Спосіб визначення b-агоністів у сечі та печінці за допомогою рідинного хромато-мас-спектрометра з іонною пасткою

Реферат: Спосіб визначення залишкових кількостей -агоністів у печінці та сечі полягає у дослідженні 5 г 3 (5 см ) підготовленого зразка, який екстрагують за допомогою фосфатного буфера з наступним ферментативним гідролізом з використанням -глюкоронідази, очищення екстракту за допомогою твердофазних колонок, з подальшим випаровуванням в потоці азоту, перерозчиненням та дослідженням на рідинному хромато-мас-спектрометрі з іонною пасткою. UA 105434 U (12) UA 105434 U UA 105434 U 5 10 15 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема до біохімії та токсикології, і може бути використана в роботі науково-виробничих лабораторій. Методика не має зареєстрованих аналогів в Україні. В основу корисної моделі поставлена задача розробки універсального та швидкого способу виявлення залишкових кількостей -агоністів, таких як кленбутерол, сальбутамол, циматерол, рактопамін у печінці та сечі, які є забороненими речовинами для використання в галузі ветеринарної медицини України. Процедурний підхід до ідентифікації -агоністів удосконаленим нами способом включає 3 наступні елементи: для аналізу беруть 5,0±0,1 г (5,0 см ) підготовленого, гомогенізованого 3 зразка в центрифугальну пробірку, додають 20 см фосфатного буфера та екстрагують 1 хв. при 3 100 об./хв. на роторному змішувачі, додають 120 мм концентрованої соляної кислоти, ретельно змішують з подальшим доведенням рН до 3. Ферментативний гідроліз зразка відбувається в 3 термошафі при 37 °C протягом 12 годин з додаванням 50мм -глюкоронідази, подальше очищення зразка проводять з використанням твердофазних колонок Cleen screen DAU, випарюють очищений екстракт під потоком азоту при 50 °C до сухого залишку, який перерозчинюють у рухомій фазі та переносять у віалку для аналізу [4]. Конфігурація рідинного хроматографа з іонною пасткою "VARІAN"-500 із рідинним блоком Pro Star: градієнтний насос, автосамплер, термостат колонок, іонна пастка, готують згідно з інструкцією з експлуатації приладу та задають робочі параметри. Конфігурація та режим роботи: Колонка Температура термостата колонки Температура зразка Витрата елюенту (Швидкість потоку) Об'єм інжекції Режим введення проби Тривалість хроматографування Градієнт (Рухома фаза) Varian, Microsorb C18, S2,0×50 mm 40 °C 5 °C 3 0,20 см /хв. 3 20 мм автоматичний 9 хв. А: 100 % ацетонітрил В: 10 % ацетонітрил в 5 mМ розчині ацетату амонію (рН 4,0) 20 Таблиця 1 Співвідношення градієнтів: Час 0 3 4 6 7 9 Мобільна фаза А, % 20 20 55 55 20 20 1 Мобільна фаза В, % 80 80 45 45 80 80 UA 105434 U Таблиця 2 Параметри введення даних для проведення досліджень на рідинному хроматомас-спектрометрі з іонною пасткою Компонент Материнський іон Кленбутерол 240 Циматерол 220 Рактопамін 302 Кленбутерол d-9 286 Сальбутамол d-9 249,9 Рактопамін d-5 5 Енергія зіткнення 22 42 25 43 41 40 35 40 20 15 10 15 259 203 222 148 202 160 164 284 204,1 228 231,2 167 277 Сальбутамол Напруження на конусі 40 Дочірні іони 307 40 42 Час виходу -агоністів залежить від швидкості потоку, витрати елюенту, типу аналітичної колонки. Умови виконання вимірювань підлягають перевірці і при потребі корегуванню: - при переході на інший хроматограф; - при заміні колонок; - після ремонту вузлів хроматографа, що впливають на чутливість детектора. Хроматограф градуюють по градуювальних розчинах -агоністів. 10 Таблиця 3 Валідаційні дані Назва аналіту Кленбутерол Сальбутамол Циматерол Рактопамін 15 20 ССа 0,12 0,71 0,76 0,25 Рекомендоване значення 0,2 1 1 1 Отриманні валідаційні дані, наведені в таблиці 3, та результати участі у міжлабораторних порівняльних дослідженнях (программа Fapas), наведені в таблиці 4, свідчать про те, що методика розроблена в ДНДІЛДВСЕ придатна для всіх видів продукції, даний спосіб є досить чутливим, щоб детектувати дані речовини. Так, як у відношенні сполук, для яких не встановлено максимально-допустимий рівень (МДР) і які є заборонені, показник ССа менше рекомендованого значення. Наша методика дозволяє за досить короткий проміжок часу дослідити зразок одночасно на багато показників, що значно економить час, реактиви і, в свою чергу, знижує собівартість дослідження. Таблиця 4 Участь у міжлабораторних порівняльних дослідженнях (программа Fapas) програми 02213 Найменування досліджень -agonists in pig liver Приписне значення, мкг/кг 0,989 1,06 Показник кленбутерол рактопамін 2 Результат, мкг/кг Z-індекс 0,635 1,26 -1,6 0,9 UA 105434 U Результати, отримані нами під час дослідження референс-матеріалу, є вірогідними і знаходяться в межах приписного значення. Отже, відпрацьована нами методика виявлення агоністів не поступається методикам, які використовуються в лабораторіях Європейської спільноти. 5 10 15 Джерела інформації: 1. Commission Decision (2002/657/EC) of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and interpretation of results, O.J. Europ. Comm. L 221, 8-36. 2. Simultaneus Determination of Salbutamol, Ractopamine, and Clenbuterol in animal feeds by SPE and LC-MS". L.Y. Zhang, B.Y. Chang, T. Dong et c. / Stte Key Laboratory on Animal Nutrition, Cyina Agricultural University, Beijing P.R. China. /Journal of Chromatographic Science, Vol. 47, April 2009, p. 324-328. 3. B-agonists extraction procedures for chromatographic analysis. F. Jorge and D. Ramos. / J. Chromatogr. A 880:09-83 (2000). 4. Новожицька Ю.М. Визначення -агоністів у сечі та печінці за допомогою рідинного хроматомас-спектрометра з іонною пасткою /Методичні рекомендації. - Київ. - 2014. - С. 25. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб визначення залишкових кількостей -агоністів у печінці та сечі, що полягає у дослідженні 3 5 г (5 см ) підготовленого зразка, який екстрагують за допомогою фосфатного буфера з наступним ферментативним гідролізом з використанням -глюкоронідази, очищення екстракту за допомогою твердофазних колонок, з подальшим випаровуванням в потоці азоту, перерозчиненням та дослідженням на рідинному хромато-мас-спектрометрі з іонною пасткою. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3