Спосіб лікування нетримання сечі за допомогою (s)-оксибутиніну і (s)-дезетилоксибутиніну та фармацевтична форма (варіанти)

1 Спосіб лікування нетримання сечі з відвертанням супутньої схильності до негативних ефектів, що включає введення ссавцю, що потребує такого лікування, від приблизно 100 мг/день до приблизно 1 г/день сполуки, вибраної з групи, до якої входять (З)-оксибутинш, (S)дезетилоксибутинш або фармацевтично прийнятна сіль будь-якого з них, по суті вільної від и (R) енантюмера 2 Спосіб за п 1, де КІЛЬКІСТЬ (З)-оксибутиншу, (S) дезетилоксибутиншу або фармацевтично прийнятної солі будь-якого з них, що вводиться, становить від приблизно 240 мг/день до приблизно 750 мг/день 3 Спосіб за п 2, де КІЛЬКІСТЬ (З)-оксибутиншу, (S) дезетилоксибутиншу або фармацевтично прийнятної солі будь-якого з них, що вводиться, становить від приблизно 300 мг/день до приблизно 600 мг/день 4 Спосіб за п 1, де (З)-оксибутинш, (S)дезетилоксибутинш або фармацевтично прийнятна сіль будь-якого з них вводиться парентерально, Цей винахід відноситься до способу і лікарських форм для лікування нетримання сечі за допомогою оптично чистих (З)-оксибутинша (S-OXY) і (З)-деетилоксибутинша (S-DEO) Передумови створення винаходу Рацемічний оксибутинш (OXY) знаходить терапевтичне застосування при лікуванні гіперкінези кишечнику і при лікуванні нетримання сечі внаслі (З)-ОКСИБУТИНІНУ І (S) черезшкірно, ректально, перорально або шляхом вдихання 5 Спосіб за п 4, де (З)-оксибутинш, (S)дезетилоксибутинш або фармацевтично прийнятна сіль будь-якого з них вводиться перорально або черезшкірно 6 Фармацевтична стандартна дозована лікарська форма у формі таблетки або м'якої еластичної желатинової капсули, яка містить фармацевтично прийнятний носій і від 0,1 мг до 500 мг сполуки, вибраної з групи, до якої входять (З)-оксибутинш, (З)-дезетилоксибутинш або фармацевтично прийнятна сіль будь-якого з них, по суті вільної від її (R) енантюмера 7 Фармацевтична стандартна дозована лікарська форма за п 6, де вміст (З)-оксибутиншу, (S)дезетилоксибутиншу або фармацевтично прийнятної солі будь-якого з них становить від приблизно 25 мг до приблизно 250 мг 8 Фармацевтична стандартна дозована лікарська форма за п 7, де вміст (З)-оксибутиншу, (S)дезетилоксибутиншу або фармацевтично прийнятної солі будь-якого з них становить від приблизно 100 мг до приблизно 200 мг 9 Фармацевтична дозована лікарська форма у формі засобу для черезшкірної доставки, який включає в себе фармацевтично прийнятний носій і від приблизно 100 мг до 500 мг сполуки, вибраної з групи, до якої входять (З)-оксибутинш, (S)дезетилоксибутинш або фармацевтично прийнятна сіль будь-якого з них, по суті вільної від и (R) енантюмера 10 Фармацевтична дозована лікарська форма за п 9, яка відрізняється тим, що зазначений фармацевтично прийнятний носій включає в себе підсилювач проникнення док нестійкого функціонування м'язу, що виштовхує сечу Рацемічний оксибутитн виявляє безпосередній спазмолітичний вплив на гладкі м'язи і пригнічує вплив, що виявляє на згадані м'язи ацетилхоліном У випадку впливу на м'язи, по виштовхують сечу у кроликів, рацемічний оксибутинш демонструє всього лише п'яту частину активності атропіну, однак за анти спазматичною активністю О (О (О 61916 він переважає останній в чотири-десять раз Рацемічний оксибутинш відрізняється надзвичайним розпізнаванням стосовно до мускаринових рецепторів в присутності нікотинових рецепторів і, як наслідок цього, в скелетних нервово-м'язових синапсах або вегетативних гангліях повністю будуть відсутні ефекти блокування Рацемічний оксибутинш розслаблює гладку мускулатуру сечового міхура, і у пацієнтів з захворюваннями, що характеризуються мимовільними скороченнями сечового міхура, цистометричні дослідження показали, що рацемічний оксибутинш збільшує МІСТКІСТЬ сечового міхура, зменшує частоту мимовільних скорочень м'язу, що виштовхує сечу, і затримує первісний позив до сечовипускання Завдяки цьому рацемічний оксибутинш виявляється придатним для лікування і профілактики як нетримання сечі, так і частого довільного сечовипускання Ефективність впливу рацемічного оксибутинша на міхур пояснюється поєднанням антимускаринового, безпосереднього спазмолітичного і місцевого анестезуючого впливу на гладкий м'яз, що виштовхує сечу Внаслідок антимускаринової активності рацемічного лікарського засобу надто розповсюдженими побічними явищами, що втягують мускаринові холшерпчні рецептори, є ксеростомія (сухість в роті) і мідріаз (розширення зіниць) Фактично як мінімум один дослідник згадує "неминучі симптоми - мідріаз, ксеростомію, тахікардію тощо, якими супроводжується введення рацемічного оксибутинша [Ліш (Lish) і ІНШІ, Arch Int Pharmacodvn 156 467-488 (1965), 48] Висока частота антихолшерпчних побічних ефектів (від 40 до 80%) часто викликає зниження дозування або переривання курсу лікування Результати фармакологічних досліджень окремих енантюмерів дозволяють зробити припущення, що ефективним є R-енантюмер НоронаБлоб (Noronha-Blob) і ІНШІ [J PharmacoL Exp Ther 256 562-567 (1991)] прийшли до висновку, що холшерпчний антагонізм рацемічного оксибутинша (що визначається in vitro за його спорідненістю до ПІДТИПІВ рецепторів М1, М2 і МЗ in vivo за різноманітними фізіологічними реакціями) може пояснюватися, головним чином, активністю (R)енантюмера За всіма реакціями, виявленими вказаними дослідниками, ранжована активність рацемічного оксибутинша і його енантюмерів виявилася однаковою, а саме, активність (R)оксибутинша виявилася більшою або рівною активності рацемічного оксибутинша і набагато більшою у порівнянні з активністю (З)-оксибутинша, причому активність (З)-оксибутинша виявилася на 1-2 порядка менше активності (Р)-оксибутинша Стисле викладення суті винаходу Несподівано виявили, що, по суті, оптичне чистий (З)-енантюмер оксибутинша і його деетиловий метаболіт являють собою чудовий лікарський засіб для лікування нетримання сечі Оптично чисті (З)-оксибутинш (S-OXY) і (S)дестилоксибутинш (S-DEO) забезпечують можливість подібного лікування з одночасним істотним зниженню м частоти негативних явищ, що є слідством, головним чином, антихолшерпчної активності, і пов'язані з введенням рацемічного оксибутині на До їхнього числа відносяться, однак ними не обмежуються, ксеростомія, мідріаз, СОНЛИВІСІЬ, нудота, запори, учащене серцебиття і тахікардія Полегшення негативного впливу рацемічного оксибутинша на серцево-судинну систему, наприклад, тахікардії і учащеного серцебиття, шляхом введення (З)-оксибутинІна або S-DEO, являє собою особливу терапевтичну, ЦІННІСТЬ Активними сполуками цих композицій і засобів є оптичні ізомери оксибутинша і деетилоксибутиніна Спосіб отримання рацемічного оксибутинша описаний в описі винаходу до патенту Великобританії №940540 3 хімічної сторони, активними сполуками є (1) S енантюмер 4-(діетиламшо)-2бутиніл а-циююгексил-а-пдроксибензолацетат, відомий також як 4-(діетиламіно)-2бутинілфенілциклогексилгліко, пойменований далі оксибутиншом, і (2) S енантюмер 4-(етиламшо)-2бутиніл а-циклогексил-а-пдроксибензолацетат, пойменований далі деетилоксибутиншом Радою по ХІМІЧНІЙ номенклатурі США хлористоводневій солі рацемічного оксибутинша присвоєна родова назва хлорид оксибутинша, він продається під торговою назвою Ditropan® Згаданий ізомер оксибутинша, що має S абсолютну стереохімію (Реєстр №119618-22-3), с правообертаючим і представлений Формулою І, (І) S-енантюмер деетилоксибутинша лений Формулою II, представ (II) Синтез (З)-оксибутинша описаний [Качур (Kachur) і ІНШІ, J Pharmacol Exp Ther 247 867872 (1988)], однак сам (З)-оксибутинш в теперішній час комерційне недосяжний Всі КЛІНІЧНІ результати, про які повідомлялося, були отримані за допомогою рацемічної суміші, хоча фармакологія окремих енантюмерів була описана на морських свинках і щурах [дивись, Качур і ІНШІ, J Pharmacol Exp Ther 247 867-872 (1988) і Норона-Блоб і ін , J Pharmacol Exp Ther 256, 562-567 (1991)] Синтез і фармакологія (З)-деетилоксибутинша були описані авторами цього винаходу в міжнародній заявці WO 96/23492 Згідно одному з своїх аспектів, цей винахід відноситься до способу лікування нетримання сечі з відвертанням супутньої схильності до негативних явищ, що включає введення людині, потребуючій подібного лікування, терапевтичне ефективної КІЛЬКОСТІ (З)-оксибутинша, (З)-деетилоксибутинша або фармацевтичне прийнятної солі будь-якого з них, по суті, вільних від ВІДПОВІДНОГО Rенантюмера Згідно іншому аспекту, цей винахід надає фармацевтичні композиції, до складу яких входить 61916 (З)-оксибутинш, (З)-деетилоксибутинш або фармацевтично прийнятна сіль будь-якого з них, по суті, ВІЛЬНІ від (Р)-енантіомера, і фармацевтичне прийнятний носій Терміни "по суті, вільних від Rенантюмера" і "по суті, вільних від ВІДПОВІДНОГО Rенантюмера", що використовуються в цьому описі, означають, що до складу згаданих композицій входить, як мінімум, 90% (мас) (З)-оксибутинша або (З)-деетилоксибутинша і 10% (мас) або менше (Р)-оксибутинша або (Р)-деетилоксибутинша, ВІДПОВІДНО У більш прийнятному варіанті здійснення цього винаходу, до складу згаданих композицій входить, як мінімум, 99% (мас) S енантюмера і 1% або менше R енантюмера По суті, оптичне чистий (З)-оксибутинш або (З)-деетилоксибутинш можуть вводитися парентерально, ректальне, внутрішньоміхурово, через шкірно, перорально або за допомогою аерозолю Перевага віддається пероральному і через шкірному введенню в дозі, від, приблизно, 0,1 мг в день до, приблизно, 1 граму в день Згідно іншому аспекту, цей винахід відноситься до фармацевтичної стандартної лікарської форми у вигляді таблетки, м'якої еластичної желатинової капсули або пристрою для через шкірного введення, до складу яких входить терапевтичне ефективна КІЛЬКІСТЬ (З)-оксибутинша, (S)деетилоксибутинша або фармацевтичне прийнятної солі будь-якого з них, по суті, вільних від ВІДПОВІДНОГО R стереоізомера, і фармацевтичне прийнятний носій Згадані лікарські форми в вигляді таблеток або м'яких еластичних желатинових капсул можуть вироблятися традиційними способами, добре відомими в даній галузі техніки, причому КІЛЬКІСТЬ (S)оксибутинша, (З)-деетилоксибутинша або фармацевтичне прийнятної солі будь-якого з них в кожній стандартній лікарській формі складає, в прийнятному варіанті, приблизно, від 0,1 мг до 500мг, в більш прийнятному варіанті, приблизно, від 25мг до 250мг і в ще більш прийнятному варіанті, приблизно, від 100мг до 200мг Ефективність через шкірного введення підвищується шляхом включення підсилювача проникнення до складу пристрою для через шкірної доставки лікарського засобу Докладний опис винаходу S енантюмери оксибутиніна і DEO можуть бути отримані шляхом розчинення проміжного продукту мигдалевої кислоти, з наступною етерифікацією Етерифікація може здійснюватися, як описано Качуром і іншими (згадана робота) для OXY або вдосконаленим способом, описаним в міжнародній заявці WO 96/23492 В альтернативному варіанті, S енантюмер OXY і DEO може бути отриманий шляхом розчинення рацемічного оксибутиніна або DEO за допомогою традиційних способів, наприклад, фракціонованої кристалізації діастереомерних солей хіральними кислотами Крім того, можуть бути використані ІНШІ стандартні способи розчинення, ВІДОМІ фахівцям в даній галузі, в тому числі, однак не обмежуючись ними, проста кристалізація і хроматографія на хіральнім субстраті Графічні зображення рацемічних, амбіскалемічних і скалемічних або енантюмерно чистих сполук, використаних в цьому описі, взяті з Мер (Maehr J Chem Ed 62 114-120 (1985) Так, суцільні або ламані клини (наприклад, як показано в формулі І), використовуються для позначки абсолютної конфігурації хірального, елементу, обриси клинів і пунктирні або ламані лінії означають енантюмерно чисті сполуки невизначеної абсолютної конфігурації Величина профілактичної або терапевтичної дози (З)-оксибутинша або S-DEO при негайній або тривалій терапії захворювання буде змінюватися в залежності від тяжкості і природи стану, що підлягає лікуванню, і шляху введення Згадана доза і, можливо, частота введення дози, будуть змінюватися індивідуально в залежності від віку, маси тіла і реакції пацієнта В цілому, загальний діапазон денної дози (З)-оксибутинша або S-DEO для стан в, описаних тут, складає, приблизно, від 0,1 мг до 1 граму, в переважному варіанті, приблизно, від 0,4мг до 600мг, в більш прийнятному варіанті, приблизно, під ЮОмг до 1г, в ще більш прийнятному варіанті, приблизно, від 240мг до 750мг, і в найбільш прийнятному варіанті, від 300 до 600мг в вигляді разових доз або же, в переважному варіанті, поділеної на курс лікування загальної дози При лікуванні пацієнта процес повинен починатися з меншої дози, що складає, приблизно, 80мг, з и підвищенням, в залежності від загальної реакції пацієнта, наприклад, приблизно, до 600мг/день Додатково рекомендується, щоб пацієнти старші 65 років і пацієнти з порушеною функцією нирок або печінки спочатку одержували невеликі дози, по повинні титруватися, виходячи з індивідуальної реакцм(-ій) і рівня(-ів) в крові В деяких випадках може виникнути необхідність використання дозувань, що виходять за межі згаданих діапазонів, що буде очевидним фахівцям в даній галузі Додатково слідує відзначити, що лікар, що лікує буде знати, як і коли перервати, відкоректувати або закінчити курс лікування в залежності від індивідуальної реакції пацієнта Терміни "терапевтичне ефективна КІЛЬКІСТЬ" І "КІЛЬКІСТЬ, достатня для лікування нетримання, однак, недостатнє для того, щоб викликати негативні дії" охоплюються описаними вище діапазонами дозувань і схемою застосування лікарського препарату Для забезпечення пацієнта ефективною дозою (З)-оксибутинша або S-DEO може бути використаний будь-який підхожий шлях введення Можуть, наприклад, бути використані пероральна, ректальна, парентеральна (підшкірна, внутрішньом'язова, внутрішньовенна), через шкірна, аерозольна і подібні форми введення Додатково згаданий лікарський препарат може вводитися безпосередньо в сечовий міхур через сечовипускний канал, як описано дм рацемічного оксибутиніна Масадом (Massad) і іншими, [J Urol 148, 595-597 (1992)] До лікарських форм відносяться таблетки, коржики, дисперсії, суспензії, розчини, капсули, системи через шкірної доставки лікарського засобу тощо До складу фармацевтичних композицій, ВІДПОВІДНИХ цьому винаходу, входять (З)-оксибутинш або S-DEO, як активний інгредієнт, або їхня фармацевтичне прийнятна сіль, і може також входити фармацевтичне прийнятний носій, і, факультативно, ІНШІ терапевтичні інгредієнти Терміни "фармацевтичне прийнятні солі" або 8 61916 "їхні фармацевтичне прийнятні солі" означають солі, отримані за допомогою фармацевтичне прийнятних нетоксичних кислот До числа підхожих фармацевтичне прийнятних солей згаданої сполуки, отриманих доданням кислоти, ВІДПОВІДНИХ цьому винаходу, відносяться солі, отримані доданням оцтової, бензолсульфонової, бензойної, камфорсульфонової, лимонної, етансульфонової, фумарової, глюконової, глутамшової, бромистоводневоі, хлористоводневої, ізетюнової, молочної, малеїнової, яблучної, мигдалевої, метансульфонової, слизової, азотної, памової, пантотенової, фосфорної, бурштинової, сірчаної, винної, ртолуолсульфонової і тому подібних кислот Особливо придатним є пдрохлорид і це, фактично, була та сама сіль, яку використовували при проведенні описаних досліджень До числа композицій, ВІДПОВІДНИХ цьому винаходу, відносяться суспензії, розчини, еліксири або тверді лікарські форми Носи, наприклад, крохмалі, цукри і мікрокристалічна целюлоза, розбавителі, гранулюючі речовини, змащуючи речовини, в'яжучі речовини, речовини, сприяючі розпаду тощо, придатні в випадку пероральних твердих препаратів (наприклад, порошків, капсул і таблеток) і твердим пероральним препаратам віддається перевага, у порівняні з рідкими пероральними препаратами Завдяки простоті введення, таблетки і капсули представляють одну з найбільш переважних стандартних пероральних лікарських форм В цьому випадку застосовуються тверді фармацевтичні ноем В випадку необхідності, на таблетки, за допомогою стандартних водних або безводних технологічних засобів, може наноситися покриття В більш прийнятному варіанті здійснення, фармацевтичні композиції, ВІДПОВІДНІ цьому винаходу, можуть виготовлятися в вигляді стандартної лікарської форми в м'яких еластичних желатинових капсулах за допомогою традиційних засобів, добре відомих в даній галузі (дивись, наприклад, Еберт (Ebert), Pharm Tech , 1 (5) 44-50 (1977)) М'які еластичні желатинові капсули мають м'яку кулеподібну желатинову оболонку, товщина якої дещо перевищує товщину твердих желатинових капсул, причому желатина пластифікується доданням гліцерину, сорбіту або подібного полюла Твердість оболонки капсули може змінюватися шляхом зміни типу желатини і КІЛЬКОСТІ пластифікатора і води До складу м'яких желатинових оболонок може входити консервант для запобігання зростання грибів, наприклад, метил- і пропілпарабени і сорбінова кислота Згаданий активний інгредієнт може розчинятися або суспендуватися в рідкому носи або розбавителі, наприклад, рослинних або мінеральних маслах, гліколях, наприклад, поліетиленгліколі і пропіленгліколі, тригліцеридах, поверхнево-активних речовинах, наприклад, полісорбатах або їхніх комбінаціях В стандартній фармацевтичної лікарській формі в вигляді м'якої еластичної желатинової капсули, відповідної цьому винаходу, (З)-оксибутинш або (S)деетилоксибутинш, в переважному варіанті, присутній в КІЛЬКОСТІ, приблизно, від 0,1мг до 500мг, в більш переважному варіанті, в КІЛЬКОСТІ, приблизно, від 25мг до 250мг і, в ще більш переважному варіанті, в КІЛЬКОСТІ, приблизно, від ЮОмг до 200мг Поряд з традиційними лікарськими формами, згаданими раніше, сполуки, ВІДПОВІДНІ цьому винаходу, можуть також вводитися за допомогою інших способів контрольованого виділення і приладів доставки лікарських препаратів, відомих фахівцям в даній галузі техніки Фармацевтичні композиції, ВІДПОВІДНІ цьому винаходу, придатні для перорального введення, можуть бути репрезентовані в вигляді дискретних одиниць, наприклад, капсул, каше або таблеток, до складу кожної з яких входить наперед визначена КІЛЬКІСТЬ активного інгредієнта в вигляді порошку або гранул, або м'яких еластичних желатинових капсул, де активний інгредієнт розчинений або суспендирований в рідкому носи, або представлений в вигляді розчину або суспензії в водному середовищі, неводному середовищі, емульсії масла в воді або емульсії води вмаслі Такі композиції можуть бути отримані за допомогою будь-якого фармацевтичного способу, однак, всі способи включають етап об'єднання згаданого активного інгредієнта з вказаним носієм, що може включати один або декілька необхідних інгредієнтів В цілому, згадані композиції одержують шляхом однорідного і ретельного змішування згаданого активного інгредієнта з рідкими носіями або тонко подрібненими твердими носіями, або з тими і іншими, з наступним, в випадку необхідності, наданням згаданому продукту необхідної форми таким же способом, що відомий для рацемічної суміші Гідна подиву придатність (З)-енантюмера як OXY, так і DEO, була встановлена за допомогою досліджень, опис яких наведений далі ЕНАНТЮМЕРИ ОКСИБУТИНІНА Зв'язування (S)- і (Р)-оксибутинша з підтипами мускаринового рецептора М1, М2, МЗ і М4 людини Джерело білка Експерименти проводили на мембранах, отриманих з клітин SF9, інфікованих бакуловірусами для експресії рекомбінантних ПІДТИПІВ мускаринового рецептора М1, М2, МЗ і М4 Реакції зв'язування Таблиця 1 Рецептор М,н М 2Н Мзн М 4Н Інкубування Еталонна сполука 2нМ 2нМ Неспецифічне зв'язування Атропін (1мкМ) Атропін (1мкМ) 60 хвилин, 27°С 60хвилин,27°С пірензепш метоктрамін 0,8нМ Атропін (1мкМ) 60 хвилин, 27°С 4-дезоксіаденілова кислота 0,ЗнМ Атропін (1мкМ) 60 хвилин, 27°С 4-дезоксіаденілова кислота Радіоізотопний ліганд Концентрація рН] пірензепш рН] AF-DX 384 рН] 4-дезоксіаденілова кислота рН] 4-дезош-аденілова кислота 61916 Після інкубування згадані реакційні проби швидко фільтрували під вакуумом через скловолоконні біологічні фільтри (GF/B) (компанія Whatman) і промивали льодяним буфером за допомогою бранделівського харвестера клітин Рівень зв'язаної радіоактивності визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника (LS 6000, компанія Beckman) з використанням рідкої сцинтиляційної суміші (Формула 99, компанія DuPont NEN) Протокол експерименту Для отримання конкурентних кривих згадані сполуки випробували на кожному рецепторі в 10 концентраціях з повторенням В процесі здійснення кожного експерименту, для отримання конкурентної кривої для оцінки результатів експерименту, 10 водночас в 8 концентраціях з повторенням випробували еталонну сполуку для рецептора, що піддавалася дослідженню Аналіз і вираження результатів Специфічне зв'язування кожного рецептора радіоізотопним лігандом визначали, як різницю між загальним зв'язуванням і неспецифічним зв'язуванням, що визначалися в присутності надлишку ліганду без радіоактивної мітки Значення ICso (концентрації, необхідні для пригнічення 50% специфічного зв'язування) визначали шляхом нелінійного регресійного аналізу згаданих конкурентних кривих Згадані параметри були отримані шляхом підбору емпіричної кривої за допомогою програми SigmaplotTM IC50 для R- і S-OXY наведені в Таблиці 2 Таблиця 2 Зв'язування R-оксибутиніна і S-оксибутиншаз підтипами мускариновогорецептора М1-М4 людини Рецептор М1 М2 МЗ М4 R-OXY ІС50 (нМ) 0,99 9,9 1,8 1,2 S-OXY ІС50 (нМ) 47,6 178 149 100 ICso еталонної сполуки (нМ) пірензепш 11,9 метоктрамін 14,6 4-дезоксіаденшова кислота 1,6 4-дезоксіаденілова кислота 0,87 Ці результати свідчать про те, що S-OXY має меншу спорідненість до ПІДТИПІВ мускаринового рецептора, у порівнянні з R-OXY Зв'язування (S)-1 (Р)-оксибутинша з кальцієвими каналами Реакції зв'язування Таблиця З Реакції зв'язування здійснювали за допомогою наступних способів Рецептори Еталонні сполуки Мембрани кальцієвий канал (Т-тип+І_-тип, дільниця зв'язу- кора головного мозку вання дилтіазема) щурів Кальцієвий канал (Т-тип+І_-тип, дільниця зв'язу- Кора головного мозку вання верапамшу) щурів Посилання дилтіазем Шумейкер (Schoemaker) і Ланкр (Langer) (1985) D600 Рейнольде (Reynolds) і ІНШІ (1986) Таблиця 4 Умови здійснення згаданого експерименту були такими Рецептори кальцієвий канал (Т-тип+І_-тип, дільниця зв'язування дилтіазема) кальцієвий канал (Т-тип+І_-тип, дільниця зв'язування верапамшу) Ліганди Концентрації Неспецифічне зв'язування Інкубування рН] дилтіазем 5нМ дилтіазем (ЮмкМ) 120 хвилин, 25°С fH]D 888 0,5нМ D600(10MKM) 60 хвилин, 22°С Після інкубування згадані реакційні проби швидко фільтрували під вакуумом через скловолоконні біологічні або ХІМІЧНІ фільтри (GF/B або (GF/C) (компанія Whatman) і промивали льодяним буфером за допомогою бранделівського харвестера клітин Рівень зв'язаної радіоактивності визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника (LS 6000, компанія Весктап)з використанням рідкої сцинтиляційної суміші (Формула 989, компанія DuPont NEN) Протокол експерименту Згадані сполуки випробували з повторенням на кожному рецепторі в концентрації 10 5 М В процесі здійснення кожного експерименту, для отримання конкурентної кривої для оцінки результатів експерименту, водночас в 8 концентраціях з повторенням випробували еталонну сполуку для рецептора, що піддавався дослідженню Аналіз і вираження результатів Специфічне зв'язування кожного рецептора радіоізотопним лігандом визначали, як різницю між загальним зв'язуванням і неспецифічним зв'язуванням, що визначалися в присутності надлишку ліганду без радіоактивної мітки Середні значення, як ступінь пригнічення в процентному вираженні, представлені в Таблиці 5 Значення ICso (концентрації, що необхідні для пригнічення 50% специфічного зв'язування) визначали шляхом нелінійного регресійного аналізу згаданих конкурентних кривих Згадані параметри були отримані шляхом 12 11 61916 підбору емпіричної кривої за допомогою програми Sigmaplot1 Таблиця 5 Зв'язування (R)-1 (ЗІ-оксибутиніна з кальцієвими каналами (Пригнічення (в %) зв'язування дилтіазема і верапамша з рецепторами кальцієвих каналів) R-OXY(10bM) 86 86 Рецептор кальцій (дилтіазем) кальцій (верапамш) S-OXY(10bM) 59 68 Наведені результати свідчать про те, що SOXY має активність блокування кальцієвих каналів, подібну активності R-OXY ЕНАНТЮМЕРИ ДЕЕТИЛОКСИБУТИНІНА Основним метаболітом рацемічного оксибутиніна є RS-деетилоксибутинш (DEO) Перед проведенням наших досліджень, R і S енантюмери DEO не були описані і антиспазмолітична активність R-1 S-DEO, а також їхня активність блокування кальцієвих каналів відомими не були Ми синтезували ці енантюмери і на моделях зв'язування рецепторів і функціонування сечового міхура досліджували їхню антимускаринову і спазмолітичну активність, а також активність блокування кальцієвих каналів Ми встановили, що кожний енантюмер згаданого метаболіту зберігає відносний фармакологічний ІС50 еталонної сполуки (нМ) дилтіазем 55,8 D600 36,4 профіль свого "батьківського" оксибутиншового енантюмера Зв'язування на підтипах мускаринового рецептора Ступінь пригнічення (в процентному вираженні) специфічного зв'язування радіоізотопного ліганда, індуковану трьома концентраціями кожної сполуки (R-, S- і RS-DEO), випробували на підтипах (М1-М4) тонованого мускаринового рецептора людини, як описувалося раніше для енантюмерів оксибутинша В наступних таблицях (Таблиці 6 і 7) в процентному відношенні представлений ступінь пригнічення на кожному ПІДТИПІ Крім того, для ПІДТИПІВ М1 і М2 мускаринового рецептора людини були визначені значення ICso, що представлені в Таблиці 6 Таблиця 6 R-DEO S-DEO RS-DEO М,н 10 а М 63 43 ю'м 100 82 100 10 ь М 100 101 100 ІС50 (нМ) 1,2 25,4 1,8 10 а М 21 ю'м 97 36 94 М 2Н 10 ь М 102 101 99 ІС50 (нМ) 14,7 177 7,0 Таблиця 7 R-DEO S-DEO RS-DEO 10 а М 58 36 М,н 10 ь М 100 99 101 ю'м 100 63 99 М 2Н 10 а М 58 34 ю'м 100 43 99 10 ь М 99 99 95 Наведені результати свідчать про те, що S-DEO має меншу спорідненість до ПІДТИПІВ мускаринового рецептора, ніж R- або рацемічний DEO Зв'язування на кальцієвих каналах Ступінь пригнічення (в процентному вираженні) специфічного зв'язування радіоізотопного ліганда, індуковану кожною сполукою (R-, S- і RS-DEC), випробували на дільницях зв'язування дилтіазема і верапаміла кальцієвого каналу L-типу Результати представлені в Таблиці 8 Таблиця 8 Рецептор Кальцій (дилтіазем) Кальцій (верапамш) b R-DEO10 M 86 96 Наведені результати свідчать про те, що SDEO має активність блокування кальцієвих каналів, подібну активності R- або рацемічного DEO Визначення функціональних характеристик антимускариновоі/антиспазматичної активності Ефекти R-, S- і RS-оксибутинша (OXY), і R-, Sі RS-DEO вивчалися in vitro на моделі функціонування сечового міхура Як описано далі, виділені смужки гладкого м'язу сечового міхура морської свинки розміщували в препарувальну ванночку і викликали їхні скорочення за допомогою мускаринового агоніста карбахола або за допомогою підвищених концентрацій калію, що надходив з зов b S-DEO 10 M 72 76 b RS-DEO 10 M 88 89 нішнього джерела Смужки сечового міхура Експерименти здійснювали способами, подібними способам, описаним Качуром і іншими, 1988 і Норона-Блобом і Качуром, 1991 3 сечового міхура статевозрілих морських свинок лінії Hartley масою 400-600г (компанія Elm Hill Breeding Laboratories, Челмсфорд, Массачусетс) вирізали смужки тканини (приблизно, довжиною 10мм і шириною 1,5мм) Тканину суспендували в насиченому киснем буфері наступного складу, в мМ NaCI, 133, КСІ, 4,7, СаСІ2, 2,5, MgSO4 0,6, NaH2PO4 1,3, NaHCO3, 16,3, і глюкоза, 7,7 Смужки витримували при температурі 37,5°С Скорочення реєстрували за допомогою ізометрич 14 13 61916 них датчиків (Модель FT-10) і багатоканального залежності між концентрацією і ефектом Після чорнильного самописця (Модель 7) (компанія цього, дані, отримані для кожного антагоніста, Astro-Med, Inc , філія Grass Instrument Div, Уестаналізували на ВІДМІННОСТІ, зв'язані з обробкою, за Варвік, Род Айленд) Всі згадані смужки постійно допомогою однофакторного дисперсійного аналізу підтримувалися під напругою спокою 0,5 граму (ANOVA) Оскільки кожна смужка сечового міхура піддавалася впливу лише однієї концентрації анВ кожному експерименті з одного сечового мітагоніста, для визначення рА2 і нахилу регресії хура нарізали до семи смужок, суспендували їх в Шильда використовували методики Арунлакшана окремих тканинних камерах і врівноважували роз(Amnlakshana) і Шильда (Schild) (1959) в модифічином для препарувальних ванночок на протязі кованому вигляді Передусім, для кожної смужки, однієї години перед подальшим проведенням ексза даними другої серії експериментів ю визначенперименту ню залежності між концентрацією і ефектом, виСкорочення, індуковані карбахолом Одна сезначали концентрації агоніста, що викликають нарія експериментів була присвячена антихолінерппівмаксимальну реакцію (ЕС50) EC50 визначали за чній дії оксибутинша Скорочення тканинних смукривими лінійної регресії, підібраним за логарифжок в цих експериментах, для оцінки мом концентрації лікарського препарату і реакціям, життєздатності кожної з них і для наступного викощо обмежують напівмаксимальний рівень реакції ристання в якості еталонної основи, спочатку реобаб ч Для кожної тканинної смужки, обробленої єстрували, як реакцію на вплив тканевого живильпрепаратом, "коефіцієнт концентрації" (CR) обчисного середовища, в якому NaCI був заміщений КСІ лювали, як коефіцієнт ЕС50 обробленої тканини, дія отримання концентрації КСІ в середовищі на поділений на ЕС50 необробленої тканини Для корівні 137,7мМ Після ЦЬОГО повернулися до станжного експерименту, в якому дві або більше ткадартного живильного середовища, в наступному нинних смужок піддавалися впливу однієї і тієї ж згадані тканинні смужки піддавали впливу конценхімічної речовини, але в різноманітних концентратрацій карбахола, що поступово збільшувались, ціях, викреслювали "графіки Шильда", тобто грапричому вплив кожної концентрації тривав лише фіки залежності логарифма згаданого коефіцієнта до реєстрації максимальної реакції Після цього, мінус 1 [тобто log (CR-1)] від логарифма концентзалишивши одну смужку без обробки і/або одну рації антагоніста, впливу якого піддавалася ткасмужку під впливом 17мМ розчину етанола для нинна смужка Для визначення рА2 і нахилу лінії використання як контрольної тканини(-ин), кожну з регресії використовували регресійний аналіз, що тканинних смужок, що залишалися на протязі одзв'язує log (CR-1) з логарифмом концентрації зганієї години піддавали впливу однієї з концентрацій даного антагоніста І, нарешті, дані експериментів антагоніста Контрольні смужки, що зберігалися в групували за ХІМІЧНИМИ речовинами для обчисленрозчині етанола, використовувались втому випадня середнього значення ± середня квадратична ку, коли по причині поганої розчинності концентропомилка рА2 і нахилу кривої 95% довірчі рівні (CL) вані розчини експериментальних речовин повинні для згаданої кривої визначали по середній квадбули готуватися в етанолі, внаслідок чого в препаратичній помилці за допомогою стандартних спорувальних ванночках справді виявлявся 17мМ собів Для експериментів, в яких впливу даної хімірозчин етанола В кінцевому рахунку, в другий раз чної речовини піддавалася всього одна тканинна реєструвалися реакції на підвищені концентрації смужка, pKD обчислювали, як (концентрація антакарбахола, з наступним впливом 137,7мМ розчину roHicra)/(CR-1), після чого від'ємний логарифм KD КСІ об'єднували зі значеннями рА2 для отримання розширеної множені значень рА2 Скорочення, індуковані калієм Друга серія експериментів була присвячена спазмолітичній дії досліджуваних речовин Скорочення реєструвалиВплив рацемічного оксибутинша і DEO, а тася, як реакція на послідовно зростаючу концентракож їхніх ВІДПОВІДНИХ енантюмерів на скорочення, цію калію в живильному середовищі індуковане карбахолом, в узагальненому вигляді представлений в наведеній далі Таблиці 9 НавеАналіз даних Для визначення, чи знижують дені значення являють собою узагальнені дані антагоністи максимальну реакцію на агоністів, мааналізів Шильда, що дадуть значення рА2 [середксимальну напругу, що розвивається кожній смужнє значення ± середня квадратична помилка] і кою при здійсненні другої серії визначення, виранахилу [середнє значення + середня квадратична жали в вигляді відсотка від максимальної напруги, помилка] що розвивалася в процесі першого визначення Таблиця 9 Антагоніст R-OXY S-OXY RS-OXY R-DEO S-DEO RS-DEO Число експериментів 4 4 5 4 4 4 Наведені результати свідчать, що як S-OXY, так і S-DEO є більш слабкими антагоністами мускаринових рецепторів сечового міхура, ніж R- і рацемічний OXY, а також R- і рацемічний DEO Вплив рацемічного оксибутинша і його енантюмерів на скорочення, індуковані калієм, в уза рА2 8,800±0,27 7,090±0,13 8,810±0,29 9,040±0,32 7,310±0,35 8,550±0,32 Нахил кривої 1,280±0,26 1,130±0,17 1,340±0,15 1,160±0,11 0,870±0,11 1,350±0,25 гальненому вигляді представлені в наведеній далі Таблиці 10 (Наведені значення являють собою величину скорочення, індуковану 137,7мМ К+ після 60-хвилинного впливу сполуки, поділену на величину скорочення, індуковану перед впливом лікарського препарату) 15 61916 Таблиця 10 Середній % перед обробкою ± середня квадр помилка (п=3) R-OXY 328±" S-OXY 269±" RS-OXY 201 ±* R-DEO 365±" S-DEO 425±" RS-DEO 478±" * Що істотно відрізняється від ВІДПОВІДНОГО значення для необробленихтканин(р