Спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин

Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин шляхом заморожування клітин до -196 °C з використанням кріоконсерванта, що містить 10 % ДМСО, 0,9 % NaCl, 10 мМ фосфатного буфера і воду дистильовану. В кріоконсервант додатково вводять ПЕО-1500 в концентрації 15 %, 1,2-ПД в концентрації 5 % і сахарозу в концентрації 5 %. UA 106776 U (12) UA 106776 U UA 106776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана при розробці методів тривалого низькотемпературного зберігання еритроцитів тварин з метою трансфузії. Відомим аналогом є спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин, згідно з яким еритромасу заморожують у кріозахисному середовищі ЦОЛІПК 1U, що містить 30 % гліцерину, 4 % маніту, 0,7 % NaCl, 0,03 % Na2HPO4*12H2O, до температури -196 °C шляхом занурення контейнера у рідкий азот [1]. Відігрівають зразки на водяній бані при температурі 42-44 °C. Недоліком аналога є низька збереженість еритроцитів (гемолізує близько 74 % клітин) [1]. Це повязано з низьким коефіцієнтом проникності гліцерину до еритроцитів тварин [2]. Відомим аналогом є спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин з використанням кріоконсерванта, що містить 15 % ПЕО-1500, 0,9 % NaCl, 10 мМ фосфатного буфера і воду дистильовану. Кріоконсервант додають до еритромаси у співвідношенні 1:1, заморожують до 196 °C зануренням в рідкий азот, відігрівають при 42-44 °C [3]. Недоліком аналога є те, що одразу після розморожування, хоч і залишається 95 % негемолізованих клітин, але знижується осмотична стійкість еритроцитів і при моделюванні трансфузії спостерігається гемоліз до 50 % клітин. Найближчим аналогом до корисної моделі є спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин з використанням кріоконсерванта, що містить 10 % ДМСО, 0,9 % NaCl, 10 мМ фосфатного буфера і воду дистильовану. Кріоконсервант додають до еритромаси у співвідношенні 1:1, заморожують до -196 °C зануренням в рідкий азот, відігрівають при 42-44 °C [4]. Недоліком аналога є високий рівень гемолізу еритроцитів після кріоконсервування (43,746,9 %) і при моделюванні трансфузії (7,2-7,6 %). В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин шляхом зміни складу кріоконсерванта, що дозволить знизити рівень гемолізу еритроцитів після кріоконсервування і при моделюванні трансфузії. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин, який включає заморожування клітин до -196 °C з використанням кріоконсерванта, що містить 10 % ДМСО, 0,9 % NaCl, 10 мМ фосфатного буфера і воду дистильовану, згідно з корисною моделлю, в кріоконсервант додатково вводять ПЕО-1500 в концентрації 15 %, 1,2-ПД в концентрації 5 % і сахарозу в концентрації 5 %. Додавання ПЕО-1500, 1,2-ПД і сахарози у кріозахисне середовище дозволяє знизити гемоліз еритроцитів після кріоконсервування на 19,2-22,1 % і при моделюванні трансфузії на 1,9-2,5 %. Корисну модель виконують наступним чином: Кров центрифугують при 800 об/хв протягом 5 хвилин і видаляють надосад, а еритромасу ще тричі відмивають фізіологічним розчином, що містить 0,9 % NaCl. До відмитої еритромаси у об'ємному співвідношенні 1:1 додають кріоконсервант, що містить 15 % ПЕО-1500, 10 % ДМСО, 5 % 1,2-ПД, 5 % сахарози, 0,9 % NaCl, 10 мМ фосфатного буфера і воду дистильовану. Еритромасу з кріоконсервантом перемішують і витримують 15 хвилин при кімнатній температурі (20-22 °C). Отриману суспензію розливають в пластикові контейнери об'ємом 1 мл і занурюють в рідкий азот (-196 °C), де зберігають до моменту використання. Відігрівання здійснюють на водяній бані при 40 °C до появи рідкої фази. Після відігрівання еритроцити відмивають від середовища кріоконсервування в два етапи. На першому етапі до суспензії еритроцитів додають у об'ємному співвідношенні 1:1 розчин, який містить 0,6 М NaCl, 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,4. На другому етапі еритроцити двічі промивають розчином, який містить 0,15 М NaCl, 10 мМ фосфатного буфера. Корисна модель пояснюється прикладами конкретного виконання. Приклад 1 До відмитої еритромаси з крові тварин (кінь, бугай, кріль) у об'ємному співвідношенні 1:1 додавали кріозахисне середовище, яке містить 15 % ПЕО-1500, 10 % ДМСО, 5 % 1,2-ПД, 5 % сахарози, 0,9 % NaCl, 10 мМ фосфатного буфера і воду дистильовану. Еритромасу з кріоконсервантом перемішували і витримували 15 хвилин при кімнатній температурі (20-22 °C). Отриману суспензію занурювали у рідкий азот (-196 °C) в пластиковому контейнері об'ємом 1 мл. Відігрівання здійснювали на водяній бані при 40 °C до появи рідкої фази. Після відігрівання еритроцити відмивали від середовища кріоконсервування спочатку розчином, який містить 0,6 М NaCl, 10 мМ фосфатного буфера, а потім ще двічі промивали розчином, який містить 0,15 MNaCl, 10 мМ фосфатного буфера. Збереженість еритроцитів оцінювали за виходом гемоглобіну [5] шляхом вимірювання на спектрофотометрі оптичної щільності в надосаді при довжині хвилі 543 нм, виражали у відсотках відносно 100 % гемолізованих клітин. Оцінювали сумарний гемоліз після відігрівання заморожених еритроцитів і відмивання від кріозахисного середовища. Для порівняння 1 UA 106776 U 5 10 15 20 моделювання трансфузії після кріоконсервування проводили перенесенням еритроцитів у аутоплазму при 37 °C та інкубуванням протягом 24 годин. Моделювання трансфузії проводили також після кріоконсервування еритроцитів з кріоконсервантом за прототипом. Результати наведені у таблиці 1. З таблиці 1 видно, що гемоліз еритроцитів тварин після кріоконсервування заявленим способом на 19,2-22,1 % менше, ніж у прототипі. При моделюванні трансфузії гемоліз на 1,92,5 % нижче, ніж у прототипі. Приклад 2 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що в кріоконсерванті ПЕО1500 брали в різних концентраціях: 10, 15 і 20 %. Результати наведені у таблиці 2. З таблиці 2 видно, що як при зменшенні концентрації ПЕО-1500, так і при її збільшенні гемоліз еритроцитів збільшується. Приклад 3 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що в кріоконсерванті 1,2-ПД і сахарозу брали в концентраціях 5 і 10 %. При цьому ПЕО-1500 брали у концентрації 10 %, щоб сумарна концентрація кріопротекторів у кріоконсерванті сильно не збільшувалась. Результати наведені у таблиці 3. З таблиці 3 видно, що збільшення концентрації 1,2-ПД або одночасно 1,2-ПД і сахарози призводить до збільшення гемолізу еритроцитів після кріоконсервування. Збільшення концентрації ПЕО-1500 у відсутності 1,2-ПД і сахарози також призводить до збільшення гемолізу еритроцитів і є недоцільним. Таблиця 1 Гемоліз еритроцитів тварин після кріоконсервування, % (n=6) Показники Після кріоконсервування При моделюванні трансфузії Спосіб кріоконсервування Найближчий аналог Корисна модель 46,9±2,8 25,4±2,0 45,5±2,5 23,4±2,0 43,7±2,3 24,5±2,1 7,5±0,6 5,6±0,4 7,2±0,5 5,1±0,3 7,6±0,7 5,2±0,3 Тварини кінь бугай кріль кінь бугай кріль Таблиця 2 Гемоліз еритроцитів тварин після кріоконсервування залежно від концентрації ПЕО-1500, % n=6) Тварини кінь бугай кріль 10 54,5±3,5 47,3±4,1 49,5±3,4 Концентрація ПЕО-1500, % 15 25,4±2,0 23,4±2,0 24,5±2,1 20 42,2±3,8 41,1±4,0 43,8±4,2 Таблиця 3 Гемоліз еритроцитів тварин після кріоконсервування у залежності від концентрації 1,2-ПД і сахарози, % (n=6) Тварини кінь бугай кріль 5 % 1,2-ПД, 5 % сахарози, 15 % ПЕО-1500 25,4±2,0 23,4±2,0 24,5±2,1 Склад кріоконсерванта 10 % 1,2-ПД, 5 % 10 % 1,2-ПД, 10 % сахарози, 10 % сахарози, 10 % 20 % ПЕО-1500 ПЕО-1500 ПЕО-1500 54,5±3,5 44,3±3,2 39,5±2,7 47,3±4,1 38,4±2,7 35,5±2,4 49,5±3,4 40,4±3,5 36,5±2,5 25 2 UA 106776 U 5 10 Джерело інформації: 1. Денисова О.Н., Жегунов Г.Ф., Бабийчук Л.А. Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленгликоля, глицерина // Проблемы криобиологии. 2005. - № 2. - С. 195-201. 2. Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н. Проницаемость эритроцитов млекопитающих для молекул глицерина и ДМСО и степень сохранности клеток после замораживания // Доповіді Національної академії наук України. - 2010. - № 2. - С. 139-143. 3. Денисова О.М. Кріочутливість еритроцитів різних видів ссавців: Автореф. дис. … канд. біол. наук. - Харків, 2006. - 20 с. 4. Улизко П.Ю., Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н. Влияние криоконсервирования с ДМСО на сохранность и осмотическую эритроцитов различных видов млекопитающих // Проблемы криобиологии. - 2005. - № 2. - С. 195-201. 5. Клінічна лабораторна діагностика: Навч. посібник / Аксененко Л.П., Баркоган З.С., Гетте З.П. та ін.; За ред. Базарнової М.А., Гетте З.П. - К.: Вища шк., 1994. - С. 186-187. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб кріоконсервування еритроцитів тварин шляхом заморожування клітин до -196 °C з використанням кріоконсерванта, що містить 10 % ДМСО, 0,9 % NaCl, 10 мМ фосфатного буфера і воду дистильовану, який відрізняється тим, що в кріоконсервант додатково вводять ПЕО-1500 в концентрації 15 %, 1,2-ПД в концентрації 5 % і сахарозу в концентрації 5 %. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3