Спосіб ліофілізації лейкоконцентрату кордової крові людини

Реферат: Спосіб ліофілізації лейкоконцентрату кордової крові людини передбачає охолодження клітин зі швидкістю 0,5 °С/хв. до -28 °С і подальше висушування, спочатку при -28 °С протягом 10 годин, а далі при 15 °С протягом 2 годин. Охолодження проводять з використанням кріопротектора 10 % гідроксіетилкрохмалю. UA 117780 U (12) UA 117780 U UA 117780 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини і може бути використана для збереження кровотворних клітин кордової крові для їх подальшої трансплантації. Лейкоконцентрат кордової крові людини (ЛККЛ) є універсальним джерелом для регенеративних і репаративних процесів в організмі. Він має високий проліферативнодиференціювальний потенціал і утворює різні типи клітин організму. ЛККЛ вже використовується в лікуванні імунодефіцитних станів, онкологічної патології, вивчається як перспективний засіб для збільшення тривалості життя і комплексного омолодження людини. Для довгострокового зберігання ЛККЛ часто використовують методи ліофілізації, які забезпечують можливість зберігання клітин без застосування рідкого азоту. Більшість ушкоджень, які можуть відбуватися при ліофілізації, спостерігаються на етапі заморожування зразка, тому для захисту клітин від пошкоджуючої дії низьких температур використовують кріопротектори. Методи ліофілізації виключають можливість відмивання клітин від кріопротектору, тому основними вимогами до кріопротектору при ліофілізації є відсутність токсичних і алергенних властивостей. Відомий спосіб ліофілізації ЛККЛ під захистом полівінілпірамідону з додаванням маннітолу і сахарози, який включає охолодження клітин до -40 °C зі швидкістю 1-3 К/хв. протягом 3 годин і подальше висушування під вакумом, спочатку при температурі 30 °C (37 годин), а потім при 10 °C (12 годин) [1]. Недоліками цього способу є довготривалість процесу висушування (близько 49 годин) і те, що полівінілпірралідон проявляє в організмі алергенні властивості [2]. Відомий спосіб ліофілізації ЛККЛ під захистом епігаллокатехіну галлату, в якому зразки охолоджують до -10 °C зі швидкістю 0,5 °C, після чого поміщають в ємність з рідким азотом (196°). Заморожений зразок висушують при -80 °C протягом 3,5 діб (84 годин) [3]. Недоліками способу є довготривалість процесу висушування, а використання епігаллокатехіну галлату пов'язано зі значними фінансовими витратами. Найбільш близьким аналогом до способу, що заявляється, є спосіб ліофілізації ЛККЛ, в якому клітини охолоджують без кріопротектору зі швидкістю 0,5 °C/хв… до -28 °C з подальшим висушуванням спочатку при -28 °C протягом 10 годин, а потім при 15 °C протягом 2 годин [4]. Недоліками способу є відносно низький вихід життєздатних клітин (46,0±2,0 %) в результаті їх пошкодження на етапі охолодження. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб ліофілізації ЛККЛ, шляхом використання нетоксичного кріопротектору, що дозволить зменшити пошкодження клітин і таким чином підвищити вихід життєздатних клітин. Поставлена задача вирішується тим, що в відомому способі ліофілізації ЛККЛ, який передбачає охолодження клітин зі швидкістю 0,5 °C/хв… до -28 °C і подальше висушування, спочатку при -28 °C протягом 10 годин, а далі при 15 °C протягом 2 годин, згідно з корисною моделлю, охолодження проводять з використанням кріопротектору 10 % гідроксіетилкрохмалю. Гідроксіетилкрохмаль є природним, нетоксичним кріопротектором [5]. Використання цього кріопротектору для ліофілізації дає можливість підвищити вихід життєздатних клітин у порівнянні з прототипом на 4-5 %. Спосіб здійснюють таким чином. До ЛККЛ додають 10 % гідроксіетил крохмаль (ГеК-Інфузія р-н д інф. 10 % "ЗАТІнфузія") до кінцевої концентрації 5 %. Після цього клітини в стерильних скляних флаконах поміщають в установку для ліофілізації і охолоджують зі швидкістю 0,5 °C/хв… до температури -28 °C, яка є початковою для висушування, що триває протягом 10 годин. Досушування зразків проводять при температурі 15 °C протягом 2-х годин. Залишковий тиск в камері - 1,32 Па. Приклад ЛККЛ отримували шляхом седиментації еритроцитів після додавання декстрану-60 (поліглюкіну, "ОАО Біохімік, Саранськ") до кордової крові. До суспензії ЛККЛ додавали 10 % гідроксіетилкрохмалю у співвідношенні 1:1 і проводили експозицію на протязі 10 хв. Отриману суспензію клітин ЛККЛ розливали по 1 мл в стерильні пеніцилінові флакони. Флакони поміщали в спеціальні металеві касети на полиці установки для ліофілізації УЗВ-2 при кімнатній температурі (18-22 °C). Потім зразки охолоджували зі швидкістю 0,5 °C/хв… до температури 28 °C, якабула початковою для висушування, що тривало 10 годин. Досушування зразків проводили при температурі 15 °C протягом 2-х годин. Залишковий тиск в камері - 1,32 Па. Після закінчення процесу висушування флакони з ліофілізованим матеріалом закривали гумовими пробками, завальцовували металевими кришками і заливали парафіном з метою запобігання потрапляння вологи. Визначення якості ліофілізації проводили шляхом візуального огляду отриманих зразків (таблеток у флаконах) та визначення залишкової вологості в процентах загальноприйнятим 1 UA 117780 U 5 10 15 20 ваговим методом [6]. Залишкова вологість в зразку, ліофілізованому заявленим способом, склала 5,03±0,51 %. Концентрацію ядровмісних клітин в 1 мл суспензії ЛККЛ до і після ліофілізації підраховували в камері Горяєва [7]. Після ліофілізації достовірних змін ядромісних клітин по відношенню до нативу не спостерігали. Кількість життєздатних клітин визначали за допомогою світлового мікроскопа "МИКМЕД-2" ("ЛОМО", Росія) методом суправітального забарвлення 0,2 % водним розчином трипанового синього, що є індикатором пошкодження клітинної мембрани. Підраховували 500 клітин у різних полях зору, виражаючи в процентах. Пошкоджені клітини були забарвлені голубим кольором. Додатково життєздатність клітин оцінювали на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) за допомогою пропідія йодиду (BD Pharmingen, USA), що є маркером нуклеїнових кислот [8]. Аналіз даних здійснювали за допомогою програми WinMDI 2.9. Результати дослідження наведені в Табл.1, з якої видно, що після ліофілізації заявленим способом кількість життєздатних клітин ЛККЛ, яка визначалася по трипановому синьому, була вище ніж в прототипі на 7 %, а та що визначалася за пропідієм йодидом - на 4 %. Вивчення клітинного складу ЛККЛ до і після ліофілізації проводили на мазках, забарвлених азур-2 еозином по Романовському-Гімза [7]. Мікроскопію цитологічних препаратів проводили з використанням світлового мікроскопа "МИКМЕД-2". Підраховували 500 клітин, обчислюючи відсоток кожного виду клітин. З Таблиці 2 видно, що ліофілізація заявленим способом, як і в прототипі, забезпечує збереження бластних клітин еритроїдного, мієлоїдного та лімфоцитарного типу, і знижує кількість клітин у стані апоптозу у порівнянні з прототипом. Таблиця 1 Кількість життєздатних клітин ЛККЛ до і після ліофілізації Показники Натив Загальна кількість клітин, кл/мл Кількість життєздатних клітини (трипановий синій), % Кількість життєздатних клітин (пропідій йодид), % 1,8±0,410 7 Спосіб ліофілізації Заявлений Аналог 7 7 1,5±0,210 1,3±0,410 95,0±2,0 59,0±2,0 52,0±3,0 84,0±4,0 50,0±1,0 46,0±2,0 Таблиця 2 Клітинний склад ЛККЛ до і після ліофілізації Показники Недиференційовані бласти, % Еритробласти, % Мієлобласти, % Палочкоядерні гранулоцити, % Сегментоядерні гранулоцити, % Моноцити, % Лімфоцити, % Клітини у стані апоптозу, % Натив 12,3±0,8 12,0±1,2 8,0±0,7 1,4±0,4 4,2±1,7 3,7±0,5 58,4±0,5 Спосіб ліофілізації Заявлений Аналог 17,2±3,0 16,3±3,0 5,1±3,0 3,3±3,0 4,7±0,7 4,0±0,7 0,5±0,1 0,7±0,1 1,6±0,7 1,3±0,7 5,0±1,7 7,0±1,7 50,0±1,8 45,0±1,8 16,3±7,7 22,3±7,7 25 30 35 Джерела інофрмації: 1. Xiao Н.-Н., Hua Т.-С, Li J., Gu X.-L. et al. Freeze-drying of mononuclear cells and whole blood of human cord blood // CryoLetters. -2004.-Vol. 25.-P. 111-120. 2. Gorskaya U.F., Danilova T.A., Mezentzeva M.V., Shapoval M.M., Nesterenko V.G. Effect of immunization with polyvinylpyrrolidone on the counts of stromal precursor cells in bone marrow and spleen of CBA and CBA/N mice and cytokine gene expression in primary cultures of these cells // Bull. Exp. Biol. Med. - 2012. - Vol.153, №1. - P.64-67. 3. Natan D., Nagler A., Arav A. Freeze-drying of mononuclear cells derived from umbilical cord blood followed by colony formation // Plos One. - 2009. - Vol. 4, № 4. - P. e5240-e5252. 4. Заявка України №u201606081, пр. 06.06.2016, МПК A01N1/02 (прототип). 2 UA 117780 U 5 5. Vassal О., Del Carmine P., Beuriat P.-A. et al. Neurotoxicity of intrathecal 6 % hydroxyethyl starch 130/0.4 injection in a rat model // Anaesthesia.-2015.-№70.-P. 1045-1051. 6. Freeze drying/lyophilization of pharmaceutical and biological products / Edited by L. Rey, J.C. May. - New York: Informa healthcare, 2010. -P.288-313. 7. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / под ред. В.В. Меньшикова.М.: Медицина, 1987. - С. 123-125. 8. Шторх В., Эммрах И. Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлюоресценции // Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С. 254-268. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб ліофілізації лейкоконцентрату кордової крові людини, який включає охолодження клітин зі швидкістю 0,5 °С/хв. до -28 °С і подальше висушування, спочатку при -28 °С протягом 10 годин, а далі при 15 °С протягом 2 годин, який відрізняється тим, що охолодження проводять з використанням кріопротектора 10 % гідроксіетилкрохмалю. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3