоокиснювальними мікроорганізмами

Реферат: Склад поживного середовища для продукування поверхнево-активних речовин нафтоокиснювальними мікроорганізмами складається із мінеральних і органічних речовин, причому як мінеральні компоненти використовують, (г/л дистильованої води): KН2РО4 - 1,5; Na2HPO4 - 3,0; NaCl - 5,0; NH4Cl - 1,0; а як органічний компонент - глюкозу в кількості 2,0 г/л. UA 102337 U (12) UA 102337 U UA 102337 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології, промислової біотехнології та призначена для продукування непатогенними мікроорганізмами з високою нафтоокиснювальною здатністю мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), що можуть бути використані для екологічно безпечного очищення навколишнього середовища від хронічних нафтових забруднень, як основа біодеградабельних мийних засобів та біоемульгаторів в фармацевтичній промисловості, в сільському господарстві, для створення нових екологічно чистих технологій в нафтодобувній промисловості тощо. Біологічні ПАР (біо-ПАР) є не менш ефективними, ніж синтетичні аналоги, оскільки мають не лише широкий спектр функціональної активності, а й мають ряд переваг, таких як нетоксичність, стабільність фізико-хімічних властивостей в широкому діапазоні температур, значень рН середовища і його солоності. Найголовнішою перевагою біо-ПАР є біодеградабельність, що і робить їх досить перспективними для створення екологічно безпечних технологій, пов'язаних з очищенням навколишнього середовища від нафтових забруднень. Способи ліквідації хронічних нафтових забруднень, що ґрунтуються на розкладанні нафтопродуктів мікроорганізмами, визнані одними з найбільш безпечних та ефективних. Бактеріальна деградація лімітується гідрофобною природою вуглеводнів, їх нерозчинністю у воді. Ефективне вирішення цієї проблеми можливе у разі продукування нафтоокиснювальними бактеріями біо-ПАР. Вони здатні диспергувати нафтопродукти або гідрофобізувати поверхні клітин, що підвищує ефективність контакту бактерій з вуглеводнями та водночас прискорює процес окиснення нафтопродуктів. Серед широкого спектра мікроорганізмів-продуцентів ПАР відомі представники роду Pseudomonas, а саме: P. aeruginosa, які на поживному середовищі за присутності субстратів росту - рідких або твердих парафінів утворюють біосурфактанти [Abdel-Mawgoud A.M. Characterization of rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa isolate BS20 / A.M. AbdelMawgoud, M.M. Aboulwafa, N.A.H. Hassouna // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2009. - Vol. 157. - P. 329-345.]. Рамноліпіди, що синтезують P. aeruginosa, належать до ефективних біосурфактантів, які використовують для видалення гідрофобних речовин із забруднених ґрунтів [Pattanathu K.S.M. Rahman Production, characterization and application of biosurfactant / Pattanathu K.S.M. Rahman, Edward Gakpe // Biotechnology. - 2008. - Vol. 7 (2). - P. 360-370.]. Хоча бактерії роду P. aeruginosa і продукують ПАР з низькими значеннями поверхневого натягу (30-32 мН/м), інтенсивною емульгувальною активністю, низькою величиною критичної концентрації міцелоутворення (5-65 мг/л) та високою афінністю стосовно гідрофобних органічних молекул [Biosurfactant Production by Pseudomonas sp. from Soil Using Whey as Carbon Source / [Praveesh B.V., Soniyamby A.R., Mariappan С. et al. // New York Science Journal. - 2011. - Vol. 4(4). - P. 99103.], але вони належать до патогенних мікроорганізмів (синегнійна паличка), а тому їх неможливо використовувати в процесах очищення навколишнього середовища від нафтових забруднень. Актуальною задачею екобіотехнології залишається пошук нафтоокиснювальних мікроорганізмів, які не є патогенними, і здатні продукувати у спеціально підібраному поживному середовищі біосурфактанти. В багатьох роботах розглянуто різні варіації з підбиранням компонентів для приготування оптимального поживного середовища або тільки з метою виділення біосурфактантів у чистому вигляді, або з метою приготування на його основі поверхнево-активного біопрепарату, складеного тільки із монокультури, що має нафтоокиснювальну дію відносно до певних нафтових вуглеводнів [Патент України на винахід № 71792А від 15.12.2004, Бюл. № 12, 2004; Obayori O.S. Degradation of hydrocarbons and biosurfactant production by Pseudomonas sp. strain LP1 / O.S. Obayori, M.О Ilori, S.A Adebusoye, G.O. Oyetibo., A.E. Omotayo, О.О. Amund // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 2009. - Vol. 25, Issue 9. - P. 1615-1623.]. Найбільш близьким аналогом до корисної моделі за одержаним результатом, що досягається, є Патент України на винахід № 10467А від 25.12.1996, бюл. № 4/1996 (прототип), у якому для отримання екологічно безпечних позаклітинних поверхнево-активних речовин використовують штам Pseudomonas sp PS-17, що культивують у поживному середовищі, (г/л дистильованої води): NaNO3 - 3,0; K2НРО4×3Н2О - 2,0; KН2РО4 - 1,5; MgSO4×7H2O - 0,5; Na3C6H5O7 - 5,0; FeSO4×H2O - 0,0005; СаСl2 - 0,05; джерело вуглецю - 20,0. Культивування здійснюють в умовах аерації (200 об./хв.) на поживному середовищі вище наведеного складу з рН середовища 6,8-7,2 за температури 28-30 °C. Як джерело вуглецевого харчування використовують: етанол, гліцерин, глюкозу, соняшникову олію, нафту. За час культивування (32 5 діб) значення поверхневого натягу бактеріальних суспензій зменшувалось з ~73 мДж/м (для 2 дистильованої води) до 30,0 мДж/м для культуральної рідини (отриманий продукт). Вихід позаклітинних рамноліпідних біо-ПАР склав 2,3-9,5 г/л, біополімеру (полісахарид альгінатної природи) - 4,0-6,0 г/л. 1 UA 102337 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Основним недоліком прототипу є: ускладненість технологічного процесу отримання бактеріальних суспензій з поліпшеними поверхнево-активними властивостями, тобто одержання біо-ПАР відбувається за умов аерації (культивують на круговій качалці протягом 3-5 діб). При введенні у водний розчин в значній кількості органічних речовин, наприклад, спиртів, поверхневий натяг самих розчинів, навіть за відсутністю мікроорганізмів, суттєво зменшується 2 (до 28-35 мДж/м ) - цю поправку не враховано. Задачею корисної моделі є підбір складу поживного середовища для продукування нафтоокиснювальними мікроорганізмами позаклітинних поверхнево-активних речовин за умови малої кількості мінеральних компонентів і витрат органічного компонента, що дозволить зменшити вплив поживного середовища за відсутністю мікроорганізмів (контроль) на виявлені поліпшені поверхнево-активні властивості бактеріальних суспензій з урахуванням поправки на контроль при спрощенні технології (без додаткової аерації) отримання біо-ПАР. Поставлена задача вирішується складом поживного середовища для продукування поверхнево-активних речовин нафтоокиснювальними мікроорганізмами, що складається із мінеральних і органічних речовин, який відрізняється тим, що як мінеральні компоненти використовують, (г/л дистильованої води): KН2РО4 - 1,5; Na2HPO4 - 3,0; NaCl - 5,0; NH4Cl - 1,0; а як органічний компонент: глюкозу в кількості 2,0 г/л. Культивування мікроорганізмів здійснюють в аеробних умовах у поживному середовищі № 1 (ПС-І), що містить, (г/л): KН2РО4 - 1,5; Na2HPO4 - 3; NaCl - 5; NH4Cl - 1; глюкоза - 2; пептон - 10; дріжджовий екстракт - 5; та у поживному середовищі № 2 (ПС-ІІ), що містить, (г/л): KН2РО4 - 1,5; Na2HPO4 - 3; NaCl - 5; NH4Cl - 1; глюкоза - 2; з рН 7,0-7,2 за температури 28-30 °C. Отже, як вуглецеве харчування використовують глюкозу, джерела азоту-амонійну сіль і пептон, джерела вуглецю і азоту - дріжджовий екстракт (поживне середовище № 1 з пептоном і дріжджовим екстрактом - ПС-І, із збагаченим вмістом азоту порівняно з вуглецем) або амонійну сіль (поживне середовище № 2 без пептону і дріжджового екстракту - ПС-ІІ, з малим вмістом азоту порівняно з вуглецем). Час культивування - 3-5 діб. Про здатність нафтоокиснювальних мікроорганізмів продукувати біосурфактанти судять по 2 опосередкованих ознаках - по зниженню поверхневого натягу (σ*, мДж/м ) рідких культур 2 бактерій відносно дистильованої води (σ(Н2О), мДж/м ) та поживного середовища за відсутністю 2 мікроорганізмів (σ(ПС-І) та σ(ПС-ІІ), мДж/м ) та по емульгувальній здатності біосурфактантів. З метою визначення типу біосурфактантів - позаклітинні або клітинно-зв'язані, бактеріальні клітини відділяють центрифугуванням (6500 об./хв. протягом 20 хв.) та вимірюють поверхневий натяг супернатантів. 2 Значення поверхневого натягу (σ, мДж/м ) вимірюють методом відриву пластинки з поверхні 2 рідини (метод Вільгельми) з точністю ± 0,5 мДж/м за температури 25 °C. Дослідження по здатності бактеріальних культур продукувати біо-ПАР у спеціально підібраному поживному середовищі проводили у Біотехнологічному науково-навчальному центрі Одеського національного університету імені І.І. Мечникова. Як об'єкти дослідження використовували непатогенні штами бактерій роду Pseudomonas, що попередньо були виділені та відібрані, і на сьогоднішній день зберігаються в колекції мікроорганізмів кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова: Р. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327. Штами P. fluorescens ONU328 та Р. maltophilia ONU329 виділені з морського середовища, а Р. cepacia ONU327 - з забрудненого нафтопродуктами ґрунту. Попередні лабораторні дослідження показали [Нафтоокиснювальна активність деяких штамів бактерій роду Pseudomonas / Гудзенко Т.В. та ін. // Мікробіологія і біотехнологія. - 2013. - № 4. - С. 72-80], що перелічені вище штами мають досить високу нафтоокиснювальну здатність відносно до сирої нафти, що значно посилюються при використанні консорціуму цих штамів P. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327, взятих у об'ємному співвідношенні 1:1:1. Результати по тензіометричному дослідженнюповерхнево-активних властивостей рідких культур бактерій (КБ) роду Pseudomonas та їх супернатантів (С) представлені в таблиці. 2 UA 102337 U Таблиця P. fluorescens P. maltophilia P. cepacia ONU327 Контроль (ПСONU328 ONU329 І) КБ С КБ С КБ С при рості бактерій на поживному середовищі М-9 з пептоном і дріжджовим екстрактом (ПС-І) * 2 σ , мДж/м 41,4 47,5 43,5 50,0 42,4 47,2 51,2 σ(ПС-І) - σ*, 9,8 3,7 7,7 1,2 8,8 4,0 0,0 2 мДж/м P. fluorescens P. maltophilia P. cepacia ONU327 Контроль (ПС ONU328 ONU329 Штам II) КБ С КБ С КБ С при рості бактерій на поживному середовищі М-9 за відсутністю пептону та дріжджового екстракту (ПС II) * 2 σ , мДж/м 46,8 49,8 47,9 48,9 54,9 58,7 67,9 * σ(ПС-II) - σ , 21,1 18,1 20,0 19,0 13,0 9,2 0,0 2 мДж/м 25 2 σ(Н2О) =72,0 мДж/м ; K(Н2О) = 0,2028 Штам 5 10 15 Як видно із даних таблиці, при дослідженні поверхневих властивостей бактеріальних культур і їх супернатантів необхідно враховувати поправку на поживне середовище за відсутністю мікроорганізмів - за наявності значної кількості органічних речовин поверхневий 2 2 натяг їх водних розчинів теж зменшується: σ(ПС-І) = 51,2 мДж/м ; σ(ПС-ІІ) = 67,9 мДж/м . Бактерії роду Pseudomonas продукують переважно позаклітинні біо-ПАР, про що свідчать наявні поліпшені поверхнево-активні властивості їх супернатантів, отриманих після відділення центрифугуванням бактеріальних клітин. Емульгувальні властивості супернатантів, оцінені за індексом емульгування (Е24, %) відносно до соняшникової олії, високі (~60 %). Використання спеціально підібраного поживного середовища ПС-ІІ для непатогенних бактерій роду Pseudomonas дозволяє зменшити кількість хімреагентів з восьми за прототипом до п'яти, спростити технологію отримання мікробних ПАР (виключається стадія додаткової аерації під час культивування, що за прототипом триває 5 діб). В пропонованій корисній моделі враховано порівняно з прототипом поправку на поживне середовище за відсутністю мікроорганізмів. Встановлена ефективність використання біо-ПАР, що продукують нафтоокиснювальні мікроорганізми (P. fluorescens ONU328, P. cepacia ONU327, P. maltophilia ONU329) для інтенсифікації біотехнологічного очищення (на 75-90 %) води і ґрунту від нафтопродуктів. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Склад поживного середовища для продукування поверхнево-активних речовин нафтоокиснювальними мікроорганізмами, що складається із мінеральних і органічних речовин, який відрізняється тим, що як мінеральні компоненти використовують (г/л дистильованої води): KН2РО4 - 1,5; Na2HPO4 - 3,0; NaCl - 5,0; NH4Cl - 1,0; а як органічний компонент - глюкозу в кількості 2,0 г/л. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3