Сухе живильне середовище для культивування мікобактерій

Реферат: Сухе живильне середовище містить магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, калій фосфорнокислий однозаміщений, гліцерин, яєчну масу, 2 % водний розчин малахітового зеленого та воду. Додатково містить амінооцтову кислоту (глікокол). UA 121606 U (54) СУХЕ ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКОБАКТЕРІЙ UA 121606 U UA 121606 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології і стосується одержання живильних середовищ для виділення культур мікобактерій із патологічного матеріалу. Існує живильне середовище Лєвенштейна-Йєнсена, що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сульфат, натрію нітрат, L-аспарагін, гліцерин, яєчну масу та малахітовий зелений [Настанова по діагностиці туберкульозу тварин та птиці. 1994 p.]. Відоме також середовище "Нове" для культивування мікобактерій туберкульозу, що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, глікокол, квасці залазоаміачні, гліцерин, яєчну масу, малахітовий зелений і воду [Зб. наук. пр. ВНДІТЖ Омськ, 1988]. Недоліками зазначених середовищ є недостатня їх елективність і висока собівартість. Найближчим аналогом є середовище "Фінн-2", яке містить магній сульфат, натрію цитрат, галуни залізоаміачні, калій фосфат однозаміщений, амоній цитрат однозаміщений, натрію глутамінат однозаміщений, гліцерин, яєчну масу та 2 % водний розчин малахітового зеленого та воду. [У кн. Туберкульоз сільськогосподарських тварин. М.В. О. "Агропромвидав", 1991]. Суттєвим недоліком середовища "Фінн-2" є висока ціна компонентів, що входять до його складу. Так, до складу цього середовища входить імпортний компонент - натрію глутамінат. При висіві проб із об'єктів зовнішнього середовища у 0,5 % випадків спостерігається ріст неспецифічної мікрофлори, що призводить до порушення цілісності середовища та погіршення результатів бактеріологічних досліджень. В основу корисної моделі поставлена задача розробити сухе живильне середовище, що містить магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, калій фосфорнокислий однозаміщений, гліцерин, яєчну масу, 2 % водний розчин малахітового зеленого та воду шляхом вилучення зі складу середовища галунів залізо-аміачних, амонію цитрату однозаміщеного, глутамінату натрію, та введення до складу живильного середовища амінооцтової кислоти (глікоколу), при наступному співвідношенні компонентів: калій фосфорнокислий однозаміщений 1,54-1,80 г/л магній сірчанокислий 0,15-0,25 г/л натрій лимоннокислий 0,38-0,45 г/л глікокол 5,0-7,0 г/л гліцерин 6,0-8,0 г/л 3 яєчна маса 670,0-750,0 см 2 % водний розчин 3 малахітового зеленого 15,0-20,0 см вода дистильована до рН 3 7,0-7,2 1000,0 см . Аналіз відомих щільних живильних середовищ для культивування і виділення мікобактерій показав, що введення до складу середовища глікоколу застосовується у відомих синтетичних середовищах. Однак використання їх у цих середовищах у поєднанні з іншими компонентами не забезпечує середовищам таких властивостей, які вони проявляють у запропонованому рішенні, а саме покращення ростових властивостей у епізоотичних культур мікобактерій при виключенні зі складу компонента - натрію глутамінового. Порівняльний аналіз запропонованого сухого живильного середовища та аналога показує, що даний склад живильного середовища відрізняється від відомого введенням нового компоненту, а саме глікоколу. Сухе живильне середовище готують таким чином: Наважки солей розчиняють у дистильованій воді за зазначеною послідовністю, потім додають гліцерин, змішують і підлуговують аміаком до рН 7,0-7,2, фільтрують через паперовий фільтр, розливають у флакони та автоклавують за 1,5 атм впродовж 30-ти хвилин. Виготовлений сольовий розчин зберігають за 4 °C не більше 14-ти діб. Яєчну масу готують із свіжих курячих яєць, які ретельно миють щіткою з милом, протирають тампоном, змоченим у 70° спиртом, гомогенізують, поміщують у стерильну колбу з бусами та повторно гомогенізують до отримання однорідної маси, потім фільтрують через 2 шари марлі, додають сольовий розчин і 2 % стерильний розчин малахітового зеленого, ретельно 3 3 перемішують та розливають у стерильні флакони (ємністю 500 см ) по 200 см , які закривають стерильними гумовими пробками та піддають пристінному заморожуванню у апараті НЗ-12:50 за температури мінус 30-35 °C впродовж 15-20 хвилин. Після цього флакони пере закривають марлевими салфетками та поміщують у касети, які витримують 12 годин у морозильній камері НС-700:502 за температури мінус 45-50 °C. Потім флакони з касетами поміщують у 1 UA 121606 U 5 10 15 20 25 охолоджений до мінус 60 °C апарат для ліофільної сушки ЛЗ-45:27 і висушують протягом 4-х годин за температури конденсора 45-50 °C, вакуумі 10-12 Па, а від 4-х до 24-х годин у режимі мінус 60-65 °C і вакуумі 1-3 Па. Через 24 години флакони з сухим живильним середовищем виймають із апарату ЛЗ-45:27 і у стерильних умовах закривають гумовими пробками, обкочують алюмінієвими ковпачками. Готове сухе живильне середовище зберігають за 2-8 °C впродовж 2-х років. Для висіву культур середовище готують таким чином: у флакон із сухим живильним 3 середовищем вносять стерильну дистильовану воду до об'єму 200 см і витримують у термостаті за 37 °C впродовж 3-х годин. Після рівномірного розчинення середовище 3 розливають у стерильні бактеріологічні пробірки по 4,0-4,5 см і у скошеному положенні коагулюють у апараті АСІС (апарат для інактивації сироватки крові) за 90 °C впродовж однієї години. Виготовлене щільне живильне середовище зберігають за температури 4 °C не більше 30-ти діб. Приклад 1. Живильне середовище готують, як зазначено вище, за наступним співвідношенням компонентів: калій фосфорнокислий однозаміщений 1,54 г/л магній сірчанокислий 0,15 г/л натрій лимоннокислий 0,38 г/л глікокол 5,0 г/л гліцерин 6,0 г/л 3 яєчна маса 670,0 см 2 % водний розчин 3 малахітового зеленого 15,0 см вода дистильована до рН 3 7,0-7,2 1000,0 см . Приклад 2. Так, як і у прикладі 1, за наступним співвідношенням компонентів: калій фосфорнокислий однозаміщений 1,6 г/л магній сірчанокислий 0,2 г/л натрій лимоннокислий 0,4 г/л глікокол 6,0 г/л гліцерин 7,0 г/л 3 Яєчна маса 700,0 см 2 % водний розчин 3 малахітового зеленого 17,0 см вода дистильована до рН 3 7,0-7,2 1000,0 см . Приклад 3. Так, як і у прикладах 1, 2, за наступним співвідношенням компонентів: калій фосфорнокислий однозаміщений 1,8 магній сірчанокислий 0,25 натрій лимоннокислий 0,45 глікокол 7,0 гліцерин 8,0 3 яєчна маса 750,0 см 2 % водний розчин 3 малахітового зеленого 20,0 см вода дистильована до рН 3 7,0-7,2 1000,0 см . 3 Елективні властивості середовища визначають шляхом висіву 0,1 см зависі мікобактерій видів М. bovis (шт. Valle), M. tuberculosis (шт. H37Rv), M. avium (шт. 780) (концентрація -5 3 бактеріальних клітин у ізотонічному розчині NaCl: 10 у 1 см ), а також проб патологічного матеріалу від хворих на туберкульоз тварин. Пробірки з висівами герметизують парафіном та інкубують за 37 °C впродовж 90-ти діб. Облік росту проводять через кожні 7-10 діб після висіву. Результати проведених досліджень наведені у таблиці. Із таблиці видно, що первинний ріст колоній референтних штамів збудників туберкульозу на запропонованому середовищі спостерігався раніше на 1-2 доби, а з патматеріалу - на 3-5 діб. 2 UA 121606 U 5 10 При цьому інтенсивність росту та накопичення бактеріальної маси за період культивування (90 діб) була вищою у M. bovis на 8,9 мг, у М. tuberculosis на 12,0 мг, у М. avium - на 17,0 мг, із патматеріалу на 3-4 мг у порівнянні з базовим живильним середовищем. Крім того, запропоноване середовище у 5,5 разу дешевше, ніж відоме, та не потребує для виготовлення імпортних компонентів, а кількість бактеріальної маси є достатнім для дослідження культурально-морфологічних, біохімічних і біологічних властивостей епізоотичних культур мікобактерій, що дозволяє скоротити термін визначення видової належності у первинно ізольованих культур мікобактерій і, завдяки цьому, прискорити постановку діагнозу на туберкульоз, а також знизити собівартість бактеріологічних досліджень. Таким чином, новий склад компонентів надає середовищу більш високих ростових властивостей, збільшує кількість виходу бактеріальної маси та знижує процент росту сторонньої мікрофлори. Таблиця Порівняльне вивчення елективних властивостей живильних середовищ Показники Прояв первинного росту колоній тесткультури, доба Прояв первинних колоній збудника туберкульозу із пат матеріалу, доба Вихід бакмаси на середовищі, мг Приклад 1 І II III IV 15 16 12 Живильні середовища Запропоноване Приклад 2 Приклад 3 І II III IV I II III IV 15 16 10 16-21 64,5 64,0 65,0 21 19 18 16-23 Базове І II III IV 16 17 12 18-25 19-26 26,025,023,023,063,5 64,4 63,0 59,4 61,1 62,6 55,6 52,0 48,0 32,0 30,8 28,0 28,0 Примітки: І - М. bovis (шт. Valle), II - М. tuberculosis (шт. H37Rv), III-M. avium (шт. 780), IV патматеріал від хворих на туберкульоз тварин 15 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Сухе живильне середовище, що містить магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, калій фосфорнокислий однозаміщений, гліцерин, яєчну масу, 2 % водний розчин малахітового зеленого та воду, яке відрізняється тим, що додатково містить амінооцтову кислоту (глікокол), при наступному співвідношенні компонентів: калій фосфорнокислий 1,54-1,80 г/л однозаміщений магній сірчанокислий 0,15-0,25 г/л натрій лимоннокислий 0,38-0,45 г/л глікокол 5,0-7,0 г/л гліцерин 6,0-8,0 г/л 3 яєчна маса 670,0-750,0 см 2 % водний розчин малахітового 3 15,0-20,0 см зеленого 3 вода дистильована до рН 7,0-7,2 1000,0 см . Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3