Штам соматичних структур базидіомікота pleurotus ostreatus (jacq.: fr.) p. kumm. p-кл – продуцент з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів

Реферат: Штам соматичних структур базидіомікота Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. Р-кл продуцент з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів. UA 116306 U (54) ШТАМ СОМАТИЧНИХ СТРУКТУР БАЗИДІОМІКОТА PLEUROTUS OSTREATUS (JACQ.: FR.) P. KUMM. P-КЛ - ПРОДУЦЕНТ З ПІДВИЩЕНИМ РІВНЕМ ІНДУКЦІЇ СИНТЕЗУ ПРОДУКТІВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ UA 116306 U UA 116306 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана в промисловому грибівництві, екології та деструкції певних органічних відходів галузей промисловості і сільського господарства. Дереворуйнівні базидіомікотові (ксилотрофи) мають потужні екзоферментні системи, за допомогою яких поза межами клітин відбувається ефективне розщеплення лігноцелюлозного комплексу і інших складних та здебільш хімічно стійких високомолекулярних органічних речовин. Крім ензимів, процес деструкції цих сполук залежить від генерації вільних, в т.ч. перекисних ліпідних, хімічно нестабільних радикалів шляхом запуску численних спонтанних ланцюгових реакцій [2, 8]. Ці реакції носять неспецифічний характер, тому є перспективним залучення базидіомікотових ксилотрофів до процесів розкладання органічних відходів промисловості та сільського господарства, біоремедіації забруднених такими відходами середовищ [8, 10]. Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. (плеврот черепичастий, глива) - один з найпоширеніших грибів-ксилотрофів культивованих в штучних умовах, добре вивчені його культурально-морфологічні характеристики та лікарські властивості [1, 9]. Виходячи з вищезазначеного, є актуальним скринінг штамів базидіомікотових ксилотрофів продуцентів з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в культурі, які ефективно нарощують біомасу і є стійкими до негативного впливу перекисних радикалів. Відомі результати порівняльного дослідження вмісту в грибах продуктів ПОЛ. Штами ксилотрофних базидіоміцетів культивують в глибинній культурі на глюкозо-пептонному середовищі. Надаються дані щодо вмісту продуктів ПОЛ в гомогенатах міцелію і ліпідах грибів різних систематичних, екологічних і фізіологічних груп. Не надаються дані з індукції синтезу продуктів ПОЛ [2]. Відомі штами Pleurotus ostreatus, залучені до способів визначення стресового стану базидіоміцетів та екологічного стану місця їх зростання за вмістом продуктів перекисного окиснення ліпідів, що включає визначення вмісту продуктів ПОЛ, активних до тіобарбітурової кислоти в культурах грибів, причому визначення їх вмісту проводять в дикорослих плодових тілах базидіоміцетів із різних за екологічними умовами місць зростання та міцеліальних культурах цих грибів при штучному культивуванні в оптимальних умовах і при дії температурних стресорів [4]. Не надаються дані з індукції синтезу продуктів ПОЛ. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 - продуцент екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів [5]. Не досліджувалася індукція процесів ПОЛ, використовувався штам іншого виду базидіомікота. В основу корисної моделі поставлена задача отримання нового штаму соматичних структур базидіомікота Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. Р-кл, який має високий вміст продуктів ПОЛ в міцелії і культуральній рідині та здатність активно реагувати на вплив індукторів, отже є продуцентом з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Р-кл базидіомікота Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm., згідно з корисною моделлю, є продуцентом з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів в міцелії і культуральній рідині при поверхневому періодичному культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12-ти діб. Штам Pleurotus ostreatus Р-кл отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур з дикорослих плодових тіл [1]. Чисту міцеліальну культуру штаму Р-кл підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців [7]. Приклад конкретного виконання З метою вивчення динаміки росту і інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, штам Р-кл культивують поверхнево в колбах Ерленмеєра ємністю 250 мл на глюкозо3 пептонному живильному середовищі (ГПС, рН0 6,5±0,2) об'ємом 50 мл наступного складу, г/дм : глюкоза 10,0 пептон 3,0 KН2РО4 0,6 K2НРО4-; 0,4 0,5 MgSO47Н2О СаСl2 0,05 0,001 ZnSO47Н2О 3 дистильована вода до 1 дм [5]. 1 UA 116306 U 3 5 10 15 20 Інокулюмом (0,5+0,01 г/дм ) є 10-денна міцеліальна культура штаму Р-кл на сусло-агарі. Термін культивування при 27,5 °C складає 12 діб. Параметри ферментації зумовлені технологічною і економічною недоцільністю довгострокового культивування та тривалістю фази експоненціального росту штаму Р-кл. Матеріалами досліджень є гомогенізований міцелій (МГ) та культуральний фільтрат (КФ), які готують наступним чином. Міцелій при 51 °C відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування. Отриманий міцелій промивають дистильованою водою, підсушують на фільтрувальному папері, гомогенізують шляхом розтирання в охолодженій до 1±0,5 °C ступці. МГ використовують для приготування водної витяжки та визначення рівня самочинної і індукованої інтенсивності процесів ПОЛ. Залишок міцелію зважують у відкаліброваних бюксах і висушують при +105 °C до постійної маси для розрахунку його вологості і абсолютно сухої біомаси (АСБ) [6]. Для встановлення рівня самочинної інтенсивності процесів ПОЛ, до 1,5 мл водної витяжки міцелію або 0,5 мл КФ (контроль - дистильована вода) додають розчини трихлороцтової кислоти (ТХО) та тіобарбітурової кислоти (ТБК) до кінцевих концентрацій в реакційній суміші 3 0,61 та 0,37 моль/дм , відповідно. Суміш кип'ятять 15 хв. на водяній бані та швидко охолоджують до +20 °C; центрифугують 15 хв. при 1700 g. З метою визначення рівня індукованої інтенсивності процесів ПОЛ, до вказаних об'ємів водної витяжки міцелію або КФ -3 3 -2 (контроль - дистильована вода) додають 110 моль/дм розчин сірчанокислого заліза і 110 моль/л аскорбінової кислоти. Інкубацію суміші при 40 °C проводять протягом 90 хв. Екстинкцію супернатанту дослідної проби вимірюють проти контрольної на спектрофотометрі при 532 нм і 590 нм. Розрахунок самочинної ( Ac ) та індукованої ( A i ) інтенсивності ПОЛ міцелію або КФ здійснюють за формулою [6]: A c ( Ai )  25 30 (E532  E590 )  10 6  V  K 156  105  P , , 6 де: E532 і E590 - показники екстинкції; 10 - фактор розмірностей; V - об'єм реакційної 5 , суміші (мл); K - коефіцієнт перерахунку на АСБ міцелію; 156  10 - молярний коефіцієнт екстинкції; P - наважка сирого міцелію (г) або об'єм КФ (мл). Кількість продуктів ПОЛ, активних до ТБК (ТБК-АП) виражали в нмоль/г АСБ або нмоль/мл КФ. Досліди проводять у трикратній повторності. Статистичну обробку експериментальних даних проводять з використанням Microsoft Excel та пакета програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Достовірною вважається різниця за рівня вірогідності Р>0,95 [6]. Таблиця Деякі ростові та біосинтетичні характеристики штаму Pleurotus ostreatus Р-кл при культивуванні на ГПС Термін культивування, діб 9 12 35 40 АСБ, г/дм 2,18±0,13 4,87±0,16 Самочинна інтенсивність Індукована інтенсивність процесів ПОЛ процесів ПОЛ Міцелій, нмоль/ Міцелій, нмоль/ КФ, нмоль/ мл КФ, нмоль/ мл г АСБ г АСБ 35,71±2,11 4,07±0,02 100,81±2,54 7,64±0,02 97,09±4,03 10,30±0,15 287,13±6,40 15,08±0,44 Таким чином, запропонований штам Р-кл базидіомікота Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. є продуцентом з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів і може бути використаний в промисловому грибівництві, екології та технологіях деструкції певних органічних відходів галузей промисловості і сільського господарства. Це може збільшити сферу використання цього виду базидіомікота і асортимент продукції, здешевити екологічно чисте виробництво. Штам Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. Р-кл переданий та зберігається в Колекції культур шапинкових грибів (ІВК) Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, що має статус Національного надбання України [7]. Джерела інформації: 2 UA 116306 U 5 10 15 20 25 30 1. Бисько Н.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / Н.А. Бисько, А.С. Бухало, С.П. Вассер и др. - К.: Наук. думка, 1988. - 144 с. 2. Капич А.Н. Определение антиоксидантной активности на модели перекисного окисления линолевой кислоты, инициированного грибной марганец пероксидазой / А.Н. Капич, Т.В. Корнейчик // Успехи медицинской микологии. - 2007. - Т. 9. - С. 162-164. 3. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. - 2011. - Т. 3. - С. 316-335. 4. Пат. 12384 Україна, МПК A01G 7/00, А01Н 3/00.Спосіб визначення стресового стану базидіоміцетів та екологічного стану місця їх зростання за вмістом продуктів перекисного окиснення ліпідів / О.В. Федотов. - № u200504732; заявл. 20.05.2005; опубл. 15.02.2006, бюл. № 2/2006. 5. Пат. 76863 Україна, МПК C12N1/00. Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 - продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів / О.В. Чайка, О.В. Федотов. - № u201204305; заявл. 06.04.2012; опубл. 25.01.2013, бюл. № 2/2013. (прототип). 6. Федотов О.В. Інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів штамів грибів порядків Agaricales і Polyporales І О.В. Федотов // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія, екологія. - 2016. - 24(2). - С. 314-323. 7. Федотов О.В. Колекція культур шапинкових грибів - основа мікологічних досліджень та стратегії збереження біорізноманіття базидіоміцетів / О.В. Федотов, О.В. Чайка, Т.Є. Волошко, А.К. Велигодська // Вісник Донецького університету, Сер. А: Природничі науки.-2012. - № 1. - С. 209-213. 8. Pozdnyakova N.N. Influence of PAHs on ligninolytic enzymes of the fungus Pleurotus ostreatus Dl / N.N. Pozdnyakova, S.V. Nikiforova, O.V. Turkovskaya // Cent. Eur. J. Biol. - 2010. - № 5 (1). - P. 83-94. 9. Wasser S.P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms. // Appl. Microbiol. Biotechnol-2011. - 89. - P. 1323-1332. 10. Winquist E. Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi / E. Winquist, U. Moilanen, A. Mettala, M. Leisola, A. Hattaka // Biochem. Eng. J.2008.-42. - P. 128-132. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Штам соматичних структур базидіомікота Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. Р-кл продуцент з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3