Спосіб ліофілізації лейкоконцентрату кордової крові людини

Реферат: Спосіб ліофілізації лейкоконцентрату кордової крові людини включає охолодження зразка зі швидкістю 0,5°С/хв. до низької температури і подальше висушування. Охолодження проводять до -28 C, а висушування проводять спочатку при -28 °C протягом 10 годин, а далі при 15 C протягом 2 годин. UA 113006 U (12) UA 113006 U UA 113006 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини і може бути використана для збереження кровотворних клітин кордової крові з метою їх подальшої трансплантації. Лейкоконцентрат кордової крові (ЛККЛ) э універсальним джерелом для регенеративних і репаративних процесів в організмі. Він має високий проліферативно-диференціювальний потенціал і утворює різні типи клітин багатоклітинного організму. ЛККЛ людини вже використовується в лікуванні імунодефіцитних станів, онкологічної патології, вивчається як перспективний засіб для збільшення тривалості життя і комплексного омолодження людини. Для довгострокового зберігання ЛККЛ зазвичай використовують методи кріоконсервування з подальшим зберіганням біоматеріалу при низькій температурі, що забезпечує схоронність структурно-функціональних характеристик клітин на рівні, близькому до нативу, однак більш економічними є методи ліофілізації, які не потребують застосування хімічних консервантів, що змінюють біохімічний склад і функцію клітин. Відомий спосіб ліофілізації ЛККЛ, який включає охолодження клітин до -40 °C зі швидкістю 1-3 К/хв. протягом 3 годин і подальше висушування під вакуумом, спочатку при температурі 30 °C (37 годин), а потім при 10 °C (12 годин) [1]. Недоліком цього способу є довготривалість процесу висушування (близько 49 годин). Відомий спосіб ліофілізації ЛККЛ, в якому зразки охолоджують до -38 °C зі швидкістю 1-3 К/хв протягом 2,5 годин, а далі піддають висушуванню під вакуумом, спочатку при температурі 30 °C (31,5 годин), а потім при 15 °C (7 годин) [2]. Недоліком цього способу також є те, що процес висушування в ньому потребує великих витрат часу (близько 38,5 годин). Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб ліофілізації ЛККЛ, в якому зразки охолоджують до -10 °C зі швидкістю 0,5 °C, після чого поміщають в ємкість з рідким азотом (196°). Заморожений зразок висушують при -80 °C протягом 3,5 діб (84 години) [3]. Недоліками способу є низький вихід життєздатних клітин (18 %) і довго тривалість процесу висушування. В основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб ліофілізації ЛККЛ, в якому б, за рахунок зміни програми ліофілізації, забезпечувалась можливість підвищити вихід життєздатних клітин і скоротити час його здійснення. Поставлена задача вирішується тим, що в відомому способі ліофілізації ЛККЛ, який передбачає охолодження зразка зі швидкістю 0,5 °C/хв. до низької температури і подальше висушування, відповідно до корисної моделі, охолодження проводять до -28 °C, а висушування проводять спочатку при - 28 °C протягом 10 годин, а далі при 15 °C протягом 2 годин. Заявлена програма ліофілізації дає можливість підвищити вихід життєздатних клітин у порівнянні з прототипом у 2 рази. При цьому тривалість процесу висушування становить лише 12 годин. Спосіб здійснюють таким чином. ЛККЛ в стерильних скляних флаконах поміщають в установку для ліофілізації і охолоджують зі швидкістю 0,5 °C/хв до температури -28 °C, яка є початковою для висушування, що триває протягом 10 годин. Досушування зразків проводять при температурі 15 °C протягом 2 годин. Залишковий тиск в камері - 1,32 Па. Приклад ЛККЛ отримували шляхом седиментації еритроцитів після додавання декстрану-60 (поліглюкіну, "ОАО Біохімік, Саранськ") до кордової крові. Суспензію клітин ЛККЛ розливали по 1 мл в стерильні пеніцилінові флакони, які ставили в спеціальні металеві касети на полиці сублімаційної установки для ліофілізації УЗВ-2 при кімнатній температурі (18-22 °C). Потім зразки охолоджували протягом 30 хв. зі швидкістю 0,5° С/хв до температури -28 °C, яка була початковою для висушування, що тривало 10 годин. Досушування зразків проводили при температурі 15 °C протягом 2 годин. Залишковий тиск в камері - 1,32 Па. Після закінчення процесу висушування флакони з ліофілізованим матеріалом закривали металевими ковпачками та заливали парафіном з метою запобігання потрапляння вологи. Визначення якості ліофілізації проводили шляхом візуального огляду отриманих зразків (таблеток у флаконах) та визначення залишкової вологості в процентах загальноприйнятим ваговим методом [4]. Залишкова вологість в зразку, ліофілізованому заявленим способом і за прототипом достовірно не відрізнялася, склавши 5,03±0,51 і 4,69±0,07 %, відповідно. Концентрацію ядровмісних клітин в 1 мл суспензії ЛККЛ до і після ліофілізації підраховували в камері Горяєва [5]. Кількість життєздатних клітин визначали методом суправітального забарвлення 0,2 % водним розчином трипанового синього за допомогою світлового мікроскопа "МИКМЕД-2" ("ЛОМО", Росія). Підраховували 500 клітин у різних полях зору. Пошкоджені клітини були 1 UA 113006 U 5 10 15 забарвлені голубим кольором. Додатково життєздатність клітин оцінювали за допомогою пропідію йодиду (BD Pharmingen, USA) на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) [6]. Аналіз даних здійснювали за допомогою програми WinMDl 2.9. Результати дослідження наведені в Табл. 1, з якої видно, що після ліофілізації заявленим способом кількість життєздатних клітин ЛККЛ знижувалася на 43 % у порівнянні з нативом, в той час як в прототипі вона знижувалася на 82 % і складала 18 %. Вивчення клітинного складу ЛККЛ до і після ліофілізації проводили на мазках, фіксованих етанолом і пофарбованих азур-2 еозином по Романовському-Гімза [5]. Мікроскопію цитологічних препаратів проводили з використанням світлового мікроскопа "МИКМЕД-2". Підраховували 500 клітин, обчислюючи відсоток кожного виду клітин. Результати наведені в Табл. 2. З Таблиці 2 видно, що ліофілізація заявленим способом забезпечує збереження бластних клітин еритроїдного, мієлоїдного та лімфоцитарного типу, при цьому відмічається збільшення у порівнянні з нативними зразками кількості моноцитів, зменшення лімфоцитів, еритро- і мієлобластів, недиференційованих клітин і поява клітин в стані апоптозу (в прототипі не визначали). Таблиця 1 Кількість життєздатних клітин до і після ліофілізації Показники Життєздатні клітини (трипановий синій) Життєздатні клітини (пропідію йодид) ЛККЛ натив 95,0±2,0 % 84,0±4,0 % ЛККЛ ліофіл. 52,0±3,0 % 46,0±2,0 % Прототип Не визначали 18 % Таблиця 2 Клітинний склад зразка ЛККЛ до і після ліофілізації Показники Недиференційовані бласти Еритробласти Мієлобласти Палочкоядерні гранулоцити Сегментоядерні гранулоцити Моноцити Лімфоцити Апоптоз 20 25 30 ЛККЛ натив 12,3±0,8 12,0±1,2 8,0±0,7 1,4±0,4 4,2±1,7 3,7±0,5 58,4±0,5 ЛККЛ ліофіл. 16,3±3,0 3,3±3,0 4,0±0,7 0,7±0,І 1,3±0,7 7,0±1,7 45,0±1,8 22,3±7,7 Джерела інформації: 1. Xiao Η.-Η., Him Т.-С, Li J., Gu X.-L. et al. Freeze-drying of mononuclear cells and whole blood of human cord blood //CryoLetters. - 2004. - Vol. 25. - P. 111-120. 2. Li J., Hua T.C., Gu X.L., Ding Y. et al. Morphology study of freeze-drying mononuclear cells of human cord blood //Cryo Letters. - 2005. - Vol. 26, № 3. - P. 193-200. 3. Natan D., Nagler Α., Arav A. Freeze-drying of mononuclear cells derived from umbilical cord blood followed by colony formation //Plos One. - 2009. - Vol. 4, № 4. - P. e5240-e5252. 4. Freeze drying/lyophilization of pharmaceutical and biological products /Edited by L. Rey, J.C. May. - New York: Informa healthcare, 2010. - P. 288-313. 5. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник /под ред. В.В. Меньшикова. М: Медицина, 1987. - С. 123-124, 124-125. 6. Шторх В., Эммрах И. Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлюоресценции //Иммунологические методы /Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С. 254-268. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб ліофілізації лейкоконцентрату кордової крові людини, який включає охолодження зразка зі швидкістю 0,5 °С/хв. до низької температури і подальше висушування, який відрізняється тим, що охолодження проводять до -28 °C, а висушування проводять спочатку при -28 °C протягом 10 годин, а далі при 15 °C протягом 2 годин. 2 UA 113006 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3