Спосіб кріоконсервування еритроцитів людини

Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів людини включає заморожування клітин в кріоконсерванті, що містить кріопротектор 1,2-пропандіол, натрію хлорид і воду дистильовану, відігрів на водяній бані і відмивання клітин від кріоконсерванту. В кріоконсервант додатково вводять осмопротектор маніт в концентрації 4,5 %, 1,2-пропандіол беруть в концентрації 25 %, а натрий хлорид - в концентрації 0,27 %. UA 114838 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ЕРИТРОЦИТІВ ЛЮДИНИ UA 114838 U UA 114838 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана для зберігання еритроцитів з метою трансфузії. Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів людини в кріоконсерванті, що містить гліцерин, маніт, фосфат. Кріоконсервант додають до еритромаси у співвідношенні 1:1 і заморожують до -196 °C шляхом занурення у рідкий азот. Відігрівають на водяній бані (4042 °C), після чого 4-кратно відмивають з використанням ряду гіпертонічних розчинів [1]. Недоліком способу є те, що він включає трудомісткий процес відмивання еритроцитів від кріоконсерванту, що ускладнює його і приводить до підвищення осмотичної крихкості клітин [2]. Найближчим аналогом є спосіб кріоконсервування еритроцитів людини в кріоконсерванті, що містить 35 % 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), 10 % полівінілпіролідону (ПВП), 2 % сахарози, 0,6 % натрію хлориду (NaCl) і воду дистильовану. Кріоконсервант додають до еритромаси у співвідношенні 1:1 і заморожують спочатку до -70 °C, а далі до -196 °C шляхом занурення у рідкий азот. Відігрівають на водяній бані при 40-42 °C. Відмивають при кімнатній температурі двома гіпертонічними розчинами, що містять сорбітол і натрій хлорид [3]. Недоліком способу є те, що в ньому використовується висока концентрація проникливого кріопротектору 1,2-ПД, в зв'язку з чим необхідно відмивання розморожених еритроцитів двома гіпертонічними розчинами. Крім того, спосіб передбачає 2-етапне заморожування. Це потребує великих витрат праці і коштів (реактиви, електроенергія і т.д.). В основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб кріоконсервування еритроцитів людини, в якому б шляхом зміни складу кріоконсерванту забезпечувалась можливість спростити процеси заморожування та відмивання клітин і таким чином знизити трудомісткість способу та витрати коштів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування еритроцитів людини, який включає заморожування клітин до -196 °C в кріоконсерванті, що містить кріопротектор 1,2ПД, NaCl і воду дистильовану, відігрів на водяній бані і відмивання клітин від кріоконсерванту, згідно з корисною моделлю, в кріоконсервант додатково вводять осмопротектор маніт в концентрації 4,5 %, 1,2-ПД беруть в концентрації 25 %, NaCl - в концентрації 0,27 %. Введення до складу кріоконсерванту осмопротектору маніту дозволяє знизити концентрацію NaCl і 1,2-ПД, що забезпечує збереження осмотичної стійкості еритроцитів в ході швидкого відігрівання (40-42 °C) і дає можливість здійснювати відмивання клітин після розморожування за допомогою однокомпонентного розчину. Крім цього, застосування кріоконсерванту такого складу дає можливість здійснювати швидке заморожування еритроцитів людини в один етап, шляхом занурення у рідкий азот (-196 °C), виключаючи контроль швидкості охолодження. Спрощення процесів заморожування і відмивання еритроцитів дозволяє значно знизити витрати праці і коштів. Спосіб здійснюють таким чином. Кров центрифугують при 1500 об/хв. протягом 10 хв., видаляють надосад, а еритромасу відмивають розчином, що містить 0,9 % NaCl. До відмитої еритромаси у співвідношенні 1: 1 додають кріоконсервант, що містить 25 % 1,2-ПД, 4,5 % маніту, 0,27 % NaCl і воду дистильовану. Кріоконсервант з еритромасою перемішують, витримують 30 хв. при 25-27 °C. Отриману суспензію розливають в контейнери (125 мл), охолоджують в холодильнику до 4-6 °C і занурюють у рідкий азот (-196 °C), де зберігають до моменту використання. Відігрівання здійснюють на водяній бані при 40-42 °C. Після відігрівання еритроцити відмивають при 37 °C 0,9 % розчином NaCl. Приклад 1. До відмитих еритроцитів (60 мл) у співвідношенні 1: 1 додавали кріоконсервант, що містить 25 % 1,2-ПД, 4,5 % маніту, 0,27 % NaCl і воду дистильовану. Суспензію перемішували, витримували протягом 30 хв. при 25-27 °C і розливали в металеві контейнери, виготовлені з нержавіючої сталі, об'ємом 125 мл. Контейнери закривали фторопластовими пробками, охолоджували в холодильнику 30 хв. і занурювали у рідкий азот. Відігрівали на водяній бані при 40-42 °C протягом 5 хв. Відмивання еритроцитів здійснювали фізіологічним (0,9 %) розчином NaCl при 37 °C. Для цього до одного об'єму розмороженої суспензії на водяній бані (37 °C) при перемішуванні доливали 3 об'єма теплого (37 °C) 0,9 % розчину NaCl. Після центрифугування при 1500 об/хв. надосад видаляли, а осад еритроцитів змішували з розчином 8В (1: 1) і зберігали при 4 °C. Результати наведені в Таблиці 1 у порівнянні з прототипом. З Таблиці 1 видно, що збереженість еритроцитів після кріоконсервування заявленим способом не нижче, ніж у прототипі. Приклад 2. 1 UA 114838 U 5 10 15 Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що маніт у кріоконсерванті брали в різних концентраціях: 3,5; 4,5 і 5,5 %. Результати наведені в Таблиці 2. З Таблиці 2 видно, що оптимальною є концентрація маніту 4,5 %. Зниження концентрації до 3,5 % або підвищення до 5,5 % не призводить до збільшення ступеня гемолізу, проте збільшуються загальні втрати клітин. Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що 1,2-ПД у кріоконсерванті брали в різних концентраціях: 22, 25 і 28 %. Результати наведені в Таблиці 3. Дані Таблиці 3 показують, що при зниженні концентрації 1,2-ПД до 22 % або підвищенні до 28 % збільшуються загальні втрати клітин та ступінь гемолізу. Приклад 4. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1. Після відмивання еритроцити зберігали у рідкому азоті протягом 1 місяця. Результати наведені в Таблиці 4. З Таблиці 4 видно, що після 1 місяця зберігання еритроцитів у рідкому азоті показник гемолізу еритроцитів, кріоконсервованих заявленим способом, є на рівні такого у прототипі, а загальні втрати клітин нижче. Таким чином заявлений спосіб забезпечує високу збереженість еритроцитів при менших витратах праці і коштів. Таблиця 1 Збереженість еритроцитів після кріоконсервування Показники Загальні втрати, % Гемоліз в розчині 8В, % Спосіб кріоконсервування Прототип Заявлений 7,2±0,4 7,5±0,5 1,1±0,1 1,0±0,2 20 Таблиця 2 Збереженість еритроцитів в залежності від концентрації маніту Показники Загальні втрати, % Гемоліз в розчині 8В, % 3,5 12,5±1,5 % 1,2±0,2 % Концентрація маніту, % 4,5 7,5±0,5 1,0±0,2 5,5 8,8±1,6 % 1,4±0,3 %. Таблиця З Збереженість еритроцитів в залежності від концентрації 1,2-ПД Показники Загальні втрати, % Гемоліз в розчині 8В, % 22 10±2 % 1,2±0,2 % Концентрація 1,2-ПД, % 25 7,5±0,5 1,0±0,2 28 14±2 % 2,0±0,3 % Таблиця 4 Збереженість еритроцитів після 1 місяця зберігання у рідкому азоті Показники Загальні втрати, % Гемоліз в розчині 8В, % 25 Спосіб кріоконсервування Прототип Заявлений 10,9±1,6 8,0±1,8 0,8±0,2 1,0±0,2 Джерела інформації: 1. Аграненко В.А., Федорова Л.И. Замороженная кровь и ее клиническое применение. М.: Медицина, 1983. -С.37. 2 UA 114838 U 2. Pellerin-Mendes С, Million С.L., Marchand-Arvier M. In vitro study of the protective effect of trehalose and dextran during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen //Cryobiology. - 1997. - Vol. 35, № 2. - P. 173-186. 3. Патент України № 12355A, A01N 1/02, 1997 p. Спосіб консервування еритроцитів. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб кріоконсервування еритроцитів людини, що включає заморожування клітин до -196 °C в кріоконсерванті, що містить кріопротектор 1,2-пропандіол, натрію хлорид і воду дистильовану, відігрів на водяній бані і відмивання клітин від кріоконсерванту, який відрізняється тим, що в кріоконсервант додатково вводять осмопротектор маніт в концентрації 4,5 %, 1,2-пропандіол беруть в концентрації 25 %, а натрію хлорид - в концентрації 0,27 %. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3