Спосіб визначення антигельмінтиків у продукції тваринного походження за допомогою рх/мс/мс

Реферат: Спосіб визначення залишкових кількостей антигельмінтиків у продукції тваринного походження 3 полягає у дослідженні 10 г (10 см ) підготовленого зразка, який екстрагують за допомогою ацетонітрилу з додаванням магнію сульфату та сорбенту С 18, центрифугують, додають диметилсульфоксид, випаровують екстракт під потоком азоту до невипаровного залишку, переносять залишок у віалку для аналізу, з подальшим дослідженням на рідинному хроматомас-спектрометрі. UA 105433 U (12) UA 105433 U UA 105433 U 5 10 15 20 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема до біохімії та токсикології, і може бути використана в роботі науково-виробничих лабораторій. Методика не має зареєстрованих аналогів в Україні. Задачею корисної моделі є розробка універсального та швидкого способу виявлення залишкових кількостей антигельмінтиків, таких як альбендазол, фенбендазол, левамізол, івермектин, авермектин у продукції тваринного походження, суттєве скорочення часу на пробопідготовку, зменшення витрат реактивів, посуду, зниження собівартості способу. Процедурний підхід до ідентифікації антигельмінтиків удосконаленим нами способом 3 включає наступні елементи: для аналізу беруть 10,0 г ± 0,1 (10,0 см ) підготовленого, 3 гомогенізованого зразка в центрифужну пробірку, додають 12 см ацетонітрилу та екстрагують 1 хв при 100 об/хв. на роторному змішувачі, додають 1 г натрію хлористого та 4 г магнію сульфату, ретельно струшують 1 хв. (відразу після додавання реагентів, щоб запобігти утворенню суцільної грудки) центрифугують 12 хв. при 3500 об./хв. при температурі 4 °C, 3 переносять екстракт ацетонітрилу в чисту центрифужну пробірку на 15 см та додають 1,5 г магнію сульфату та 0,5 г сорбенту С18, ретельно змішують, центрифугують 10 хв. при 2500 3 об./хв. при температурі 4 °C, відбирають 6 см екстракту в чисту центрифужну пробірку на 15 3 3 см та додають 0,25 см диметилсульфоксиду, змішують 30 с, випарюють екстракт під потоком азоту при 50 °C до невипаровного залишку, переносять залишок у віалку для аналізу [4]. Конфігурація рідинного хроматографа з тандемним мас-детектором "WATERS Quattro Premier ХЕ" з рідинним блоком "Alliance": градієнтний насос, автосамплер, термостат колонок, тандемний квадрупольний мас-спектрометр / ESI готують згідно інструкції з експлуатації приладу та задають робочі параметри. Конфігурація та режим роботи: Хроматограф: Колонка Температура термостату колонки Об'єм інжекції (петлі) Режим введення проби Витрата рухливої фази (елюенту) Градієнт (рухома фаза) ''Waters Quattro Premier XE" "SunFire С18", 50*4,6 мм, 5 мкм 60 °C 3 100 мм автоматичний 3 0,4 cм /хв 0,01 % оцтова кислота уводі: ацетонітрил (90:10) (А): 5мМ розчин амонію формату в метанолі:ацетонітрилі (75:25) (В) Таблиця 1 Співвідношення градієнтів Час 0,0 хв. 2,0 хв. 4,0 хв. 7,0 хв. 9,0 хв. 10,0 хв. Мобільна фаза А, % 100 100 0 0 100 100 25 Тандемний квадрупольний мас-спектрометр: Ion Source ESI Polarity positiv 1 Мобільна фаза В, % 0 0 100 100 0 0 UA 105433 U Таблиця 2 Параметри введення даних для проведення досліджень на рідинному хроматографі з подвійним мас-детектором "Waters Quattro Premier XE Компонент Материнський іон Левомізол 204.97 Альбендазол Фенбендазол 299.8 Абамектин 890.1 Івермектин 892.25 Фенбендазол Д5 Альбендазол Д3 Левамізол Д5 5 266 305 269,2 210,1 Дочірні іони 123.02 177.99 190.97 234 159 268 305.15 567.25 307.11 569.1 273 233,8 183 Напруження на Енергія зіткнення конусі 35 26 35 30 38 30 38 15 36 28 36 23 35 25 35 15 40 27 40 14 35 20 40 10 40 15 Час виходу антигельмінтиків залежить від швидкості потоку, витрати елюенту, типу аналітичної колонки. Умови виконання вимірювань підлягають перевірці і, при потребі, корегуванню: - при переході на інший хроматограф; - при заміні колонок; - після ремонту вузлів хроматографа, що впливають на чутливість детектора. Хроматограф градуюють по градуювальних розчинах антигельмінтиків. 10 Таблиця 3 Валідаційні дані № Назва показника 1. 2. 3. 4. 5. 20 Левомізол Альбендазол Фенбендазол 6. 7. 8. 15 Абамектин Івермектин Левомізол Альбендазол Фенбендазол Межа кількісного визначення, мкг/кг Печінка 11,8 7,42 М'язи 3,0 35,07 23,28 Молоко 6,31 34,76 3,51 Мінімально допустимий рівень, мкг/кг 20 100 10 100 50 10 100 10 Отриманні валідаційні дані наведені в таблиці 3 та результати участі у міжлабораторних порівняльних дослідженнях (програма Fapas), наведені в таблиці 4 свідчать про те, що методика, розроблена в ДНДІЛДВСЕ, придатна для всіх видів продукції, даний спосіб є досить чутливим, щоб детектувати дані речовини. Так як у відношенні сполук, для яких встановлено максимально допустимий рівень (МДР), показник межа кількісного визначення повинен бути менше МДР. Наша методика дозволяє за досить короткий проміжок часу дослідити зразок на одночасно багато показників різних класів, що значно заощаджує час, реактиви, і в свою чергу знижує собівартість дослідження. 2 UA 105433 U Таблиця 4 Участь у міжлабораторних порівняльних дослідженнях (програма Fapas) № програми 02190 (09.07.2012) 02212 (22.07.2013) 02222 (19.11.2013) 5 10 15 20 25 Найменування досліджень Avermectins in corned deef Avermectins in corned deef Anthelmintics in bovine milk Приписне значення, мкг/кг Результат, мкг/кг Z-індекс івермектин 25,0 (14-36) 31,2 1,1 івермектин 24,4 (13,7-35,1) 21,1 -0,6 левамізол 142 (81-203) 170,8 0,9 Показник Результати, отримані нами під час дослідження референс-матеріалу, є вірогідними і знаходяться в межах приписного значення. Отже, відпрацьована нами методика виявлення антигельмінтиків не поступається методикам, які використовуються в лабораторіях Європейської спільноти. Джерела інформації: 1. Commission Decision (2002/657/EC) of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and interpretation of results, O.J. Europ. Comm. L 221, 8-36. 2. Food Research Centre методики, "FADM 515: Determination of anthelmintic residues in animal tissues and milk by UPLC-MS/MS.Heitzman R. J. Veterinary drug residues. Residues in food producing animals and their products: Reference materials and methods. Oxford: Blackwell scientific publications. - 1994. - 512 p. 3. A new QuEChERS dispersive SPE material and method for analysis of veterinary drug residue by LC-MS-MS. Olga Shimelis, Michael Ye, fnd Len Sidisky./ Sigma-Aldrich/p. 21. (2011). 4. Новожицька Ю.М. Визначення антигельмінтиків в продукції тваринного походження за допомогою рідинного хроматомаспектрометра /Методичні рекомендації. - Київ. - 2014. - С. - 23. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення залишкових кількостей антигельмінтиків у продукції тваринного походження, 3 що полягає у дослідженні 10 г (10 см ) підготовленого зразка, який екстрагують за допомогою ацетонітрилу з додаванням магнію сульфату та сорбенту С 18, центрифугують, додають диметилсульфоксид, випаровують екстракт під потоком азоту до невипаровного залишку, переносять залишок у віалку для аналізу, з подальшим дослідженням на рідинному хроматомас-спектрометрі. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3