Спосіб визначення активності лужної фосфатази в молоці та молочних продуктах флуориметричним методом

Реферат: Спосіб визначення активності лужної фосфатази у молоці та молочній продукції, полягає у 3 тому, що для дослідження беруть 0,075 см рідкого та 0,5 г твердого підготовленого зразку, додають буферний розчин для екстракції, з подальшим відбиранням в кювету та вимірюють при температурі 38 °С шляхом безперервного флуориметричного прямого кінетичного аналізу. UA 105435 U (12) UA 105435 U UA 105435 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема до біохімії, і може бути використана в роботі науково-виробничих лабораторій. Спосіб не має зареєстрованих аналогів в Україні. Задачею корисної моделі є розробка універсального та швидкого способу визначення активності лужної фосфатази та оцінювання його придатності у молочних продуктах, суттєве скорочення часу на пробо підготовку, зменшення витрат реактивів, посуду, точне кількісне оцінювання, визначення походження (сторонні речовини або термостійкої мікробної лужної фосфатази). Процедурний підхід до визначення активності лужної фосфатази та встановлення її походження: 1. Приготування робочого субстрату шляхом змішування субстрату з буферним розчином субстрату. Субстрат у флаконах, кожний з яких вміщує 144 мг порошкового субстрату з молекулярною масою 580 г/моль. Цей субстрат представляє собою не флуоресцентний ароматичний моно фосфатний ефір 21[2-бензотіазоліл]-61-гідроксибензотіазолфосфату. Буферний розчин субстрату: буферний розчин діетаноламіну (DEA), c(DEA) = 2,4 моль/л, рН = 10,0 в пробірках ємністю 240 мл кожна. 2. Підготовка зразків до дослідження. 2.1. Молоко та молочні продукти Розмішуємо до однорідного стану за допомогою механічного блендера перед тестуванням. 2.2. Маслянка, сметана і сирна маса Розмішуємо до однорідного стану за допомогою механічного блендера перед тестуванням. 2.3. Концентровані та сухі молочні продукти Відновлюємо продукт дистильованою водою та ретельно перемішуємо. В промарковану скляну пробірку розміром (12×75 мм) з попередньо внесеними 2 мл робочого буферного субстрату додаємо 0,075 мл зразку пастеризованого молочного продукту з послідуючим багатократним кінетичним зчитуванням швидкості реакції. 2.4. Масло В промарковану скляну пробірку розміром (12×75 мм) з попередньо внесеним 0,5 мл буферу для екстракції додаємо 0,5 г зразку масла. Підігріваємо протягом 10 хвилин на водяній бані при 38 °C для того, щоб масло розчинилось в буфері. Виконуємо тестування, як для рідких молочних продуктів, за виключенням помноження результатів мО/л на 10 для поправки на десятикратне. 2.5. Сир В промарковану скляну пробірку розміром (12×75 мм) з попередньо внесеним 0,5 мл буферу для екстракції додаємо 0,5 г зразку сиру та подрібнюємо скляною паличкою. Витримуємо у центрифузі протягом 10 хвилин при 1000 0б/хв. Відбираємо верхній шар та виконуємо тестування як для рідких молочних продуктів, за виключенням помноження результатів мО/л на 10 для поправки на десятикратне. 3. Конфігурація флуорометра "Fluorophos" та допоміжне обладнання 3.1. Флуорометр з фільтрацією і термостатично регульованим тримачем кювети, що забезпечує підтримку робочої температури 38 °C ± 1 °C, та прямокутною оптичною системою, що допускає збудження при довжині хвилі 440 нм та випускання при довжині хвилі у границях 520-560 нм. 3.2. Кювети одноразові, що виконані з нефлуоресціюючого скла. 3.3 Дозатор фіксуючого об'єму, що дозує по 2,0 мл, 0,075 мл. 3.4. Піпетки на 2 та 3 мл. 3.5. Інкубаторний блок, що підтримує температуру 38 °C ± 1 °C, призначений для розміщення в ньому кювет 3.6. Плівка парафільм. 3.7. Водяна баня, підтримуюча температуру 63 °C ± 1 °C та 95 °C ± 1 °C. 3.8. Лабораторний посуд. 4. Перевірка робочих характеристик приладу з використанням калібрувальних розчинів для калібрування каналів 4.1 Калібрувальні розчини Fluoroyellow® (FY), 21[2-бензотіазоліл]-61-гідроксибензотіазол в буферному розчині субстрату. 4.2. Калібрувальний розчин А, що містить 0 мкмоль/л Fluoroyellow®. 4.3. Калібрувальний розчин В, що містить 17,24*103 мкмоль/л Fluoroyellow®. 4.4. Калібрувальний розчин С, що містить 34,48*103 мкмоль/л Fluoroyellow®. 1 UA 105435 U 5 10 15 20 4.5. Розчин для щоденного контролю прибору Fluorophos® ALP Daily Instrument Control Kit (FLA280), що містить 34,48-34,48*103 мкмоль/л Fluoroyellow®. Тести на якість контролю включають в себе: а) щоденний тест A/D test (аналого-цифрового перетворення), що виконується для перевірки вірності функціонування обладнання. б) щоденний контрольний тест приладу з використання щоденного контрольного розчину в приладі для моніторингу будь-якого відхилення в електронній або оптичній частині флуорометру. в) використання зовнішніх позитивних, негативних та нормативних засобів контролю. Прилад автоматично вираховує значення флуоресценції, отримане з калібрувальними розчинами В та С в порівнянні з калібрувальним розчином А, щоб встановити калібрувальний коефіцієнт приладу. Після того, як калібрування буде завершене, можна розпочинати аналіз тестових зразків. Включає в себе вимірювання тест негативного контролю, тест позитивного контролю, тест на наявність сторонніх домішок, контрольний тест на присутність теплостійкої мікробної лужної фосфатази. Умови виконання вимірювань підлягають перевірці і, при потребі, корегуванню: при переході на інший канал та вид продукту при заміні реагентів після ремонту приладу З метою удосконалення способу виявлення активності лужної фосфатази в молочних продуктах даним методом було проведено ряд досліджень та оцінено даний метод у відповідності до вимог Європейського Союзу. Таблиця 1 Порівняльна таблиця дослідження позитивного зразка пастеризованого молока якісним та флуориметричним методом № п/п Назва показника 1 Активність лужної фосфатази Метод дослідження кількісний за допомогою якісний приладу Fluorophos Межа чутливості флуориметричного методу, мО/л не виявлено 10 мО/л 537 мО/л Допустимий рівень, мО/л 350 мО/л Таблиця 2 Оцінка придатності методу № п/п 1 25 30 Назва показника Активність лужної фосфатази Межа кількісного виявлення, мО/л Внутрішньолабораторна відтворюваність (Sr), % Збіжність (Sr), % Розширена невизначеність (U), % 10 мО/л 8,42 7,53 15,06 Дані, наведені в таблиці 1 та 2 свідчать про те, що методика розроблена в ДНДІЛДВСЕ придатна для всіх видів молочних продуктів, даний спосіб є досить чутливим, щоб виявляти активність лужної фосфатази. Так, як у відношенні активності лужної фосфатази встановлено максимально-допустимий рівень (МДР) 350 мО/л, показник межі кількісного визначення повинен бути менше МДР. Наша методика дозволяє за досить короткий проміжок часу дослідити зразок, що значно економить час, реактиви, визначити кількісно активність лужної фосфатази та її походження. Під час дослідження референс-матеріалу, див. таблицю 3, зразки даного матеріалу були підготовлені відповідно до інструкції, наданої з референс-матеріалом. 2 UA 105435 U Таблиця 3 Участь у міжлабораторних порівняльних дослідженнях (програма ВЕТ-ТЕСТ) № програми Найменування досліджень 01/2015 (15.04.2015) 02/2015 (25.04.2015) 5 10 15 20 Активність лужної фосфатази в сирі Активність лужної фосфатази в молоці Показник Приписане значення, мО/л Результат, мО/л Z-індекс 497,6 496,0 -0,5 20,0 19,4 -1,3 Активність лужної фосфатази Активність лужної фосфатази Результати отримані нами під час дослідження референс-матеріалу, є вірогідними і знаходяться в межах приписаного значення. Отже, відпрацьована нами методика виявлення активності лужної фосфатази не поступається методикам, які використовуються в лабораторіях Європейської спільноти. Наша методика дозволяє за досить короткий проміжок часу дослідити зразок, що значно економить час, реактиви, дає можливість визначити кількісно активність лужної фосфатази та її походження. Джерела інформації: 1. Commission Decision (2002/657/EC) of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and interpretation of results, OJ. Europ. Comm. L 221, 8-36. 2. ДСТУ 4834:2007 Молоко та молочні продукти. Правила приймання, відбору та підготовки проб до контролю. 3. Настанова з оцінювання невизначеності вимірювання результатів кількісних випробувань. Технічний звіт EUROLAB № 1/2006// Пер. з англ. К.: Евролаб-Україна, 2008. 4. COMMISSION REGULATION (EC) № 2074/2005 °F 5 December 2005 laying down implementing measures for certain products under Regulation (EC) № 853/2004 °F the European Parliament and of the Council and for the organisation of official controls under Regulation (EC) № 854/2004 °F the European Parliament and of the Council and Regulation (EC) № 882/2004 °F the European Parliament and of the Council, derogating from Regulation (EC) № 852/2004 °F the European Parliament and of the Council and amending Regulations (EC) № 853/2004 and (EC) № 854/2004. 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб визначення активності лужної фосфатази у молоці та молочній продукції полягає у тому, 3 що для дослідження беруть 0,075 см рідкого та 0,5 г твердого підготовленого зразку, додають буферний розчин для екстракції, з подальшим відбиранням в кювету та вимірюють при температурі 38 °С шляхом безперервного флуориметричного прямого кінетичного аналізу. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3