Спосіб визначення мінімальної інгібуючої концентрації антибіотика для лікування стафілококової інфекції

Реферат: Винахід стосується способу визначення мінімальної інгібуючої концентрації антибіотика для лікування стафілококової інфекції, який включає оцінку протимікробної активності антибіотика після додавання його до культури інфекційного збудника за стандартною схемою, причому одержаний матеріал після додавання антибіотика досліджують шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) із застосуванням праймерів 5'-GTA АСА GAT GAT TGT TGA СС-3'/5'AAG ATG AAG TGG ТАА TAG CG', розміром продукту ПЛР - 550 пар нуклеотидів; позитивний результат дослідження протестованого зразка матеріалу констатують при наявності на треку смуги утворюваного амплікону, розмір якого ідентичний відповідному розміру контрольних ампліконів; негативний результат досліджуваного зразка констатують при відсутності на треку амплікону будь-якого розміру або при наявності амплікону (чи декількох ампліконів), розмір якого відрізняється від розміру відповідних контрольних ампліконів. UA 112557 C2 (12) UA 112557 C2 UA 112557 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до медицини, а саме до фармакології, та може бути використаний для визначення мінімальної інгібуючої концентрації антибіотика для лікування стафілококової інфекції. Стафілококова інфекція є узагальненим варіантом визначення захворювань, спровокованих дією стафілококу. Відомо, що стафілококова інфекція вкрай стійка до терапії з використанням антибіотиків, що знижує ефективність лікування захворювань, викликаних стафілококовою інфекцією, обумовлює призначення високих та надвисоких доз антибіотиків, що, в свою чергу, веде до розвитку ускладнень. Переконливо доказано, що невірний вибір антибактеріального препарату та його дози погіршує вихід захворювання і є найбільш значимим незалежним фактором ризику. Тому підвищення ефективності антибіотикотерапії стафілококової інфекції є надзвичайно актуальною задачею практичної медицини. Визначення протимікробної активності лікарських засобів до штамів та біоплівок інфекційних збудників проводиться з метою вибору найбільш ефективних з них, а також для визначення найбільш адекватних доз лікарських засобів в боротьбі з цими інфекціями. Головним способом визначення адекватності вибору антибіотика є спосіб визначення in vitro чутливості до них мікроорганізмів, які викликали інфекцію [Т. Mazzei Individualization of Usage of Antimicrobials in Intensive Care Units // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. - Т. 4, № 3. - С. 288-293]. Для визначення протимікробної активності антибіотиків застосовують прямий підрахунок клітин за допомогою мікроскопії при довжині хвилі 450 нм, висів штамів та біоплівок інфекційних збудників на щільне середовище МюллераХінтона для підрахунку кількості колонієутворюючих одиниць (КУО) [Сидоренко С.В. Результаты многоцентрового исследования чувствительности стафилококка к антибиотикам /С.В. Сидоренко, С.П. Резван, С.А. Трудинская // Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - Т.43 (7). - С. 15-25]. Визначення мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) антимікробних препаратів проводять мікротитраційним способом. Антибіотик розводять методом серійних розведень середовищем м'ясо-пептоним у плоскодонних планшетах, додають до культури інфекційного агента, інкубують при 34 °C протягом 24 годин. Після цього висівають на щільне середовище Мюллера-Хінтона для визначення мінімально пригнічуючої концентрації (МПК). МПК вважається найменша концентрація, що затримує ріст інфекційного збудника протягом періоду інкубації [Сидоренко С.В. Результаты многоцентрового исследования чувствительности стафилококка к антибиотикам /С.В. Сидоренко, С.П. Резван, С.А. Трудинская // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т. 43(7). - С. 15-25]. Даний спосіб визначення мінімальної інгібуючої концентрації антибіотика для лікування стафілококової інфекції є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його вибрано за прототип. Основним недоліком відомих способів, в тому числі способу-прототипу, є його недостатня точність та достовірність. Крім того, дослідження впливу протимікробних засобів на плактонні клітини та процеси утворення стафілококових біоплівок з визначенням переважно морфологічних показників недостатньо характеризують зміни процесу життєдіяльності інфекційного агента під впливом протимікробних засобів. У зв'язку з вищевикладеним, в основу винаходу поставлено задачу підвищення точності та достовірності способу визначення протимікробної активності антибіотика та розширення арсеналу способів для цього. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі визначення мінімальної інгібуючої концентрації антибіотика для лікування стафілококової інфекції, який включає оцінку його протимікробної активності, згідно з винаходом, антибіотик додають до культури інфекційного збудника за стандартною схемою, а одержаний матеріал досліджують шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з застосуванням праймерів 5'-GTA АСА GAT GAT TGT TGA СС-3'/ 5'-AAG ATG AAG TGG TAA TAG CG', розміром продукту ПЛР 550 пар нуклеотидів; позитивний результат дослідження протестованого зразка матеріалу констатують при наявності на треку смуги утворюваного амплікону, розмір якого ідентичний відповідному розміру контрольних ампліконів; негативний результат досліджуваного зразка констатують при відсутності на треку амплікону будь-якого розміру або при наявності амплікону (чи декількох ампліконів), розмір якого відрізняється від розміру відповідних контрольних ампліконів. Технічний ефект винаходу, а саме підвищення точності та достовірності способу визначення протимікробної активності антибіотика та розширення арсеналу способів для цього, досягають тим, що мінімальну інгібуючу концентрацію антибіотика для лікування стафілококової інфекції визначають шляхом застосування ПЛР. 1 UA 112557 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Теоретичною передумовою способу слугував той факт, що у клітинах та біоплівках стафілококових агентів одним із ключових генів є ген mесА. Визначення активності даного гену у клітинах та біоплівках стафілококової інфекції під дією антибіотика можливо шляхом застосування ПЛР. Спосіб виконують наступним чином: Патогенний мікроорганізм стафілококової інфекції отримують від пацієнтів. Мікроорганізм культивують на поживному середовищі Мюлера-Хінтона. 8 Готують розведення клітин збудника стафілококової інфекції у концентрації 10 клітин/мл. Клітини у цій концентрації поміщають у кожну лунку 96-лункового планшета для імунноферментного аналізу. Планшет поміщають до термостата при температурі 37 °C на 6 годин для утворення біоплівок. Формування біоплівок визначають за методом Романова Ю.М. [Романов Ю.М. Здатність до формування біоплівок в штучних системах у різних штамів Salmonella typhimurium / Ю.М. Романов, Н.В. Алексеева, Т.Ф. Смирнова // Журнал мікробіології. - 2006. - 34. - С. 38-42]. Готують розчин досліджуваного препарату у визначеній концентрації. Наступні 11 розчинів препаратів готують у меншій концентрації: кожен наступний розчин менший за концентрацією у 10 разів. Таким чином отримують ряд з 12 розведень досліджуваного препарату. 12 лунка контрольна (досліджуваний препарат відсутній). Препарат у кожній концентрації додають до 11 лунок, що містять біоплівки стафілококу. Одну з лунок залишають без препарату як контрольну (12 лунка). Планшет поміщають до термостата та інкубують при 34 °C протягом 24 годин. Після цього культуру з біоплівок висівають на щільне середовище Мюллера-Хінтона для визначення мінімальної інгібуючої концентрації. Концентрацію клітин, що залишилася після інкубації з антимікробним препаратом у різній концентрації, визначають за ростом колоній на твердому середовищі. Мінімальну інгібуючу концентрацію визначають за межею між сусідніми лунками, у попередній з яких культура не давала росту, а у наступній ріст був. Далі культури мікроорганізмів з кожної лунки планшета з біоплівок беруть для дослідження геному. На першому етапі дослідження клітини лізують та виділяють ДНК. Отримані зразки ДНК використовують для проведення другого етапу - полімеразної ланцюгової реакції на фрагмент гена mесА. На етапі ампліфікації здійснюють багаторазове повторення циклів, які складаються з денатурації ДНК, відпалення праймерів та синтезу специфічного фрагмента ДНК - амплікону. Для проведення ПЛР на фрагмент гена mесА використовують наступні 2 праймери: 5'-GTA АСА GAT GAT TGT TGA СС-3'/ 5'-AAG ATG AAG TGG ТАА TAG CG'. Розмір продукту ПЛР - 550 пар нуклеотидів. Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК групуються у смуги відповідно до кількості основ. Найбільш практичним виявляється флуоресцентне виявлення смуг за допомогою інтерполяційного барвника - бромистого етидію, що додають до агарозного гелю та буферу. Результат оцінюють візуально за допомогою трансілюмінатора за наявністю відповідних смуг, які відповідають продуктам реакції. Контролем слугує маркер молекулярної маси від 100 до 1000 пар нуклеотидів. Третій етап реакції - електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР аналізують електрофорезом в 2 % агарозному гелі і досліджують на трансілюмінаторі при світлі довжиною 310 нм. Аналіз результатів ПЛР-детекції групо- і видоспеціфічних локусів ДНК геному стафілококів здійснюють за даними візуалізації (методом електрофорезу в агарозному гелі) утворених продуктів ампліфікації за наступними критеріями. У пробі із пробірки, що містить негативний контроль-зразок (К-) специфічна флуоресцентна смуга визначеного розміру (550 пар нуклеотидів) повинна бути відсутня. У пробі із пробірки, що містить позитивний контроль (К+) специфічна флуоресцентна смуга визначеного розміру (550 пар нуклеотидів) повинна бути присутня. Позитивний результат ПЛР дослідження протестованого зразка матеріалу констатують при наявності на треку смуги утворюваного амплікону, розмір якого ідентичний відповідному розміру контрольних ампліконів. Негативний результат ПЛР досліджуваного зразка констатують при відсутності на треку амплікону будь-якого розміру або при наявності амплікону (чи декількох ампліконів), розмір якого відрізняється від розміру відповідних контрольних ампліконів. Ефективність способу пояснює наступний приклад. Приклад. Визначали МІК антибіотику лінкоміцину та ліпосомального лінкоміцину відносно до біоплівок Staphilococcus aureus способом наявності або відсутності амлікону фрагмента гена mесА. Готували розчин досліджуваних препаратів мікротитраційним методом. Наступні 11 розчинів препаратів готували у меншій концентрації: кожен наступний розчин був меншим за концентрацією у 10 разів. Таким чином отримували ряд з 12 розведень досліджуваного препарату. 12 лунка була контрольною (досліджуваний препарат був відсутній). Препарати у кожній концентрації додавали до 11 лунок, що містили біоплівку Staphilococcus aureus. Одну з лунок залишали без препарату як контрольну (12 лунка). Планшет поміщали до 2 UA 112557 C2 5 10 15 20 25 термостата та інкубували при 34 °C протягом 24 годин. Далі з кожної біоплівки виділили ДНК та провели багаторазове збільшення концентрації її фрагмента, що містив ген mесА. Наявність ампліконів перевірили електрофорезом. Було встановлено, що мінімальна інгібуюча концентрація лінкоміцину для планктонних клітин Staphilococcus aureus є 0,9 мкг/мл, для біоплівок Staphilococcus aureus мінімальна інгібуюча концентрація - 21 мкг/мл. Для ліпосомальної форми лінкоміцину мінімальна інгібуюча концентрація для планктонних клітин Staphilococcus aureus є 0,2 мкг/мл, для біоплівок Staphilococcus aureus мінімальна інгібуюча концентрація - 3 мкг/мл. Відомо, що мінімальна інгібуюча концентрація лінкоміцину, встановлена стандартними методами, дорівнює приблизно 200-400 мкг/мл. Таким чином, даний приклад пояснює перевагу способу, який заявляється, перед відомими на сьогодні стандартними способами визначення мінімальної інгібуючої концентрації. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб визначення мінімальної інгібуючої концентрації антибіотика для лікування стафілококової інфекції, який включає оцінку протимікробної активності антибіотика після додавання його до культури інфекційного збудника за стандартною схемою, який відрізняється тим, що одержаний матеріал після додавання антибіотика досліджують шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) із застосуванням праймерів 5' GTA АСА GAT GAT TGT TGA СС-3'/5' AAG ATG AAG TGG ТАА TAG CG', розміром продукту ПЛР - 550 пар нуклеотидів; позитивний результат дослідження протестованого зразка матеріалу констатують при наявності на треку смуги утворюваного амплікону, розмір якого ідентичний відповідному розміру контрольних ампліконів; негативний результат досліджуваного зразка констатують при відсутності на треку амплікону будь-якого розміру або при наявності амплікону (чи декількох ампліконів), розмір якого відрізняється від розміру відповідних контрольних ампліконів. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3