Техпроцес виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу

Техпроцес виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу у черешках та жилках нижнього листя, коренях та здерев'янілих пагонах винограду методом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією, який полягає в тому, що рослинний матеріал гомогенізують у екстракційному карбонатному буфері, утворену суспензію додають до екстракційного гліцинового буфера, суміш прогрівають при 95°С протягом 10 хвилин, витримують зразки на льоду 3 години, а потім аналізують за допомогою тестнабору об'ємом 25мкл, що містить 2,5мкл десяти U 1 3 19847 У зв'язку з цим виникає задача розробки такого техпроцесу виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу, який би дозволяв зі 100% вірогідністю виявити інфікованість посадкового матеріалу. Досягнутий рівень в області технологій виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу характеризується наступними прикладами. Відомий техпроцес виявлення вірусу скручування листя першого серотипу, описаний в [Martelli G.P., Sa vino V., Walter В. Indexing on Vitis indicators // Graft-transmissible diseases of grapevines: Handbook for detection and diagnosis. - Rome: FAO, 1993. - P. 137-156 та в Garau R., Padilla V., Rumbos I. et al. Indexing for the identification of virus and virus-like diseases of the grapevine // Sanitary selection of the grapevine: Protocols for detection of viruses and virus-like diseases. - Paris: INRA, 1997. - P. 97-118], заснований на методі щеплення пагонів рослин, у яких потрібно встановити наявність вірусу, на деревні сорти-індикатори. Для тестування використовують рослини Vitis vinifera таких сортівіндикаторів, як Піно чорний і Каберне фран. Техпроцес складається з наступних те хнологічних операцій. Пагони з кожного дослідного куща прищеплюють у кількох повторностях на чубуки індикаторного сорту. Чубуки спочатку вирощують у теплиці, а потім вкорінені рослини висаджують у відкритий ґрунт і спостерігають за появою симптомів літом і восени впродовж 1-3 років. Недоліком даної методики є значні витрати часу - для проявлення симптомів хвороби необхідно 1-3 роки. Серологічний метод виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу описаний в [Gamsey S.M., Cambra M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Graft-transmissible diseases of grapevines: Handbook for detection and diagnosis. - Rome: FAO, 1993. - P. 169-192 та в Boscia D., Digiaro M., Fresno J. et al. ELISA for the detection and identification of grapevine viruses // Sanitary selection of the grapevine: Protocols for detection of viruses and virus-like diseases. - Paris: INRA, 1997. - P. 128-155]. Першим етапом є фізичне зв'язування первинних антитіл (поліклональних кролячих) до антигенів вірусу скручування листя винограду першого серотипу на мікропланшеті. Потім до антитіл сорбують антигени вірусу, а після цього - кон'юговані вторинні антитіла (поліклональні антикролячи). До складу вторинних антитіл введена лужна фосфатаза, яка є ферментною міткою. Після сорбції вторинних антитіл вносять субстрат (р-нітрофенілфосфат) та інкубують суміш у темряві протягом 60 хвилин. По інтенсивності забарвлення зразка, що тестується, судять про наявність вірусу скручування листя винограду першого серотипу у дослідженому матеріалі. Недоліком даного техпроцесу виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу є те, що вірогідність складає 90%, і можливе попадання у партії посадкового матеріалу саджанців, інфікованих даним вірусом. Відомий найбільш близький за сукупністю суттєви х ознак до заявленого техпроцес виявлення вірусу скручування листя першого серотипу мето 4 дом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією, описаний в [Rowhani A., Biardi L., Johnson R. et al. Simplified sample preparation method and one-tube RT-PCR for grapevine viruses // Proc. XIIIth IC VG Meeting (Adelaide, Australia, 1217 March 2000). - Adelaide, 2000. - P. 148] (прототип). Те хпроцес, взятий у якості прототипа, складається з наступних те хнологічних операцій. Відбирають черешки та жилки нижнього листя і здерев'янілі пагони та корені. Для підготовки зразка, що тестується, відважують 100мг рослинного матеріалу, зразок поміщають у стерильну ступку і гомогенізують у 2мл екстракційного карбонатного буфера (Na2CO3 - 1,59г; Na2HCO3 - 2,93г; полівінілпіролідон з молекулярною вагою 40000 - 20,0г; бичачий сироватковий альбумін - 2,0г; Твін-20 0,5мл; Na2S2O5 - 10,0г; рН 9,6). Утворену суспензію в об'ємі 2мкл додають до 25мкл екстракційного гліцинового буфера (NaCI - 2,92г; гліцин -7,5г; ЕДТА - 0,379г; Тритон Х-100 - 5мл, рН 9,0), суміш протягом 10 хвилин прогрівають при 95°С, а після цього зразки витримують на льоду 3 години (Наbili N., особисте повідомлення). В отриманій суспензії вірус виявляють за допомогою тест-набору об'ємом 25мкл, що містить 2,5мкл десятикратного буфера для проведення ПЛР (0,5М КС1; 0,1М Трис-НСІ, рН 9,0), 2,5мкл обважчувача (20% цукроза), 1мМ крезолового червоного, 200мкМ кожного з 4 дезоксинуклеозидтрифосфатів, 0,1 М дитіотриетола, 0,5мкМ кожного праймера (CPV і СРС),1,25Од Taq-полімерази ("Promega", США), 8Од ревертази ("Gibko", США), 1,5мМ сульфату магнію. Проводять зворотну транскрипцію зразків при 52°С протягом 30 хвилин, а потім проводять ампліфікацію з тими ж зразками, не замінюючи реакційної суміші. Ампліфікація включає 35 циклів чергування денатурації при 94°С протягом 30сек, відпалу при 56°С протязгом 45сек, елонгації при 72°С протягом 60сек (в останньому циклі час елонгації сягає 7 хвилин). Після цього проводять аналіз продуктів ампліфікації за допомогою електрофорезу в 1,5% агарозному гелі. В агарозний гель, крім зразків, що тестуються, вносять маркери молекулярної ваги. Після фарбування ДНК бромистим етидієм в ультрафіолетовому світлі оцінюють розмір ампліконів за маркерами молекулярної ваги. Для пари праймерів CPV і СРС розмір амплікона становить 430 пар основ. Зразок не містить вірусу скручування листя винограду першого серотипу, якщо амплікони відсутні. Недоліком відомого техпроцесу є недостатня вірогідність виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу, яка дорівнює 92%. Така недостатня вірогідність виявлення може стати причиною того, що посадковий матеріал буде частково заражений вірусом скручування листя першого серотипу, що призведе до зниження врожайності, якості врожаю та подальшого поширення хвороби на виноградниках. Розробка нового більш надійного техпроцесу для виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу проводилась кафедрою мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. I.I. Мечникова. 5 19847 В основу корисної моделі поставлена задача підвищити вірогідність виявлення до 100%, яка вирішується шляхом використання пропонуємого техпроцесу. Пропонуємий техпроцес виявлення вірусу скручування листя першого серотипу у черешках та жилках нижнього листя і здерев'янілих пагонах та коренях полягає в тому, що для підготовки зразка, що тестується, відважують 100мг рослинного матеріалу, зразок поміщають у стерильну ступку і гомогенізують у 2мл екстракційного карбонатного буфера (Nа2СО3 - 1,59г; Nа2НСО3 - 2,93г; полівінілпіролідон з молекулярною вагою 40000 - 20,0г; бичачий сироватковий альбумін - 2,0г; Твін-20 0,5мл; Na2S2O5 - 10,0г; рН 9,6). Утворену суспензію в об'ємі 2мкл додають до 25мкл екстракційного гліцинового буфера (NaCI - 2,92г; гліцин - 7,5г; ЕДТА - 0,379г; Тритон Х-100 - 5мл, рН 9,0), суміш протягом 10 хвилин прогрівають при 95°С, а після цього зразки витримують на льоду 3 години (Наbili N., особисте повідомлення). В отриманій суспензії вірус виявляли за допомогою тест-набору об'ємом 25мкл, що містить 2,5мкл десятикратного буфера для проведення ПЛР (0,5 М КС1; 0,1 М Трис-НСІ, рН 9,0), 2,5мкл обважчувача (20% цукроза), 1мМ крезолового червоного, 200мкМ кожного з 4 дезоксинуклеозидтрифосфатів, 0,1 М дитіотриетола, 0,5мкМ кожного праймера (CPV і СРС), 1,25Од Taq-полімерази ("АмплиСенс", Росія), 8 Од ревертази ("АмплиСенс", Росія), 1,5мМ сульфату магнію. Проводять зворотну транскрипцію зразків при 52°С протягом 30 хвилин, а потім проводять ампліфікацію з тими ж зразками, не замінюючи реакційної суміші. Ампліфікація включає 35 циклів чергування денатурації при 94°С протягом 30сек, відпалу при 53°С протягом 45сек, елонгації при 72°С протягом 60сек (в останньому циклі час елонгації сягає 7 хвилин). Після цього проводять аналіз продуктів ампліфікації за допомогою електрофорезу в 1,5% агарозному гелі. В агарозний гель, крім зразків, що тестуються, вносять маркери молекулярної ваги. Після фарбування ДНК бромистим етидієм в ультрафіолетовому світлі оцінюють розмір ампліконів за маркерами молекулярної ваги. Для пари праймерів CPV і СРС розмір амплікона становить 430 пар основ. Зразок не містить вірусу скручування листя винограду першого серотипу, якщо амплікони відсутні. Технічний результат від використання нового техпроцесу - 100% вірогідність виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу. Технічний результат проявляється у наявності чітких одиничних смуг ампліконів ДНК розміру 430 пар основ у випадку тестування усіх зразків рослин, інфікованих вірусом скручування листя винограду першого серотипу. Це досягається оптимальною температурою відпалу (53°С замість 56°С прототипу), що забезпечує утворення специфічних ампліконів у кількості, достатній для візуалізації в агарозному гелі. Спільними ознаками прототипа і пропонуємого техпроцесу є наступні: 1. Пробопідготовка рослинного матеріалу, яка включає гомогенізацію зразка у екстракційному 6 карбонатному буфері, прогрівання у екстракційному гліциновому буфері протягом 10 хвилин і витримка зразків на льоду 3 години; 2. Тестування підготовлених зразків рослинного матеріалу методом ЗТ-ПЛР; 3. Використання тест-набору для виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу об'ємом 25мкл складом: - два праймери (0,5мкМ кожного); - 2,5мкл десятикратного буфера для проведення ПЛР (0,5 М КС1; 0,1 М Трис-НСІ, рН 9,0); - 2,5мкл обважчувача (20% цукроза); - крезоловий червоний (1мМ); - 4 дезоксинуклеозидтрифосфати (200мкМ кожного); - дитіотриетол (0,1М); - 1,25Од Taq-полімерази; - 8Од ревертази; - сульфа т магнію (1,5мМ). 4. Проведення зворотної транскрипції РНК при 52°С протягом 30 хвилин; 5. Проведення ампліфікації ДНК шляхом чередування денатурації при 94°С, відпалу при певній температурі і елонгації при 72°С впродовж 35 циклів (в останньому циклі час елонгації сягає 7 хвилин); 6. Аналіз продуктів ампліфікації за допомогою електрофорезу в агарозному гелі і облік результатів виявлення вірусу за розміром ампліконів ДНК при освітленні в ультрафіолетовому світлі після фарбування бромистим етидієм. Відмінною ознакою пропонуємого техпроцесу і прототипа є ампліфікація ДНК при температурі відпалу 53°С замість 56°С у прототипа. Досягнення очікуваного технічного результату підтверджується наступними прикладами. Приклад № 1 Випробування пропонуємого техпроцесу виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу і прототипа проводили з 10.01.2005 по 05.11.2005 в лабораторії кафедри мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. I.I. Мечникова. Досліджені зразки були відібрані з рослин сорту Каберне Совіньон, штучно інфікованих вірусом скручування листя винограду першого серотипу. Ін фіковані рослини були люб'язно надані доктором D. Boscia (Италия). Для виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу відбирали жилки та черешки нижнього листя, корені та здерев'янілі пагони винограду і відважували 100мг рослинного матеріалу. Зразок поміщали у стерильну ступку і гомогенізували у 2мл екстракційного карбонатного буфера (Na2CO3 - 1,59г; Nа2НСО3 2,93г; полівінілпіролідон з молекулярною вагою 40000 20,0г; бичачий сироватковий альбумін - 2,0г; Твін20 - 0,5мл; Na2S2O5 - 10,0г; рН 9,6). Утворену суспензію в об'ємі 2мкл додавали до 25мкл екстракційного гліцинового буфера (NaCl - 2,92г; гліцин 7,5г; ЕДТА - 0,379г; Тритон Х-100 - 5мл, рН 9,0), суміш протягом 10 хвилин прогрівали при 95°С, а після цього зразки витримували на льоду 3 години (Habili N., особисте повідомлення). В отриманій суспензії вірус виявляли за допомогою тестнабору об'ємом 25мкл, що містить 2,5мкл десяти 7 19847 кратного буфера для проведення ПЛР (0,5 М КС1; 0,1 М Трис-НСІ, рН 9,0), 2,5мкл обважчувача (20% цукроза), 1мМ крезолового червоного, 200мкМ кожного з 4 дезоксинуклеозидтрифосфатів, 0,1М дитіотриетола, 0,5мкМ кожного праймера (CPV і СРС), 1,25Од Taq-полімерази ("АмплиСенс", Росія), 8Од ревертази ("АмплиСенс", Росія), 1,5мМ сульфату магнію. Проводили зворотну транскрипцію зразків при 52°С протягом 30 хвилин, а потім проводили ампліфікацію з тими ж зразками, не замінюючи реакційної суміші. Ампліфікація включала 35 циклів чергування денатурації при 94°С протягом 30сек, відпалу при 53°С протягом 45сек, елонгації при 72°С протягом 60сек (в останньому циклі час елонгації сягає 7 хвилин). Після цього проводили аналіз продуктів ампліфікації за допомогою електрофорезу в 1,5% агарозному гелі. В агарозний гель, крім зразків, що тестуються, вносять маркери молекулярної ваги. Після фарбування ДНК бромистим етидієм в ультрафіолетовому світлі оцінюють розмір ампліконів за маркерами молекулярної ва 8 ги. Для пари праймерів CPV і СРС розмір амплікона становить 430 пар основ. Зразок не містить вірусу скручування листя винограду першого серотипу, якщо амплікони відсутні. Паралельно проводили порівняльне виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу у зразках рослинного матеріалу за відомим техпроцесом згідно прототипа, описаного вище. Результати порівняльного випробування наведені у Таблиці 1. Результати порівняльного випробування показали, що використання нового техпроцесу дозволяє проводити виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу у черешках та жилках нижнього листя і здерев'янілих пагонах та коренях з вірогідністю 100%, яка забезпечується чіткими електрофореграмами продуктів ампліфікації, що виключає помилки обліку результатів виявлення вірусу. На електрофореграмах присутні амплікони розміру 430 пар основ в усі х повторностях зразків, що містять вірус, і немає смуг неспецифічних ампліконів. Таблиця 1 Залежність вірогідності виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу від використання відомого і нового техпроцесів Вірогідність виявлення вірусу скручування листя виногКількість протестовараду першого серотипу,% Рослинний матеріал них зразків Відомий техпроцес за про- Пропонуємий техпроцес тотипом Здерев'янілі пагони і корені 86 90 100 Черешки та жилки нижньо50 94 100 го листя Вірогідність виявлення вірусу скручування листя першого серотипу за допомогою прототипу менше, ніж вірогідність виявлення вірусу за допомогою нового пропонуємого техпроцесу, і складає від 90 до 94%. Приклад № 2 Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як і у прикладі 1. Проводили порівняльні дослідження з використанням різних температур відпалу: 52°С, 53°С, 56°С, 58°С, 60°С, 61°С, 64°С. Результати випробувань наведені у Таблиці 2. Застосування температури відпалу 53°С дозволило отримати одиничний продукт специфічної ампліфікації розміром 430 пар основ в усіх повторностях зразків, які містили вірус скручування листя першого серотипу, що говорить про 100% вірогідності виявлення. Таблиця 2 Вірогідність виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу при різних температурах відпалу праймерів Температура відпалу, °С 50°С 53°С 56°С 58°С 60°С При підвищенні температури відпалу до 58°С та 60°С синтезу амплікона заданого розміру 430 пар основ не спостерігалося, тоді як зменшення температури відпалу до 50°С спричиняло утворення неспецифічних продуктів ампліфікації. Вірогідність виявлення вірусу / скручування листя винограду першого серотипу, % 87 100 92 0 0 Експериментальні дослідження техпроцесу виявлення вірусу скручування листя винограду першого серотипу показали, що сукупність відомих і нової ознаки пропонуємого техпроцесу дозволяє вирішити поставлену задачу підвищення вірогід 9 19847 ності виявлення до 100% за рахунок отримання технічного результату - чітких одиничних смуг ампліконів ДНК розміру 430 пар основ у випадку тестування усіх зразків рослин, інфікованих даним вірусом. За допомогою пропонуємого техпроцесу виявлення вірусу скручування листя винограду першо Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 10 го серотипу з підвищеною до 100% вірогідністю було забезпечено тестування рослинного матеріалу, призначеного для виробництва саджанців винограду, 8 господарств України і 2 господарств Республіки Молдова, що сприяє підвищенню врожайності виноградників. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601