Штам дон 21.3 соматичних структур їстівного базидіоміцету pleurotus ostreatus (jacq:fr) kummer – продуцент плодових тіл харчового призначення та основа одержання посівного міцелію

Штам Дон 21.3 соматичних структур їстівного базидіоміцету Pleurotus ostreatus (Jacq:Fr) Kummer - продуцент плодових тіл харчового призначення та основа одержання посівного міцелію. (19) (21) u200602268 (22) 02.03.2006 (24) 15.08.2006 (46) 01.08.2006, Бюл. №8, 2006р. (72) Ткаченко Наталія Петрівна, Сичов Петро Антонович, Бандура Ірина Іванівна, Тімофеев Олексій Анатольович 3 печувати високу швидкість лінійного росту міцелію, використовувати целюлозу і лігнін соломи злакових культур, промислові викиди , бавовни, сонячне лушпиння, деревину та інші. Основний критерій плодоношення - висока врожайність плодових тіл приємних товарних і смакових якостей. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результатів є штам НК-35 (Duna) Угорських селекціонерів (Gyurco, К. Laslo). Для промислового вирощування використовують подрібнену до 2-4см солому злаків, кукурудзяні стебла та стержні початків, бавовняні відходи, лушпиння соняшника та їх суміші. Субстрат після ферментації, гідротермічної обробки, або ксеротермії вологістю 68-72% від повної вологоємкості інокулюють посівним зерновим міцелієм в розрахунку 4% від маси підготовленого субстрату. Колонізація субстрату міцелієм при 24-26 триває 15-18 діб. Примордії, а потім плодові тіла утворюються при температурі в межах 5-20 С. Перша хвиля з’являється на 21-22 добу. Оптимальна вологість повітря 85-92%, а тривалість освітлення біля 10 годин на добу. В основу корисної моделі штам Дон 21.3 поставлено завдання створення більш врожайного, стійкого до несприятливих умов гібридного штаму методами схрещування монокаріонів і дикаріонів. Поставлене завдання вирішується тим, що штам Дон 21.3 створений на основі схрещування монокаріонів штаму НК-35, монокаріонів, ізолятів О-8-04 і Т-11-04. Ці гібриди, одержані методами мон-мон схрещувань потім гібридизували з дікаріоннами Дон-140. Полігибридний штам Дон 21-3 з початку вивчено з використанням фізіологобіохімічних тестів на генетичну стабільність, а потім на врожайність в умовах промислового підприємств а по вирощуванню гливи. Штам Дон 21.3 - продуцент посівного міцелію і плодових тіл харчового та лікарського призначення одержано методом виділення в чисту культуру ізолятів О-8-04, Т-11-04, виробництва експериментальних партій зернового посівного міцелію по ТУУ02070803 водночас з наробкою міцелію штамів НК-35 (прототип), Дон 140 та Дон 104 К. На блоках з ячнєвої соломи після ксеротермії масою 2 кг кожний вирощували плодові тіла. З додержанням умов стерильності з плодових тіл виділяли монобазидіоспорові культури кожного ізоляту і штаму, котрі було обрано батьківськими парами. Схрещування здійснювали згідно методикам, викладеним в наукових працях [Н.А. Бісько, І.О. Дудки [5-16], Esser J, Eger G] та інших факторів. Культурально-морфологічні ознаки штаму Дон 21.3 вивчали з використанням методик фізіології грибів, мікро та макро метрії. Культурально-морфологічні ознаки ізолятів і штамів в інтервалах температур в межах +10 +320 16658 4 С вивчали на сусло агарі, глюкозо-картопляному агарі і агарі Чапека. При цьому визначали швидкість лінійного росту міцелію, ростові коефіцієнти, мікрометричні властивості вивчали на вітальних препаратах з використанням мікрометру окулярного гвинтового МОВ 15, об’єкт мікрометра про ходячого світла з допомогою мікроскопа Ergoval. Об’єктів 40, окуляр 15 (збільшення х 600). Макроморфологічні ознаки плодових тіл та врожайність визначали в промислових умовах на блоках з соломи ячменю після подрібнення та ксеротермічної обробки. Інтродукцію штаму здійснювали в умовах Донецької, Луганської, Одеської, Запорізької та Дніпропетровської областей України та республіки Крим. Тестування штаму по фізіолого-біохімічним властивостям здійснювали з визначенням накопичення біомаси (г/л) на середовищах в залежності від джерел вуглецевого та азотного живлення. В спеціальних серіях дослідів визначали біосинтез водорозчинних білків за їх електрофоретичною рухливістю [7, 16, 18]. Мікроморфологічні дослідження дали можливість виявити характер розгалуження гіф міцелію, довжину та товщину клітин, рухливість внутріклітинних структур, особливості анаморф. На агарізованих поживних середовищах. СА, КГА і агарі Чапека міцелій від місця внесення базидіоспори або багато спорового міцелію рівномірно поширюється радіально у чашках Петрі і лінійно в мікологічних пробірках на вітальних препаратах. Розгалуження з початку дихотомічне а з появою пряжок і анастомозів воші стають густо плетеними. Колонія розповсюджується радіально з початку за рахунок субстратних, а на другу третю добу і повітряних гіф. Колір колонії сніжно-білий, повітряні гіфи несуть на своїх апікальних закінченнях багаточисленні анаморфи у вигляді бластоконідій. Багаточисленні бластоконідії є характерною особливістю штаму Дон 21.3. Текстура міцелію бавовна, вовняна, пізніше шкіряста. Висота повітряних гіф сягає 3,5-4мм. В умовах кімнатної температури (16-48 С) і добовому розсіченому освітленні виникають примордії. Для визначення швидкості лінійного росту і ростових коефіцієнтів міцелій штамів Дон 21.3, Нк35 підтримували у чистій культурі протягом 6-8 діб. Інокулюм вносили в центр у чашках Петрі і початок агарового скосу в мікологічних пробірках. Вимірювання приростів міцелію здійснювали щодобово до повної колонізації середовища. Водночас досліджувався вплив температури на швидкість лінійного росту міцелію штамів, котрі порівнювалися між собою. Дані досліджень швидкості і ростових коефіцієнтів наведені у Таблиці 1. Швидкість лінійного росту і ростові коефіцієнти штамів гливи звичайної при температурі 27 С. 5 16658 6 Таблиця 1 Штам Дон 112 НК-35 Дон 21.3 Швидкість лінійного росту міцелію (в мм/добу) 11,6±0,25 11,4±0,31 ll,9±0,35 Ростові коефіцієнти 58,0±0,1 57,0±0,2 59,6±0,1 Із даних Таблиці 1 випливає, що штам Дон 21.3 має більш високу швидкість лінійного росту. Таблиця 2 Вплив температури на ріст міцелію штамів гливи Штами Дон 112 НК-35 Дон 21.3 +5 +8 С 1,2±0,1 1,2±0,2 1.1±0,1 Швидкість росту міцелію (мм/добу) при температурі +15 С +26 С +28 С +32 С 3,5±0,1 11,3±0,1 12,3±0,4 8,4±0,1 4,1±0,2 11,1±0,2 11,8±0,2 7,9±0,2 4,4±0,3 12,2±0,3 12,2±0,1 8,3±0,1 Отже. результати досліду свідчать про суттєвий вплив температури на швидкість лінійного росту штамів - аналога га прототипа в порівнянні зі штамом Дон 21.3. котрий заявляється як корисна модель. Температурні інтервали можна поділювати на мінімальні, оптимальні і максимальні. Швидкість росту мінімальна при температурі +5 +8 С. Швидкість росту варіює у межах 1,2±0,2-4,4±0,3мм/добу. Оптимальна температура вегетативного росту складає 26-28 С. Подальше підвищення температури до 32-35 С знижує, швидкість росту міцелію майже до рівня +5 +8 С. В умовах промислового культивування підтримка температури взимку і влітку потребує підвищення енергетичних витрат, тому доцільніше обирати відповідні штами. Універсальними штамами з високими товарними якостями є НК-35, Дон 21.3, Дон 112, Р-77 та інші. Вони забезпечують хороші товарні та смакові якості плодових тіл в інтервалі температур 12-16 С. Особливо виявився штам Дон 21.3 інтродуковано в культуру в Південній центральній, південно-східних регіонах України. Фізиолого-бioxмічнi властивості. Фізіолого-біохімічні властивості штамів і видів їстівних грибів характеризують їх відношення до різноманітних джерел вуглецевого га азотного живлення, електрофоретичною рухомістю водорозчинних білків У складі живильних середовищ в якості джерел вуглецю вивчалися глюкоза, сахароза, мальтоза, галактоза лактоза і маніт. Об’єктами цієї серії дослідів були обрані штамп Дон-140, НК-35, Дон 21.3. Глюкоза, мальтоза, лактоза і маніт забезпечували накопичення біомаси у межах 2,5-3-3,5г/л сухої речовини. Мальтоза набагато краще задовольняє речовинні і енергетичні потреби усіх штамів, але ріст штаму Дон 21-3 переважає-усі інші штами. У якості джерел азотного живлення модифіковане поживне середовище Чапека в еквівалентних по азоту кількостях вносились глютамінова і аспа +35 С 0,8±0,1 1,1±0,1 1,3±0,3 рагінова амінокислоти, сечовина, сульфат амонію, нітрат натрію і нітрат амонію. Для штаму Дон 21.3 та інших найбільш придатними джерелами азотного живлення є глютамінова і аспарагінова амінокислоти (4,2г/л). Найменш придатним джерелом азотного живлення виявилась сечовина. Накопичення біомаси в її присутності майже в двічі нижче, ніж під впливом аспарагінової, глугамінової амінокислот. Оскільки амінокислоти є дефіцитними і високо коштовними джерелами азоту, більш перспективними слід вважати нітрат і сульфат амонію. Таким чином оновлення колекції штамів гливи звичайної та інших їстівних дерево руйнівних грибів, їх селекцію га гібридизацію слід здійснювати з обов’язковим урахуванням фізіолого-біохімічних властивостей щодо створення рецептури поживних середовищ [1, 3, 4, 7, 11, 15, 16, 18]. Біосинтетичні властивості. Біосинтетичну діяльність вищих базидіальних грибів оцінюють як продуктивну здатність синтезувати низько, середньо та високо молекулярні сполуки. Мономерам, тобто вуглеводам, органічним кислотам га амінокислотам приділяють увагу для дослідів їх як продуктів експресії генів. Амінокислотний склад завжди вивчається з метою оцінки харчової належності, або можливості використання відробленого субстрату для корма свійських тварин. Об’єкт вивчення корисної моделі штам Дон 21.3 вивчався як продуцент водорозчинних білківальбумінів. Водорозчинні білки можуть бути не тільки єндо, але і екзомет абелітами тобто здібні виділятися у культуральний фільтрат. Одночасно зміна кількісного вмісту лужних або кислих амінокислот та органічних кислот істотно впливає на рН фільтрату. Можливо, що в цьому полягають механізми регуляції фізіологобіохімічних процесів на организменому рівні. Результати дослідів цього напрямку ілюструються даними Таблиці 4. 7 16658 8 Таблиця 4 Водорозчинні білки і рН середовища після культивування міцелію штамів і ізолятів на рідинному середовищі Штами і ізоляти Дон 21.3 Дон 21.4 Дон 21.5 Дон 21.7 Дон 140 Дон 112 Нк-35 К-9Р 0-8-04 Т-11-04 Вміст екзобілку в залежності від віку на15мг/мл На 30мг/мл 16,5±0,4 10±0,3 12,4± 9,8 ±0,2 12,5±0,l 8,3±0,3 12,3±0,2 9,1±0,2 15,5±0,3 9,8±0,4 13,5±0,1 9,2±0,4 17,0±0,2 10,2±0,3 12,1±0,3 8,5±0,4 10,5±0,1 8,±0,2 11,1±0,2 8,2±0,3 Дані таблиці свідчать про істотні зміни вмісту екзобілків і рН від тривалості культивування. Найвища концентрація білків культурального фільтрату спостерігається у штамів. Дон 21.3 та НК-35 на 15 добу. На 30 добу концентрації зменшуються до Контроль 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 Значення рН На 15добу 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 59 5,9 5,9 5,9 на 30 добу 6,0 6,5 6,8 6,3 6,5 6,4 6,5 7,0 7,1 7,2 10,3-8,1мг/мл. Ці результати можна розглядати як результат поглинання одних речовин та виділення в оточуюче середовище інших речовин у фізіологобіохімічних перетворень у клітинах різного віку. Таблиця 5 Відносна електрофоретична рухливість екзобілків на 15 добу ВЕР 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Дон21.5 0,043 0,120 0,198 0,310 О-8-04 0,051 0,120 0,20 Дон 21.3 0,060 0,120 0,267 Ізоляти і штами P. Ostreatus Дон 21.4 107 Дон 21.7 0,025 0,025 0,051 0,077 0,086 0,094 0,112 0,120 0,160 0,163 0,25 0,310 0,320 0,392 0,39 Одержані результати наведені у Таблиці 5. Вони підтверджують фізіологічну різноякісність ізоляту О-8-04, штамів селекції кафедри, одержаних у попередніх роках (К-99, Дон 104).Серед них К-99 0,043 0,077 0,112 0,198 0,25 0,318 Дон 104 0,068 0,129 0,215 0,370 НК-35 0,077 0,163 0,25 0,336 0,422 можна виділити штами з чотирма (Дон 21.4, Дон 21.5, Дон 104) трьома (Дон 21.3), п’ятьма (НК-35, 107) і шістьма (Дон 21.7) зонами екзобілків. Зони з рухливістю 0,025 спільні для штамів 107 і Дон 21.7; 9 16658 0,043 відповідно Дон 21.5 і К-99; 0,51-О-8-04, Дон 21.4. Білки з рухливістю 0,120 спільні для штамів Дон 21.5; О-8-04 і 107. Для кожного ізоляту і штаму є індивідуальні білки, тобто штамові-специфічні екзобілки, наприклад 0,267 у Дон 21.3; 0,39 - Дон 21.4; 0,422. Істотно нові дані виявляються на 30 добу культивування як це можна бачити із даних Таблиці 6. Найбільша кількість білкових зон з числа виділених зовні (екзобілків) виділена в природньому ізоляті О-8-04, як це випливає із Таблиці 6, а найменша у штаму Дон 21.5 - у цього гібриду кількість білкових зон на 4 менш (7), ніж ізоляту О-8-04 (11). 10 Девять зон характерні для штаму 107. У штамів Дон 21.3; Дон 21,4; і Дон 21.7 виявлено по 8 білкових зон. Подібність ізоляту О-8-04 і гібриду Дон 21.5 складає лише 5,8% О-8-04; 21.410,5%. Найбільш істотний коефіцієнт подібності у пари О-8-04-21.3. Ступень подібності тут найбільш значуща і складає 42,1%. У всіх останніх випадках ступень подібності варіює у межах - 13,3; 20; 35; 25; і 23%. Метод порівняння спільних екзобілковнх зон дозволяє підтвердити походження гібриду Дон 21.3 від дикорослих, стійких до екстремальних факторів ізолятів і НК-35. Таблиця 6 Водорозчинні білки у культуральному фільтраті гливи на 30 добу ВЄР № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 О-8-04 0,054 0,090 0,127 0.163 0,2 0,254 0,363 0,436 0,454 0,545 0,618 Дон 21.5 0,090 0,109 0,290 0,381 0,409 0,563 0,654 Штами і ізоляти Дон 21.4 Дон 21.3 0,072 0,090 0,109 0,2 0,218 0,236 0,271 0,281 0,281 0,309 0,372 0,381 0,436 0,454 0,545 0,636 По загальним для різних штамів зонами ВЕР вираховували індекси подібності (генетичної спорідненості). Підрахунки свідчать про різноманітні взаємовідносини екзобілків як продуктів експресії генів в мітохондріях. Дон 21.7 0,109 0,2 0.245 0,3 0,390 0,5 0,554 107 0,072 0,109 0,2 0.218 0,254 0,272 0,327 0,381 0,445 Впровадження селективного штаму Дон 21.3 у виробництво посівного міцелію і плодових тіл харчового призначення визначається врожайними показниками, товарними і смаковими якостями. Результати досліджень наведені у Таблиці 7. 11 16658 12 Таблиця 7 Врожайність штамів (в кг/блок) на соломі ячменю після ксеротермічної обробки (по результатам дисперсійного аналізу) 1) Вибіркова сеПоказники вибі- редня Порівняння Середніх Порівняння середніх рок № за Даннетом за Дунканом 2) врожайність у % Критичне значення 3,616±0,013 0041 1) гібрид ДонНУ 21 3 Різниця між середні2) 30% ми [3-2] Різниця між даними Критичне значення 3,070±0,015 [1-2]-0,546 різниця 0,044 2) гібрид Дюрко вірогідна Різниця між середніНК-35 Різниця між даними 2) 26% ми [3-1][1-3]-0,802 різниця вірогідна Критичне значення 3в) штам ДонНУ 0,041 2,814±0.016 Дон-112 (KB Різниця між середні1017) ми [2-1]2) 23% Дані Таблиці 7 свідчать про вірогідну різницю більш високої врожайності одержаного та інтродукованого штаму Дон 21.3 в порівнянні з аналогом і прототипом. У порівнянні зі штамом Дон 112 врожайність штаму Дон 21.3 вище на – 7%, а у порівнянні зі штамом НК-35 - на 4%. Одержаний штам Дон 21.3 відрізняється іншими важливими властивостями: добрими габітусами плодових тіл і стійкістю до деяких конкурентів за субстрат. Виявлена стійкість штаму у відношенні до пеніцилів, хетоміума, аспергилів, фузаріумів, альтернації. Товарні і споживні якості штаму полягають в наступному: 1) Зростки складаються з 15-30 плодових тіл в середньому 295-330 грамів. 2) Діаметр шапинки варіює у межах 3,5-3,8; 5,5; 12,5см. 3) Діаметр ніжки 1,5-1,8см, а її довжина 1,5-3см. Вага плодового тіла 6-19,34. М’якуш шапинки товстий, щільний, колір кутикули корічнювато-сірий, або світло сірий в залежності від умов освітлення. Штам Дон 21.3 прийнято на депонування в Колекції культур шапинкових грибів дo інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного 21.09.2005. Джерела інформації які використані при укладанні заявки 1. Авторское свидетельство СССР №1242050 «Субстрат для выращивания съедобного гриба вешенки обыкновенной» / Сычев П.А., Негруцкий С.Ф. Зубченко Л.И и др. Опубл. 07.07.1986г. Бюл. №5. 2. Авторское свидетельство СССР №1755735 „Штам соматических структур макроскопического гриба Pleurotus ostreatus (Jacq: Fr) Kummer” / Сычев П.А., Негруцкий С.Ф. Кипень А.Н. и др. Опубл. 23.08.1992г. Бюл №31. (Аналог). 3. Авторское свидетельство СССР №1540059 «штамм соматических структур макроскопического гриба Flammulina velutipes (Fr) Karst» для получения препарата против корневой губки хвойных пород / Сычев П.А., Фильчаков Л.П., Негруцкий Різниця між даними 0,256 Різниця вірогідна 0,802 Різниця вірогідна 0,546 Різниця вірогідна С.Ф., Ветрова Е.В. Дсп, Действие с 01.01.1999г. 4. Авторское свидетельство СССР №1490954 «Питательная середа для выращивания пениофоры гигантской / Сычев П.А., Фильчаков Л.П., Негруцкий С.Ф. Действие 01.03.1999г.» 5. Бисько Н.А, Дудка И.А. Биология и культивувание грибов рода вешенка - Киев: Наук думка 1987. - 147с. 6. А.С. Бухало, Н.Ю. Митрольская. Каталог колекції шапинкових культур (ІВК). Київ: Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного Національної Академії наук України - 2001р. - 32с. 7. Грибы и грибоводство /Сычев П. А., Ткаченко Н.П./ под Ред. П.А. Сычева. - Донецк: Сталкер, 2003г. - 512с. 8. Держпатент на винахід №28397 А Поживне середовище для селекції та гибридизації штамів гливи звичайної Pleurotus ostreatus (Jacq: Fr) Kunmer /Сичов П.А., Тімофеєв О.А., Ткаченко Н.П., Каліберда Г.В. Опубл. 16.10.2000г. Бюл. №5. 9. Деклараційний патент України №29744 А «Поживне середовище для оновлення колекції штамів гливи звичайної Pleurotus ostreatus (Jacq: Fr) Kunmer /Сичов П.А., Тімофеєв О.А., Каліберда Г.В. Опубл. 15.11.2000г. Бюл.№6.-11”. 10. Деклараційний патент України №29725 А „Живильне середовище для роботи з чистими культурами вищих базидіоміцетів” Сичов П.А., Ткаченко Н.П., Тимофеев О.А., та ін Опубл 15.11.2000, Биол №6-11. 11. Дудка И.А., Вассер С.П., Бухало А.С. и др. Промышленное культивирование съедобных грибов - Киев: Наукова думка, 1987г. - 264с. 12. Дудка И.А, Бисько Н.А., Билай В.Т. Культивирование съедобных грибов - Киев. Урожай, 1992г. - 160с. 13. Дудка И.А., Вассер С.П. Гриби: Справочник миколога и грибника- К: Наукова думка, 1987г, 535с. 14. Дудка І.О., Бісько Н.А., Цизь О.М., Мітрольська Н.Ю., Розробка наукових основ грибівни 13 16658 цтва та їх практична реалізація в аграрному комплексі України./ Материалы международной научно-практической конференции «Достижения, проблемы и перспективи культивирования грибов». Современные технологии. 29 сентября - 2 октября 2005 года г. Донецк: Норд Компьютер, с.3-6. 15. Разведение грибов. Краткое описание гибридных штаммов - Мицелий /Морозов А.Н., Тимофеев А.А. Донецк: «Сталкер» 2001г. - 42с. (Прототип). 16. Методы экспериментальной микологии справочник / Отв. Ред. В.И. Билай К. Наукова думка 1982, - 550с. 17. Рыбальский Н.Г., Вассер С.П., Дудка И.А. Патентоспособность биологических объектов Комп’ютерна верстка О. Клюкін 14 Киев: Наукова думка, 1988г, 237с. 18. Сычев П.А. Экофизиология высших грибов - Донецк: Кассіопея, 2000г - 275с. 19. Технологический регламент получения посевного мицелия (грибницы) культивируемых базидиомицегов / Сычев П.А., Тимофеев А.А., Ткаченко Н.П. -Донецк: ДонНУ, 2000г. - 24с. 20. Ericson K.E, Blanchette R.A, Ander P. Microbal and enzymatic degradation of wood und wood components. Berlin, Hedelblirg SpringierVerlag, 1990 - c.3-15. 21. Eger G Untersuchungen zur Fruchtenbildug des Kulfur champignons - Muchroom: Sci, 1992, №5, p.314-320. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601