Спосіб визначення ступеня стеатозу в біоптатах печінки

Реферат: Спосіб визначення ступеня стеатозу в біоптатах печінки, шляхом проведення патоморфологічного дослідження з подальшим морфометричним визначенням поширеності стеатозу. За допомогою програми ImageJ здійснюють сегментацію зображення та переведення його в двокольорове (бінарне), розрахунок стеатозу проводять за допомогою одного із кольорів (білого або чорного) на всю часточку печінки, яка від самого початку приймається за 100 %. Отримані дані переводять із піксельної системи у відсотки, та оцінюють за градацією Е.М. Brunt та D.E. Kleiner. UA 112148 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ СТУПЕНЯ СТЕАТОЗУ В БІОПТАТАХ ПЕЧІНКИ UA 112148 U UA 112148 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до патологічної анатомії, хірургії та гепатології, і може бути використана для швидкого визначення ступеня стеатозу печінки. Існує декілька способів визначення ступеня стеатозу печінки в гістологічних зрізах, але вони недостатньо інформативні за рахунок напівкількісного підрахунку, вони трудомісткі, потребують значної кількості часу, наявності спеціального лабораторного обладнання та вимагають значних фінансових витрат. Найбільш близьким аналогом за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у морфометричній оцінці показників стеатозу шляхом морфологічного дослідження біоптату печінки, запропонований Інститутом епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України та Луганського державного медичного університету (ЛДМУ) Пат. № 37349 Україна, МПК (2006) А61В 10/00. Спосіб оцінки стеатозу печінки у хворих на хронічну патологію печінки / Л.Л. Пінський, Л.Л. Громашевська, В.М. Фролов, О.С. Решетнікова, О.В. Зінченко, В.В. Овчаренко, Т.М. Овчаренко, Ю.А. Сущенко. - № u200807721; заяв.: 06.06.2008; обупл. 25.11.2008, Бюл. № 22. Спосіб включає: 1. Морфологічне дослідження біоптату печінки. 2. Морфометричне дослідження біоптату печінки з використанням спеціалізованого пакета прикладних програм "Morpholog", визначення питомої площі відкладення ліпідних гранул в гістологічних зрізах печінки, кількості гепатоцитів в обстеженій ланці часточок та середньої площі ліпідних гранул на один гепатоцит. 3. Морфометричні дослідження проводять в трьох зонах часточок: центролобулярна, проміжна і портальна. 4. Отримані результати експортують в програму Excel, статистичну обробку матеріалів проводять за допомогою програми Statistica 6. Спільними суттєвими ознаками найближчого аналога і запропонованої корисної моделі є проведення: 1. Патоморфологічного дослідження біоптатів печінки. 2. Морфометричне визначення поширеності стеатозу печінки. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що запропонований авторами метод є трудомістким, рутинним, вимагає витрат великої кількості часу для обчислень. Розподіл печінкової часточки на три зони завжди є умовним, особливо це стосується проміжної зони, яка не має чітких меж та може призвести до похибки в розрахунку кількості гепатоцитів на відносну площу досліджуваної ланки часточки. Розрахунок середньої площі ліпідних гранул на один гепатоцит не завжди можливий та є рутинним процесом, особливо при мікровезикулярному стеатозі. Запропонована морфометрична програма для обчислень індивідуальна, та недоступна для широкого використання. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу визначення ступеня стеатозу в біоптатах печінки шляхом зміни морфометричної оцінки біопсійного матеріалу, що забезпечить швидкість аналізу зображень, більш точну діагностику ступеня стеатозу в біопсійному матеріалі печінки, що важливо для визначення прогнозу, перебігу хвороби та подальшого вибору лікувальної тактики. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення ступеня стеатозу в біоптатах печінки, що включає проведення патоморфологічного дослідження з подальшим морфометричним визначенням поширеності стеатозу, згідно з корисною моделлю, за допомогою програми ImageJ здійснюють сегментацію зображення та переведення його в двокольорове (бінарне), розрахунок стеатозу проводять за допомогою одного із кольорів (білого або чорного) на всю часточку печінки, яка від самого початку приймається за 100 %, отримані дані переводять із піксельної системи у відсотки, та оцінюють за градацією Е.М. Brunt та D.E. Kleiner. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому: Використання поширеної медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ дозволяє виконувати морфометричні дослідження без застосування спеціального лабораторного обладнання та необхідності у дорогому устаткуванні. Кількісне визначення площі порожнин ліпідних крапель дозволяє математично, а не орієнтовно встановити площу та ступінь стеатозу печінки в біопсійному матеріалі в кожному окремому випадку. Обчислення площі стеатозу здійснюють на загальну площу часточки, без поділу її на зони, що найбільш прийнято для малої кількості біопсійного матеріалу, автоматично програма рахує площу стеатозу як в гепатоцитах, так і в окремих зонах одночасно, що значно скорочує час вимірювання. 1 UA 112148 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Сегментація зображення здійснюється шляхом переводу його в чорно-біле, що не може призвести до хибно-позитивного результату, та дає змогу використовувати зображення будьякої якості, не знижуючи достовірність дослідження. Виділення бінарних кольорів підкреслює площу стеатозу, та відокремлює зайві гістологічні структури у зрізах. Завдяки наявності макрокоманд (Macros) в програмі ImageJ можливо записувати програмний алгоритм дій певного дослідження і мінімізувати його до натискання однієї клавіші, тим самим скоротити час дослідження цифрових зображень до 1 хв., що дозволяє досліджувати велику кількість матеріалу та позбавити від рутинних дій дослідника при збереженні високої достовірності. Пропонований спосіб ілюструється мікрофотографіями, де на Фіг. 1 вихідне зображення, а на Фіг. 2 бінарне зображення. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних впливів дозволить підвищити ефективність та специфічність способу. Спосіб здійснюють таким чином: 1. Патогістологічне дослідження біоптату печінки, яке проводять на стандартному пофарбованому зрізі гематоксиліном та еозином. 2. Для морфометричних вимірювань аналізували мінімум три часточки у біопсійному матеріалі, фотографували 5 полів зору в кожній часточці на збільшенні х400, де був стеатоз в тій чи іншій мірі виразності. 3. Переміщували кольорове фото в програмне вікно ImageJ. 4. В панелі інструментів ImageJ вибираємо меню Туре  RGB Stack. 5. Сегментуємо зображення за трьома колірними координатами: "Red", "Green", "Blue". Вибираємо один з варіантів, де найкраще видно досліджуваний об'єкт. Рекомендовано використовувати "Green" канал, для кращого виділення рівня яскравості цифрового зображення. 6. В панелі інструментів ImageJ вибираємо меню Analyze  Set measurements, і задаємо потрібні параметри для підрахунку (в даному випадку це: Area, Area fraction). 7. Далі переводимо цифрове зображення з чорно-білого в бінарне за допомогою панелі інструментів ImageJ меню Adjust  Threshold. 8. У гістограмі вибираємо цифрове значення яскравості в діапазоні від 0 до 255 індивідуально для кожного цифрового зображення або зупиняємося на одному значенні. 9. Виконуємо розрахунок виділених областей, завдяки меню Analyze  Measure. Якщо на цифровому зображенні є ділянки, які не вимагають підрахунку або малоінформативні, їх можна попередньо виділити за допомогою функції "Freehand selections" і вони не будуть враховані під час загального розрахунку. 10. Отримані дані порівнюють з напівкількісною градацією Е.М. Brunt та D.E. Kleiner (2005) де: менше 5 % - стеатоз відсутній, від 6 до 33 % - легкий ступінь стеатоза, від 34 до 66 % помірний ступінь стеатозу, більше 66 % - тяжкий ступінь стеатозу. Приклад 1. Хворий К., 1952 р.н., № карти 3522, був госпіталізований у Запорізьку обласну клінічну лікарню 29.05.12 р. За даними УЗД у хворого діагностовано дифузні зміни печінки з ознаками портальної гіпертензії. Попередній клінічний діагноз: Хронічний гепатит неясного ґенезу. Цироз печінки (?). 31.05.12 р. виконана трепанобіопсія печінки (3 стовпчики тканини печінки). Патогістологічний діагноз: Важкий F3 портально-септальний фіброз печінки зі слабкою лімфоцитарною інфільтрацією портальних трактів на тлі дрібно-крупнокрапельного стеатогепатиту орієнтовно 70 % печінкових часточок та нечисленними внутрішньоклітинними холестазами. Після патогістологічного дослідження було проведено морфометричний аналіз біоптату печінки. Аналізували три часточки печінки в біопсійному матеріалі, фотографували 5 полів зору на збільшенні х400, де був стеатоз в тій чи іншій мірі виразності. Далі з використанням медичної програми для аналізу та обробки цифрових зображень ImageJ в отриманих зображеннях після їх сегментування, та виділення зайвих елементів, що не входили в розрахунок (портальні тракти, судини, сполучна тканина та ін.), проводилося вимірювання співвідношення числа пікселів "чорного кольору", що в даному випадку відповідало площі стеатозу до пікселів "білого кольору", що відповідало сполучній тканині порального тракту, судинам та ін. У зображенні (Фіг. 2) в ділянках стеатозу "чорних" пікселів - 1176899, "білих" пікселів - 1795069. Всього зображення складено з 2971968 пікселів. Розрахунок відсотка стеатозу, виконують обчисленням частки від ділення числа "чорних" пікселів на загальне число пікселів в зображенні, таким чином відсоток стеатозу склав 1176899/2971968*100 % = 39,5 %. Середнє значення площі стеатозу в часточках біоптату печінки дорівнювало 37,08 %, що відповідає критеріям середнього ступеня стеатозу, та не відповідає зазначеному ступеню важкості стеатозу в патогістологічному діагнозі, 2 UA 112148 U що указує на гіпердіагностику захворювання та в подальшому може призвести до хибної тактики лікування хворого. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення ступеня стеатозу в біоптатах печінки, що включає проведення патоморфологічного дослідження з подальшим морфометричним визначенням поширеності стеатозу, який відрізняється тим, що за допомогою програми ImageJ здійснюють сегментацію зображення та переведення його в двокольорове (бінарне), розрахунок стеатозу проводять за допомогою одного із кольорів (білого або чорного) на всю часточку печінки, яка від самого початку приймається за 100 %, і отримані дані переводять із піксельної системи у відсотки, та оцінюють за градацією Е.М. Brunt та D.E. Kleiner. Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3