Спосіб кріоконсервування еритроцитів

Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів включає заморожування клітин до -196 °C в кріоконсерванті, що містить кріопротектор 1,2-пропандіол (1,2-ПД), NaCl і воду дистильовану, відігрівання на водяній бані і відмивання клітин від кріоконсерванту. В кріоконсервант додатково вводять кріопротектор ПЕГ-1500 в концентрації 20 %, 1,2-ПД беруть в концентрації 16 %, а відмивання клітин здійснюють ізотонічним розчином NaCl. UA 95947 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ЕРИТРОЦИТІВ UA 95947 U UA 95947 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до кріобіології і може бути використана для низькотемпературного зберігання еритроцитів з метою трансфузії. Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів при -196 °C з використанням кріоконсерванту, що містить гліцерин, маніт, фосфат, який додають до еритромаси у співвідношенні 1:1. Недоліком способу є його трудомісткість, пов'язана з необхідністю 4-кратного відмивання еритроцитів після розморожування з використанням ряду гіпертонічних розчинів [1]. Найбільш близьким до заявлюваного способу є спосіб кріоконсервування еритроцитів з використанням кріоконсерванту, що містить 35-75 % 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), 8-16 % полівинілпірролидону (ПВП), 2-6 % сахарози, натрію хлорид (NaCl) і воду дистильовану. Кріоконсервант додають до еритромаси у співвідношенні 1:1, заморожують до -70 °C з подальшим зануренням в рідкий азот (-196 °C), відігрівають при 41-45 °C і відмивають двома гіпертонічними розчинами, що містять сорбітол і NaCl [2]. Недоліком цього способу є те, що в ньому використовуються високі концентрації проникаючого кріопротектору 1,2-ПД, у зв'язку з чим, потрібне відмивання розморожених еритроцитів двома гіпертонічними розчинами. Крім того, спосіб передбачає 2-етапне заморожування. Все це вимагає великих витрат праці і коштів. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування еритроцитів, в якому б шляхом зміни складу кріоконсерванту забезпечувалася можливість спростити процес заморожування і відмивання клітин і таким чином знизити трудомісткість способу і витрати коштів на його здійснення. Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування еритроцитів, що включає заморожування клітин до -196 °C в кріоконсерванті, що містить кріопротектор 1,2-ПД, NaCl і воду дистильовану, відігрівання на водяній бані і відмивання клітин від кріоконсерванту, згідно з корисною моделлю, в кріоконсервант додатково вводять кріопротектор поліетиленгліколь м.м. 1500 (ПЕГ-1500) в концентрації 20 %, 1,2-ПД беруть в концентрації 16 %, а відмивання клітин здійснюють ізотонічним розчином NaCl. Введення до складу кріоконсерванту кріопротектору ПЕГ-1500 дозволяє знизити концентрацію 1,2-ПД, при цьому зберігається стійкість еритроцитів до осмотичного стресу в процесі їх відігрівання, що дозволяє здійснювати відмивання клітин після розморожування однокомпонентним розчином, який містить ізотонічну (0,9 %) концентрацію NaCl. Окрім цього, застосування кріоконсерванту такого складу дає можливість здійснювати швидке заморожування в один етап шляхом занурення контейнерів в рідкий азот (-196 °C), виключаючи контроль швидкості охолодження. Спрощення процесів відмивання клітин і заморожування дозволяє знизити трудомісткість способу і кошти, що витрачаються на його здійснення. Спосіб здійснюють таким чином. Кров центрифугують при 1500 об/хв протягом 15 хвилин, видаляють надосад, а еритромасу відмивають розчином, що містить 0,9 % NaCl. До відмитої еритромаси у співвідношенні 1:1 додають кріоконсервант, що містить 20 % ПЕГ-1500, 16 % 1,2-ПД, 0,6 % NaCl і воду дистильовану. Кріоконсервант з еритромасою перемішують, витримують 30 хвилин при 22-25 °C. Отриману суспензію розливають в контейнери і занурюють в рідкий азот (-196 °C), де зберігають до моменту використання. Відігрівання здійснюють на водяній бані при 40 °C. Після відігрівання еритроцити відмивають при 37 °C 0,9 % розчином NaCl. Відмиті еритроцити переводять в розчин 8В, що містить 0,3 % NaCl, 7 % сукрози, 0,2 % Na2HPO4+12H2O і 0,1 % NaH2PO4+2H2O для гіпотермічного зберігання (4 °C) [2]. Приклад 1 До відмитих еритроцитів (60 мл) у співвідношенні 1:1 додавали кріоконсервант, що містить 20 % ПЕГ-1500, 16 % 1,2-ПД, 0,6 % NaCl і воду дистильовану. Суспензію перемішували і витримували протягом 30 хвилин при 22-25 °C, після чого розливали в металеві контейнери об'ємом 130 мл, виготовлені з нержавіючої сталі. Контейнери закручували фторопластовими пробками і занурювали в рідкий азот (швидкість заморожування 400-600 °C/хв). Відігрівали на водяній бані при 40 °C протягом 5 хвилин. Відмивання еритроцитів проводили ізотонічним (0,9 %) розчином NaCl при 37 °C. Для цього до одного об'єму розмороженої суспензії, на водяній бані (37 °C) повільно при перемішуванні підливали 2 об'єми теплого (37 °C) 0,9 % розчину NaCl. Після центрифугування при 1500 об/хв надосад видаляли, а до осаду еритроцитів повільно при перемішуванні додавали 3 об'єми теплого (37 °C) 0,9 % розчину NaCl. Після центрифугування при 1500 об/хв надосад видаляли, а осад 1 UA 95947 U 5 10 15 20 еритроцитів 1:1 змішували з розчином 8В і зберігали при 4 °C. Результати наведені у порівнянні з найближчим аналогом в таблиці 1. З таблиці 1 видно, що збереженість еритроцитів після кріоконсервування заявлюваним способом не нижче, ніж в найближчому аналозі. Приклад 2 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що ПЕГ-1500 в кріоконсерванті брали в різних концентраціях: 15, 20 і 25 %. Результати наведені в таблиці 2. З таблиці 2 випливає, що зниження концентрації ПЕГ-1500 до 15 % не призводить до зміни ступеню гемолізу, проте збільшуються загальні втрати клітин. Збільшення концентрації до 25 % не призводить до поліпшення результатів збереженості, тому застосування більш високої концентрації ПЕГ-1500 недоцільно. Приклад 3 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що 1,2-ПД в кріоконсерванті брали в різних концентраціях: 12, 16 і 20 %. Результати наведені в таблиці 3. Дані таблиці 3 показують, що при зниженні концентрації 1,2-ПД до 12 % зростають загальні втрати і гемоліз. При збільшенні концентрації 1,2-ПД до 20 % також збільшуються загальні втрати і гемоліз. Приклад 4 Спосіб здійснювали аналогічно прикладу 1, за винятком того, що еритроцити зберігали в рідкому азоті протягом 3-х місяців. Результати наведені в таблиці 4 у порівнянні з найближчим аналогом. З таблиці 4 видно, що збереженість еритроцитів після кріоконсервування заявлюваним способом не нижче, ніж в найближчому аналозі. Таблиця 1 Збереженість еритроцитів після кріоконсервування. Спосіб кріоконсервування Найближчий аналог Заявлюваний 7,2±0,4 6,3±0,5 1,1±0,1 1,2±0,2 Показники Загальні втрати, % Гемоліз у розчині 8В протягом 24 годин, % 25 Таблиця 2 Збереженість еритроцитів у залежності від концентрації ПЕГ-1500 концентрація ПЕГ-1500, % 15 20 25 13,5±1,5 % 6,3±0,5 6,5±1,6 % 1,3±0,2 % 1,2±0,2 1,5±0,3 %. Показники Загальні втрати, % Гемоліз у розчині 8В протягом 24 годин, % Таблиця 3 Збереженість еритроцитів у залежності від концентрації 1,2-ПД концентрація 1,2-ПД, % 12 16 20 14±2 % 6,3±0,5 16±2 % 1,5±0,3 % 1,2±0,2 2,5±0,5 % Показники Загальні втрати, % Гемоліз у розчині 8В протягом 24 годин, % Таблиця 4 Збереженість еритроцитів після 3 місяців зберігання Спосіб кріоконсервування Найближчий аналог Заявлюваний 10,9±1,6 8,0±1,4 0,8±0,2 1,2±0,2 Показники Загальні втрати, % Гемоліз у розчині 8В протягом 24 годин, % 2 UA 95947 U Джерела інформації: 1. Аграненко В.А., Федорова Л.И. Замороженная кровь и ее клиническое применение. М.: Медицина. - 1983. - С. 37. 2, Патент України № 12355, A01N1/02, 1997 р. Спосіб консервування еритроцитів. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб кріоконсервування еритроцитів, що включає заморожування клітин до -196 °C в кріоконсерванті, що містить кріопротектор 1,2-пропандіол (1,2-ПД), NaCl і воду дистильовану, відігрівання на водяній бані і відмивання клітин від кріоконсерванту, який відрізняється тим, що в кріоконсервант додатково вводять кріопротектор ПЕГ-1500 в концентрації 20 %, 1,2-ПД беруть в концентрації 16 %, а відмивання клітин здійснюють ізотонічним розчином NaCl. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3