Спосіб виготовлення поверхнево-активного біопрепарату

Реферат: Спосіб виготовлення поверхнево-активного біопрепарату полягає в культивуванні мікроорганізмів-деструкторів вуглеводнів нафти і нафтопродуктів з наступним введенням флокулянтів. Як мікроорганізми використовують штами антагоністів патогенних бактерій Pseudomonas fluorescens ONU328, Pseudomonas maltophilia ONU329, Pseudomonas cepacia ONU327, узятих у об'ємному співвідношенні 1:1:1. Як флокулянти застосовують хлорид кальцію -6 у кількості 0,046 моль/л та перекис водню в кількості 1 x 10 моль/л. UA 102370 U (12) UA 102370 U UA 102370 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології, зокрема до способів виготовлення поверхнево-активних біопрепаратів комплексної дії, і може бути використана у біотехнологіях екологічно безпечного очищення навколишнього середовища від хронічних нафтових забруднень; на підприємствах нафтовидобування, нафтопереробки, нафтозберігання, на залізничному транспорті, автозаправних станціях внаслідок аварійних та технологічних розливів нафти; як основа біодеградабельних миючих засобів та біоемульгаторів у фармацевтичній, парфумерній промисловості тощо. Мікробні поверхнево-активні речовини (ПАР), тобто біосурфактанти, є не менш ефективними, ніж синтетичні аналоги, мають широкий спектр функціональної активності, мають ряд переваг: нетоксичність, стабільність фізико-хімічних властивостей в широкому діапазоні значень рН середовища, температур. Але саме біодеградабельність біосурфактантів робить їх на сьогоднішній день досить перспективними для створення екологічно безпечних технологій, пов'язаних з очищенням навколишнього середовища від нафтових забруднень. Способи ліквідації хронічних нафтових забруднень, що ґрунтуються на розкладанні нафтопродуктів мікроорганізмами, визнані одними з найбільш безпечних та ефективних. Бактеріальна деградація лімітується гідрофобною природою вуглеводнів, їх нерозчинністю у воді. Ефективне вирішення цієї проблеми можливе у разі продукування нафтоокиснювальними бактеріями біосурфактантів. Вони здатні диспергувати нафтопродукти або гідрофобізувати поверхні клітин, що підвищує ефективність контакту бактерій з вуглеводнями та водночас прискорює процес окиснення нафтопродуктів. Серед широкого спектра мікроорганізмів-продуцентів ПАР відомі представники роду Pseudomonas-Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, які використовують для видалення гідрофобних речовин із ґрунтів. Відомий біопрепарат (Патент RU № 2125152) для витиснення нафти, який представляє собою культуральну рідину штаму Pseudomonas aeruginosa S-7. Біопрепарат не забезпечує достатнього емульгування нафти, що не дозволяє вважати його високоефективним. Крім цього, хоча бактерії роду P. aeruginosa і продукують ПАР з низькими значеннями поверхневого натягу (30-32 мН/м) та високою афінністю стосовно гідрофобних органічних молекул, однак вони належать до патогенних мікроорганізмів (синьогнійна паличка), тому їх неможна використовувати як основу поверхнево-активних біопрепаратів, призначених для екологічно безпечного очищення навколишнього середовища від нафтових забруднень. Найбільш близьким аналогом до корисної моделі за одержаним результатом, що досягається, є спосіб виготовлення поверхнево-активного біопрепарату, заснованого на одержанні продукту культивування в умовах аерації штаму PS-17 в поживному середовищі складу (г/л дистильованої води): NaNO3 - (2,0-4,0); К2НРО4×3Н2О - (1,5-2,5); КН2РО4 - (1,0-1,5); MgSO4×7H2O - (0,2-0,7); Nа3С6Н5О7 - (2,0-5,0); водорозчинний або водонерозчинний субстрат росту або суміш субстратів росту - (10-30) при рН середовища культивування, що дорівнює 6,87,2 і температурі 28-32° С Культивування здійснюють в умовах аерації (200 об/хв.) на поживному середовищі вище наведеного складу протягом 2-7 діб. Як джерело вуглецевого харчування використовують суміш рідких парафінів або глюкозу з етиловим спиртом. За час культивування (5-7 діб) значення поверхневого натягу бактеріальних суспензій у поживному 2 середовищі за присутності глюкози і етилового спирту зменшувалось з ~ 73 мДж/м (для дистильованої води) до 28,2 мДж/м для культуральної рідини (отриманий продукт). Вихід позаклітинних рамноліпідних ПАР склав 5-7 г/л при індексі емульгування 80-85 % (патент України на винахід № 71792А від 15.12.2004, Бюл. № 12, 2004). Основним недоліком найближчого аналога є: ускладненість технологічного процесу отримання бактеріальних суспензій з поліпшеними поверхнево-активними властивостями, тобто одержання біосурфактантів відбувається за умов аерації (культивують на круговій качалці протягом 2-7 діб). При введенні у водний розчин в значній кількості органічних речовин, наприклад спиртів, поверхневий натяг самих розчинів, навіть за відсутністю мікроорганізмів, 2 суттєво зменшується (до 28-35 мДж/м ) - цю поправку не враховано. Біопрепарат, складений із одного бактеріального штаму, не здатний розкладати широкий спектр нафтових вуглеводнів і процес деструкції є тривалішим. Актуальною задачею екобіотехнології залишається пошук нафтоокиснювальних мікроорганізмів, які не є патогенними, здатні продукувати у спеціально підібраному поживному середовищі біосурфактанти і можуть бути використані як основа високоефективних біопрепаратів у технології очищення морської води і ґрунту від нафтових вуглеводнів і смолисто-асфальтенових речовин. Задачею, на вирішення якої спрямована запропонована корисна модель, є розробка способу виготовлення поверхнево-активного біопрепарату на основі асоціації непатогенних 1 UA 102370 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 штамів мікроорганізмів-деструкторів нафти і антагоністів патогенних бактерій за спрощеною технологією (без додаткової стадії аерації) та з використанням мінімальної кількості джерел вуглецю та азоту. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб виготовлення поверхнево-активного біопрепарату, який полягає в культивуванні мікроорганізмів-деструкторів вуглеводнів нафти і нафтопродуктів з наступним введенням флокулянтів, згідно з корисною моделлю, як мікроорганізми використовують штами антагоністів патогенних бактерій Pseudomonas fluorescens ONU328, Pseudomonas maltophilia ONU329, Pseudomonas cepacia ONU327, узятих у об'ємному співвідношенні 1:1:1, а як флокулянти застосовують хлорид кальцію у кількості 0,046 -6 моль/л та перекис водню в кількості 1×10 моль/л. Пропонований спосіб виготовлення поверхнево-активного біопрепарату на основі асоціації непатогенних нафтоокиснювальних мікроорганізмів здійснюють наступним чином. Виготовляють поживне середовище складу, що містить (г/л дистильованої води): КН 2РО41,5; Na2HPO4-3; NaCl-5; NH4CI-1; глюкоза - 2, з рН 7,0-7,2 за температури 28-30 °C. Культивують у поживному середовищі окремо штами бактерій роду Pseudomonas: P. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327. Культивування проводять без додаткової аерації протягом 3-5 діб. За даний час внаслідок утворення біосурфактантів значно поліпшуються поверхневі властивості бактеріальних суспензій, складених із окремих штамів бактерій. Про здатність мікроорганізмів продукувати біосурфактанти судять по зниженню 2 поверхневого натягу рідких бактеріальних культур [σ(БК), мДж/м ] відносно дистильованої води 2 2 [σ (Н2О), мДж/м ] і поживного середовища за відсутністю мікроорганізмів [σ (ПС), мДж/м ] та по емульгувальній здатності біосурфактантів. З метою визначення типу біосурфактантів позаклітинні або клітинно-зв'язані, бактеріальні клітини відділяють центрифугуванням (6500 об/хв. протягом 20 хв) та вимірюють поверхневий натяг супернатантів. Значення поверхневого натягу (σ, мДж/м) вимірюють методом відриву пластинки з поверхні 2 рідини (метод Вільгельмі) з точністю ±0,5 мДж/м за температури 25 °C. Поверхнево-активний біопрепарат готують змішуванням бактеріальних суспензій із штамів P. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327, взятих у об'ємному співвідношенні 1:1:1, після чого вводять для утворення біофлоків перекис водню і хлорид -6 кальцію в кількості 1 × 10 моль/л і 0,046 моль/л відповідно. Під дією перекису водню і хлориду кальцію суттєво пришвидшується процес утворення в однорідній суспензії біофлоків (за відсутністю хімреагентів агрегація бактерій протікає значно повільніше і відбувається під дією полісахаридних комплексів клітинної стінки). При цьому різко збільшується загальна адсорбційна ємність препарату. При вмісті у біопрепараті біофлоків асоціації штамів у перерахунку на бактеріальні клітини 6 менше 10 в 1 г препарату його сорбційна та деструктивна активність відносно вуглеводнів нафти різко знижується, вміст біофлоків асоціації штамів у перерахунку на бактеріальні клітини 9 більше 10 в 1 г препарату не доцільний, тому що активність препарату істотно не збільшується. 7 8 Оптимальним є вміст біофлоків асоціації штамів у перерахунку на бактеріальні клітини 10 -10 в 1 г препарату, що забезпечує максимальні сорбційні та нафтодеструктивні його властивості. Дослідження по розробці способу виготовлення поверхнево-активного біопрепарату на основі непатогенних штамів мікроорганізмів-деструкторів нафти і нафтопродуктів з використанням мінімальної кількості джерел їх харчування проводили у Біотехнологічному науково-навчальному центрі Одеського національного університету імені І.І. Мечникова. Як об'єкти дослідження використовували непатогенні штами бактерій роду Pseudomonas, що попередньо були виділені та відібрані, і на сьогоднішній день зберігаються в колекції мікроорганізмів кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова: P. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327. Штами P. fluorescens ONU328 та Р. maltophilia ONU329 виділені з морського середовища, а Р. cepacia ONU327 - з забрудненого нафтопродуктами ґрунту. Попередні лабораторні дослідження показали [Нафтоокиснювальна активність деяких штамів бактерій роду Pseudomonas І Гудзенко Т.В. та ін. // Мікробіологія і біотехнологія. - 2013. - № 4. - С. 72-80], що перелічені вище штами мають досить високу нафтоокиснювальну здатність по відношенню до сирої нафти. Результати по тензометричному дослідженню поверхнево-активних властивостей рідких бактеріальних культур (БК) та їх супернатантів (С) представлені в таблиці. 2 UA 102370 U Таблиця Штам Р. fluorescens Поверхневий натяг ONU328 БК С σ (БК), мДж/м 46,8 49,8 σ (ПС) - σ (БК), 21,1 18,1 2 мДж/м σ (Н2О) - σ (БК), 25,2 22,2 мДж/м К(Н2О)-0,2028 5 10 15 20 25 30 P. maltophilia ONU329 БК С 47,9 48,9 P. cepacia ONU327 БК С 54,9 58,7 Асоціація 1:1:1 Контроль (ПС) БК С 42,2 47,1 67,9 20,0 19,0 13,0 9,2 27,7 20,8 0,0 24,1 23,1 17,1 13,3 29,8 24,9 4,1 Як видно із даних таблиці, бактерії роду Pseudomonas продукують переважно позаклітинні біосурфактанти. Супернатанти, відділені від бактеріальних клітин центрифугуванням, мають поверхнево-активні властивості. При дослідженні поверхневих властивостей бактеріальних культур і їх супернатантів враховували поправку на поживне середовище за відсутністю мікроорганізмів. Додатково встановлено, що за наявності значної кількості органічних речовин (наприклад, пептону і дріжджового екстракту в кількості 10 і 5 г/л відповідно) поверхневий натяг 2 їх водних розчинів значно зменшується (до 51,2 мДж/м ). Експериментально підтверджено: при використанні асоціації, складеної із суспензій бактеріальних культур P. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327, взятих у об'ємному співвідношенні 1:1:1, їх поверхневі властивості у спеціально підібраному поживному середовищі поліпшуються порівняно з поверхневими властивостями суспензій, складених із окремих штамів мікроорганізмів. Емульгувальні властивості супернатантів, оцінені за індексом емульгування (Е24, %) по відношенню до соняшникової олії, високі (~ 75 %). Встановлена ефективність використання поверхнево-активного біопрепарату на основі синергетично діючої асоціації непатогенних штамів Р. fluorescens, P. cepacia, P. maltophilia (1:1:1 по об'єму) для інтенсифікації біотехнологічного очищення морської води та ґрунту від широкого спектра нафтопродуктів. При цьому ступінь очищення склав близько 90 % при вихідній концентрації нафтопродуктів 15-42 г/кг ґрунту. Використання спеціально підібраного поживного середовища для непатогенних бактерій роду Pseudomonas дозволяє спростити технологію отримання поверхнево-активного біопрепарату та зменшити матеріальні витрати на його приготування. Крім цього в пропонованій корисній моделі при оцінці поверхневих властивостей біопрепарату враховано порівняно з прототипом поправку на поживне середовище за відсутністю мікроорганізмів та збільшено кількість штамів біохімічно-активних мікроорганізмів, що супроводжується прискоренням процесу деструкції широкого спектра нафтових вуглеводнів і смолисто-асфальтенових речовин. Цінністю запропонованого способу виготовлення поверхнево-активного біопрепарату поліфункціональної дії є те, що у ньому використані саме ті мікроорганізми (P. fluorescens, P. cepacia, P. maltophilia), які здатні цілком розкладати нафту та нафтопродукти, вони не є патогенними, не мають антагоністичних властивостей один щодо одного і є антагоністами патогенних бактерій, що забруднюють навколишнє середовище. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб виготовлення поверхнево-активного біопрепарату, який полягає в культивуванні мікроорганізмів-деструкторів вуглеводнів нафти і нафтопродуктів з наступним введенням флокулянтів, який відрізняється тим, що як мікроорганізми використовують штами антагоністів патогенних бактерій Pseudomonas fluorescens ONU328, Pseudomonas maltophilia ONU329, Pseudomonas cepacia ONU327, узятих у об'ємному співвідношенні 1:1:1, а як флокулянти застосовують хлорид кальцію у кількості 0,046 моль/л та перекис водню в кількості -6 1 x 10 моль/л. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3