Штам соматичних структур pleurotus ostreatus (jacq.: fr.) p. kumm p-208 – продуцент екзокаталаз

Реферат: Штам соматичних структур Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm P-208 - продуцент екзокаталаз що виявляє високий рівень каталазної активності культурального фільтрату при поверхневому культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12 діб. UA 74242 U (54) ШТАМ СОМАТИЧНИХ СТРУКТУР PLEUROTUS OSTREATUS (JACQ.: FR.) P. KUMM P-208 ПРОДУЦЕНТ ЕКЗОКАТАЛАЗ UA 74242 U UA 74242 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікології і біотехнології та може бути використана у грибівництві, в мікробіологічній промисловості та у науково-дослідних лабораторіях для одержання ферменту каталази на основі культивування штамів-продуцентів. Каталаза (КФ 1.11.1.6) - фермент класу оксидоредуктаз, головною функцією якого є детоксикація H2O2, а також участь у ряді окислювально-відновлювальних реакцій за участі різноманітних субстратів [4]. Висока каталітична активність та мультифункціональність зумовили широкий спектр застосування ферменту у харчовій, легкій, хімічній галузях промисловості, медицині, біосепсорних технологіях, наукових дослідженнях тощо [9]. Встановлено, що ксилотрофні базидіоміцети мають добре розвинений ферментативний апарат та здатні до синтезу, крім ферментів, і інших різноманітних біологічно активних речовин [2]. Відомий штам Р-01 макроскопічного гриба Pleurolus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., який добре плодоносить - до 53,33 кг на 100 кг повітряносухого субстрату і виявляє вміст антиокисних речовин у міцелії - 32,11±1,69 % і плодових тілах - 32,15±3,61 % на живильних середовищах, що складаються з дешевих та доступних компонентів, наприклад зволоженого лушпиння соняшника. Нe наводяться дані про каталазну активність (КА) штаму Р-01 [7]. Відомий штам F-vv зимового опенька (Flammulina velutipes (Curl.: Fr.) Sing.), який має вміст антиокисних речовин як у міцелії, що дорівнює 76,47±3,56 %; так і в плодових тілах, що дорівнює 58,54±4,21 % в ніжках і 78,33±6,69 % в шапинках на живильних середовищах, що складаються з дешевих та доступних компонентів, наприклад зволоженого лушпиння соняшника. Як і в попередньому винаході, не наводяться дані з каталазної активності інтродукованого штаму [8]. Найбільш близький за технічною суттю і результатом, що досягається, є штам F-203 соматичних структур їстівного базидіоміцету Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. продуцент плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями та екзо- і ендопероксидаз. Не зважаючи на те, що в винаході досліджено активність антиокисного ферменту - пероксидази, пов'язану з нею каталазну активність штаму F-203 не визначали [5]. В основу корисної моделі поставлено задачу отримання нового штаму базидіального дереворуйнівного гриба Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm., який відрізняється від прототипу підвищеною здатністю до біосинтезу екзокаталаз. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Р-208 гриба Pleurolus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm., згідно з корисною моделлю, виявляє високий рівень каталазної активності культурального фільтрату при поверхневому культивуванні на глюкозо-пентонному середовищі при 27,5 °C протягом 12 діб. Отриманий штам Р-208 макроскопічного гриба Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. має наступні характеристики. Штам Р-208 Pleurotus ostreatus отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур базидіоміцетів з дикорослих плодових тіл [1, 3], що були зібрані на деревині ушкодженого листяного дерева Populus bolleana Lauche.- тополя Болле в м. Донецьку у 2006 році. Чисту міцеліальну культуру штаму Р-208 підтримують шляхом пересівів кожні 5-6 місяців на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу). Культурально-морфологічні ознаки. Штам Р-208 досліджували на сусло-агарі та рідкому глюкозо-пептонному живильних середовищах. На сусло-агарі у чашках Петрі міцелій розповсюджується рівномірно. Субстратні і повітряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвинуті повітряні гіфи. Колонія гриба мас круглу форму, більш щільна в центрі, з добовими кільцями приросту. Колір колонії сніжно-білий, з віком, на 10-25 добу, забарвлюється до світло-сірого, починаючи з центра колонії. Субстрат не забарвлює. Текстура міцелію бавовняна, вовняна, висота повітряних гіф становить близько 1-2 мм. На застосованих для культивування живильних середовищах, колонія мас специфічний грибний запах. По мірі появи багаточисельних пряжок і тяжів, починають формуватися примордії. Спостерігали утворення примордій без подальшого плодоношення і на рідких живильних середовищах. Плодові тіла утворює на агаризованих живильних середовищах як у пробірках, так і в чашках Петрі ближче до краю колонії. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження дихотомічне, тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стійки і багаточисельні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях появи пряжок, так і між клітинами без пряжок. Стінки незабарвлені, їх апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. З часом, в віці 5 діб і більше, в клітинах міцелію з'являються вакуолі та жирові 1 UA 74242 U 5 10 15 20 25 30 35 40 включення. Формування примордіїв сіруватого кольору супроводжується забарвленням міцелію до сіруватих відтінків, особливо повітряних гіф. Фізіолого-біохімічні ознаки. Відношення до джерел вуглецевого живлення. Вивчався вплив різних джерел вуглецю на ріст і біосинтез біологічно активних речовин штамом Р-208 Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. Встановлено, що утилізація моно-, ді- та полісахаридів протікає з різною швидкістю. Найвище накопичення біомаси спостерігається при вирощуванні штаму Р-208 на рідкому глюкозо-пептонному середовищі, яке як вуглецеве живлення містило глюкозу або дульцит, дуже повільний ріст та біосинтез оксидоредуктаз на середовищі з інозитом. Високий рівень каталазної активності міцелію і культурального фільтрату (КФ) відмічається в віці 12 діб при культивуванні штаму на живильному середовищі, яке містило глюкозу. Приклад конкретного виконання 1. В цьому прикладі описується визначення динаміки росту та КА міцелію і культурального фільтрату штаму Pleurotus ostreatus P-208. Для визначення динаміки росту та КА, штам Р-208 культивують поверхнево в колбах Ерленмейєра ємністю 250 мл на глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) об'ємом 50 мл протягом 12 діб при 27,5 °C. Готують ГПС наступного складу, г/л [6]: глюкоза 10,0; пептон 3,0; КН2РО4 0,6; К2НРО4 0,4; 0,5; MgSO4  7H2О СаСl2 0,05; 0,001; ZnSO4  7H2O до 1 дистильована вода літра. Співвідношення C:N дорівнює 13:1. рН становить 6,5±0,2. Як інокулюм використовують 10-ти денні міцеліальні культури штаму Р-208 на сусло-агарі. Строк та температуру ферментації вибрано виходячи з результатів попередніх досліджень, в яких виявлено, що максимуми КА припадають на період експоненціального росту культури при 27,5 °C. Вибраний термін росту також пояснюється недоцільністю довгострокового культивування продуцентів. Визначення ферментативної активності у міцелії (на одиницю маси, г) проводять на 6-ту, 9ту та 12-ту добу культивування. Матеріалами для досліджень є гомогенізований міцелій (МГ) та культуральний фільтрат (КФ), які готують наступним чином. Міцелій при 5±1 °C відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування. Біомасу міцелію визначають ваговим методом [3]. Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 1±0,5 °C. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання у стерильній ступці. Каталазну активність у водній витяжці гомогенату міцелію визначають за методом, який заснований на здатності пероксиду водню утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс. Інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі СФ-26, при довжині хвилі 410 нм супроти нульової проби з дистильованою водою. Каталазну активність розраховують за формулою [6|: Е = (Ак - Ад)  V  t  k  p (мкат/ л), де: Е - активність каталази (мкат/ л), Aк та Ад - екстинкція контрольної та дослідної проб, V об'єм проби, що вносили (0,1 мл), t - час інкубації (600 с), k - коефіцієнт мілімолярної екстинкції 3 -1 -1 пероксиду водню, що дорівнює 22,2  10 мМ  см , р - коефіцієнт розведення. Дослідження проводять у трикратній повторності. Статистичну обробку проводять з використанням програм статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Дані щодо росту та каталазної активності нативного міцелію і культурального фільтрату штаму Pleurotus ostreatus Р-208 надані у таблиці. 2 UA 74242 U Таблиця Динаміка росту та каталазної активності міцелію і культурального фільтрату штаму Pleurotus ostreatus P-208 Термін культивування, діб 6 9 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Біомаса, г/л 1,10±0,02 3,13±0,05 4,63±0,05 КА, мкат/ г Міцелій КФ 26,64±0,05 122,46±0,09 59,94±0,08 352,98±0,14 112,81±0,11 639,16±0,16 Вивчення динаміки росту та КА міцелію штаму Pleurotus ostreatus P-208 показало, що дослідний штам додає біомасу протягом всього терміну ферментації та досягає максимуму її накопичення на 12 добу культивування. Встановлено, що каталазна активність вірогідно не залежить від рівня накопичення біомаси та досягає максимуму наприкінці терміну культивування. Максимуми накопичення біомаси і КА співпадають за терміном культивування. КА КФ та міцелію мають пряму кореляцію, а рівень каталазної активності КФ більше як в 5,6 разів перевищує цей показник міцелію. Зазначимо, що каталазна активність сироватки крові тварин - одного з джерел промислового отримання ферменту каталази складає від 16,8 до 166,6 мкат/л [7]. Таким чином, запропонований штам Р-208 їстівного базидіального гриба Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. є високоактивним продуцентом екзокаталаз, що спрощує і здешевлює виділення цього ферменту, та може бути використаний у біотехнології отримання ферменту каталази екзогенного походження. Штам Р-208 Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm. зберігається в колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету та переданий для зберігання у Колекцію культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. Джерела інформації: 1. Бисько НА. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / Н.А. Бисько, А.С. Бухало, СП. Вассер и др. - Киев: Наук. думка, 1988.-144 с. 2. Бухало А.С. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивостями / А.С Бухало, Е.Ф Соломко, Н.Ю Митропольская // Укр. ботан. журн.-1996.-53, № 3. - С. 192-201. 3. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник / И.А. Дудка, С.П.Вассер, И.А. Элланская. - Киев: Наук. думка, 1982.-550 с. 4. Мирошниченко О. С. Биогенез, физиологическая роль и свойства каталазы / О.С. Мирошниченко // Биополимеры и клетка.-1992. - Т. 8, № 6. - С. 3-25. 5. Патент 3863 України. Штам F-203 соматичних структур їстівного базидіоміцету Flammulina velutipes (curl.: fr.) sing.-продуцент плодових тіл і міцелію з аптиокисними властивостями та екзоі ендопероксидаз/ Федотов О.В. Заявка № 2004032388, від 31.03.2004, кл. 7C12N 1/14, А01G 1/04, Бюл. № 12, від 15.12.2004. (прототип) 6. Патент 39243 А України. Спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів / Федотов О.В., Гавриленко Г.В. Заявка № 2000116560, від 21.11.2000, кл. 7C12N9/58, Бюл. № 5, від 15.06.2001. 7. Патент 46461 А України. Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm. P-01 - продуцента плодових тіл і міцелію з аптиокисними властивостями /Федотов О.В., Вовк Н.В. Заявка № 2001075193, від 20.07.01, кл. 7C12N1/14, А01G1/04, Бюл. №5, від 15.05.02. 8. Патент 64129 А України. Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curl.: Fr.) Sing. F-vv - продуцента плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями/ Федотов О.В., Горяшник Ю.В. Заявка № 2003020945, від 04.02.2003, кл. 7C12N1/14, A01G 1/04, Бюл. № 2, від 16.02.04. 9. Amorim A.M. The application of catalasc for the elimination of hydrogen peroxide residues after bleaching of cotton fabrics / A.M. Amorim // Annals of the Brasilian Academy of Sciens.-2002. - Vol. 74, № 3. - P. 433-436. 3 UA 74242 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Штам соматичних структур Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) P. Kumm P-208 - продуцент екзокаталаз, що виявляє високий рівень каталазної активності культурального фільтрату при поверхневому культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12 діб. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4