Техпроцес діагностики бактеріального раку винограду

Спосіб діагностики бактеріального раку винограду у рослинах і грунті, який полягає в тому, що патогенні бактерії попередньо вилучають із подрібненого рослинного матеріалу або ґрунту, для чого відстоюють водну витяжку і висівають її на середовище Рой і Сасера, потім інкубують посіви декілька діб при температурі 25°С, тестують виділені колонії бактерій, які виросли при посіві зразка, на патогенність методом полімерної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням тест-набору певного об’єму, який містить два праймери у певних концентраціях (пара праймерів ipt або пара праймерів virD2), 4 дезоксинуклеозидтрифосфату (200 мМ кожного), Taq-полімеразу, реакційний буфер, сульфат магнію, для чого ампліфікують ДИК бактерій шляхом чергування денатурації при 94°С, відпалу при певній температурі для обох пар праймерів і елонгації при 72°С впродовж певної кількості циклів для пари праймерів virD2 і 40 цик U 2 19085 1 3 клітин утворилася пухлина, виділені бактерії є патогенними. Крім того, в наведеному джерелі пропонується також серологічний метод, який також потребує наступного зараження тест-рослин. Недоліком методики зараження тест-рослин є невисока вірогідність результатів - 70 % при зараженні трьох видів тест-рослин і значні витрати часу -21 день. В Україні раніше також використовувався біотехнологічний метод діагностики БРВ, заснований на гібридизації ДНК із зондом, міченим радіоактивною міткою [Сиволап Ю.М., Дьяченко Л.Ф., Милку с Б.Н. и др. Биотехнологический метод диагностики бактериального рака // Биотехнология. - 1991. № 5. - С.82-85]. Недоліком даного методу є необхідність отримання дорогих радіоактивних зондів, які не виробляються в Україні. Відомий найбільш близький до заявленого техпроцес діагностики БРВ, описаний в Manulis S., Chalupowiez L, Dror O., Kleitman F. Molecular diagnostic procedures for production of pathogen-free propagation material // Pest Manag. Science. - 2002. - Vol. 58. - P. 1126 - 1131 (прототип). Взятий у якості прототипа техпроцес заснований на використанні методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і складається із наступних технологічних операцій. Бактерії виділяють з рослинного матеріалу, для чого висівають на середовище Рой і Сасера і потім інкубують 3-4 доби при 25 °С. Виділені колонії бактерій тестують на патогенність методом ПЛР. При тестуванні використовують тест-набір, описаний в Haas J.H., Moore L.W., Ream W., Manulis S. Universal PCR primers for detection of phytopathogenic Agrobacterium strains // Appl. Environm. Microbiol. - 1995. - V. 61, № 8. - P. 2879 2884. Цей тест-набір представляє собою реакційну суміш об'ємом 50 мкл, яка містить праймери (два праймери ipt або два праймери virD2) у концентрації 0,4 мкМ кожний, 4 дезоксинуклеозидтрифосфати у концентрації 200 мМ кожного, 1 Од Taq - полімерази ("Perkin-Elmer"), реакційний буфер ("PerkinElmer") з 1,5 мМ сульфата магнію. Після внесення проби в тест-набір ампліфікують ДНК бактерій шляхом чергування денатурації при 94 °С, відпалу при 50 °С, елонгації при 72 °С, і кількість таких циклів дорівнює 40 для обох пар праймерів. Потім шляхом електрофорезу проводять аналіз продуктів ампліфікації в 1,5 % агарозному гелі. Крім зразків, що тестуються, в агарозний гель вносять маркери молекулярної ваги. ДНК фарбують бромистим етидієм і за величиною ампліконів, що світяться в ультрафіолетовому світлі, роблять висновки про результати діагностики. Для пари праймерів ipt розмір амплікона складає 427 пар основ. Для пари праймерів virD2 розмір амплікона складає 224 пари основ. Якщо амплікони відсутні, зразок не містить збудника бактеріального раку. Недоліком відомого техпроцесу є мала вірогідність діагностики БРВ, яка дорівнює 90 %. Якщо при ненадійній діагностиці у посадковий матеріал потраплять зразки, які містять БРВ, то це призведе до поступового зараження всієї плантації винограду, різкого зниження врожайності, подальшого 19085 4 розповсюдження хвороби і збитків у міліони гривень. Другим недоліком є великі витрати часу, які потрібні для тестування колоній, котрі виросли на живильному середовищі Рой і Сасера при висіві зразка. Це зобумовлено тим, що під час висіву зразка на одній чашці Петрі може вирости до 130 колоній бактерій, які згідно відомого способу діагностики тестуються окремо кожна, що потребує 4 робочих днів. Згідно пропонуємого техпроцесу, коли тестується суміш колоній, тестування зразка зі 130 колоніями займає всього один робочий день. Крім того, тестування кожної окремої колонії призводить до більш значних витрат реактивів, ніж тестування суміші колоній. Висока вартість є третім недоліком відомого техпроцесу, приблизно 50 доларів США, пов'язаної з більш високою вартістю тест-набору, використаного для діагностики. Недоліком відомого техпроцесу діагностики також є те, що його використання потребує багато технологічних операцій (40 операцій-циклів). Розробка нового більш надійного техпроцесу для діагностики БРВ проводилась кафедрою мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. I.I. Мечникова за держзамовленням Міністерства освіти і науки України (ДЗ/165-05 наказ № 440 від 26.07.05). В основу корисної моделі поставлена задача підвищити вірогідність діагностики БРВ до 100 %. Ця задача вирішується шляхом використання пропонуємого техпроцесу, що забезпечить, окрім підвищення вірогідності тестування до 100 %, зменшення трудових і матеріальних витрат, необхідних для діагностики БРВ. Пропонуємий техпроцес діагностики БРВ у рослинах винограду і ґрунті заключаешься в тому, що патогенні бактерії попередньо вилучають із подрібненого рослинного матеріалу або ґрунту, для чого відстоюють водну витяжку впродовж однієї доби при 4°С і висівають її на середовище Рой і Сасера, потім інкубують 7 діб при температурі 25°С, тестують виділені колонії у суміші на патогенність методом ПЛР, для чого ампліфікують ДНК бактерій з використанням тест-набору об'ємом 20 мкл, який містить пару праймерів у концентрації 0,5 мкМ кожного (пара праймерів ipt або пара праймерів virD2), 4 дезоксинуклеозидтрифосфата (200 мМ кожного), 2 Од Taq-полімерази, реакційний буфер фірми "АмплиСенс" (Росія) з крезоловим червоним і обважчувачем, 2 мМ сульфату магнію. Ампліфікацію проводять шляхом чергування денатурації при 94°С, відпалу при 52°С і елонгації при 72°С протягом 40 циклів для пари праймерів ipt, впродовж 37 циклів - для пари праймерів virD2, потім шляхом електрофорезу в 1,5 % агарозному гелі проводять аналіз продуктів ампліфікації. Паралельно з продуктами ампліфікації у лунки вносять маркери молекулярної ваги. ДНК фарбують бромистим етидієм і проводять облік результатів ПЛР за свічінням ампліконів в УФ світлі. За розміром ампліконів роблять висновки про результати діагностики. Для пари праймерів ipt розмір амплікона складає 427 пар основ, а для пари праймерів virD2 розмір амплікона складає 224 пари основ. 5 Технічний результат від використання нового техпроцесу - наявність чітких одиничних смуг ампліконів ДНК певного розміру у випадку тестування усіх зразків, які містять збудника БРВ (рис. 1, рис. 3), що призводить до 100 % вірогідності тестування. Це досягається тим, що при більш тривалому періоді інкубації, який дорівнює 7 діб, виростає більша кількість колоній бактерій, серед яких можуть бути колонії збудника БРВ. Більш тривалий період інкубації призводить до того, що виключаються хибно негативні результати тестування, які можуть виникнути при інкубації впродовж 3-4 діб, коли виростають не всі колонії бактерій зразка, що є характерним для прототипа. Вірогідність тестування за пропонуємим техпроцесом також досягається використанням більш високої температури відпалу, яка дорівнює 52°С замість 50°С згідно прототипа, і скороченням кількості циклів ампліфікації для пари праймерів virD2 до 37 замість 40 циклів - у прототипі, що виключає утворення неспецифічних ампліконів. Тестування колоній, які виросли при посіві зразка, у суміші, а не кожної колонії окремо, як у прототипі, дозволяє зменшити витрати часу на тестування, а також вартість діагностики. Вартість тестування одного зразка згідно пропонуємого техпроцесу складає 16 доларів США (замість 50 доларів США згідно прототипа), що пояснюється використанням тест-набору меншої вартості. Крім того, при аналізі зразка, наприклад, зі 130 колоніями, згідно пропонуємого техпроцесу, коли колонії тестуються у суміші, вартість тестування зменшується відповідно у 130 разів. Спільними ознаками прототипа і пропонуємого техпроцесу є наступні: 1. Відстоювання водної витяжки рослинного матеріалу або ґрунту для виділення збудника БРВ; 2. Вилучення збудника БРВ на тверде живильне середовище Рой і Сасера; 3. Інкубація посівів декілька діб при температурі 25°С; 4. Тестування колоній збудника БРВ, які виросли, методом ПЛР; 5. Використання тест-набору для діагностики БРВ об'ємом 50 мкл; 6. Використання наступного складу тестнабору: - два праймери; - 4 дезоксинуклеозидтрифосфати (200 мМ); - Taq - полімеразу; - реакційний буфер; - сульфат магнію. 7. Ампліфікація ДНК бактерій шляхом чергування денатурації при 94°С, відпалу при певній температурі для обох пар праймерів (ipt і virD2), і елонгації при 72°С впродовж 40 циклів для пари праймерів ipt і певної кількості циклів для пари праймерів virD2; 8. Аналіз продуктів ампліфікації за допомогою електрофорезу в агарозному гелі і оцінка результатів діагностики за розміром ампліконів ДНК при освітленні в УФ світлі після фарбування бромистим етидієм. Відмінними ознаками пропонуємого техпроцесу і прототипа є: 19085 6 1. Інкубація посівів на середовищі Рой і Сасера впродовж не менше 7 діб замість 3-4 діб за прототипом; 2. Тестування в ПЛР ДНК суміші всіх колоній, які виросли при посіві зразка на середовищі Рой і Сасера та були пересіяні на картопляний агар як одна проба, а не кожної колонії окремо, як у прототипі; 3. Використання при тестуванні нового тестнабору об'ємом 20 мкл замість 50 мкл прототипа, 4. Використання нового складу тест-набору, відмінними ознаками якого від прототипа є: - два праймери у концентрації 0,5 мкМ кожного замість 0,4 мкМ прототипа; - 2 Од Taq-полімерази замість 1 Од прототипа; - реакційний буфер фірми "АмплиСенс" (Росія) з крезоловим червоним і обважчувачем замість реакційного буферу фірми "Perkin-Elmer" прототипа; - 2 мМ сульфату магнію замість 1,5 мМ прототипа. 5. Ампліфікація ДНК бактерій при температурі відпалу не менше 52 °С замість 50 °С прототипа; 6. Кількість циклів для пари праймерів virD2 дорівнює 37 замість 40 циклів прототипа. Досягнення очікуваного технічного результату підтверджується наступними прикладами. Приклад № 1. Випробування пропонуємого техпроцесу і прототипа проводили з 15.06.2005 до 10.02.2006 в лабораторії кафедри мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова. Усі досліджені зразки були відібрані з рослин, уражених збудником бактеріального раку, які культивувалися на виноградниках господарств Одеської області. Для тестування рослини винограду відбирали здерев'янілі пагони, розташовані ближче до штамбу, та корені. Пагони мили під водогоном, стерилізували поверхневим фламбуванням і подрібнювали на диски товщиною 0,5 мм за допомогою скальпеля або сікатора, простерилізованого фламбуванням. Відважували наважку подрібнених пагонів вагою 50+5 г, поміщали наважку у стерильний скляний стакан об'ємом 250 - 600 мл і заливали 80+5 мл стерильної дистильованої води. Стакан залишали при 4 °С на одну добу. На чашки Петрі з середовищем Рой і Сасера висівали 100 мкл суспензії, що утворилася. Корені винограду діаметром 0,2 - 0,5 см відбирали на винограднику на глибині 20 - 30 см по декілька з кожного куща. Корені ретельно мили у проточній воді, ополіскували стерильною дистильованою водою. Корені подрібнювали на фрагменти і аналізували так само, як здерев'янілі пагони. Посіви інкубували 7 діб при температурі 25 °С. Колонії, що виросли при посіві зразка на середовищі Рой і Сасера, тестували у суміші. Для цього суміш усіх колоній, які виросли при посіві зразка, пересівали у пробірки зі скошеним картопляним агаром, а з біомаси, що виросла через добу інкубації при 25°С, виділяли ДНК методом теплового лізису. Ампліфікацію підготовлених зразків ДНК проводили за допомогою тест-набору, який містить два праймери у концентрації 0,5 мкМ кожного, 7 19085 4 дезоксинуклеозидтрифосфата (200 мМ кожного), 2 Од Taq-полімерази, реакційний буфер фірми "АмплиСенс" (Росія) з крезоловим червоним і обважчувачем, 2 мМ сульфату магнію. Об'єм тестнабору дорівнював 20 мкл. Зразки ампліфікували шляхом чергування денатурації при 94°С, відпалу при температурі 52°С і елонгації при 72°С впродовж 40 циклів для пари праймерів ipt і впродовж 37 циклів - для пари праймерів virD2. Проводили електрофорез з продуктами ампліфікації у 1,5 % 8 агарозному гелі. Агарозний гель для фарбування ДНК готовили на буфері з бромистим етидієм. Паралельно з продуктами ампліфікації у лунки вносили маркери молекулярної ваги. Результати ПЛР враховували візуально за свічінням ампліконів в УФ світлі. Паралельно проводили порівняльне тестування зразків за відомим техпроцесом згідно прототипа, описаного вище. Результати порівняльного випробування наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Залежність вірогідності діагностики БРВ від використання відомого і нового техпроцесів для тестування зразків рослинного матеріалу винограду (корені і здерев'янілі пагони досліджених рослин) Вірогідність діагностики БРВ в усіх зразках, % Джерело виділення Сорт Каберне-Совіньон, виноградник №1 Сорт Каберне-Совіньон, виноградник №2 Сорт Мускат олександрійський Кількість протестованих зразків Відомий техпроцес за прототипом Пропонуємий техпроцес 50 90 100 50 94 100 55 87 100 Як видно з наведених результатів порівняльного випробування, вірогідність виявлення збудника БРВ за допомогою прототипа на різних зразках рослинного матеріалу винограду складає від 87 до 94 %, в середньому - 90 %, на той час як вірогідність виявлення збудника БРВ за допомогоюнового пропонуємого техпроцесу складає 100 %, тобто збудник бактеріального раку був виявлений в усіх протестованих зразках інфікованих рослин. Вірогідність, що дорівнює 100 %, зобумовлена чіткими електрофореграмами з наявністю яскравих смуг ампліконів в УФ світлі, що виключає помилки. Приклад № 2. Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як і у прикладі 1, за виключенням того, що тестували зразки ґрунту виноградни ків. Ґрунт відбирали на глибині 20-30 см у ризосфері рослин винограду, уражених збудником бактеріального раку. Наважку ґрунту масою 100 г поміщали у стерильний скляний стакан і заливали 200 мл стерильної дистильованої води, збовтували. Стакан накривали кришкою і залишали на добу при 4°С. Надосадкову суспензію висівали в об'ємі 100 мкл на середовище Рой і Сасера. Далі тестування проводили так само, як тестування зразків рослинного матеріалу, описане вище. Результати випробувань наведені у таблиці 2. Вірогідність виявлення збудника БРВ у зразках ґрунту ризосфери уражених рослин складала від 87,5 % до 92,8 %, у середньому - 90,1 %. Вірогідність виявлення збудника БРВ за допомогою пропонуємого техпроцесу складала 100 %. Таблиця 2 Залежність вірогідності діагностики БРВ від використання відомого і нового техпроцесів для тестування зразків ґрунту виноградників Вірогідність діагностики БРВ у всіх зразках, % Джерело виділення Ґрунт виноградника 1998-го року садіння Ґрунт виноградника 2000-го року садіння Ґрунт виноградника 2002-го року садіння Кількість протестованих зразків Відомий техпроцес за прототипом Пропонуємий техпроцес 30 90 100 70 92,8 100 40 87,5 100 9 19085 Приклад № 3 Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як і у прикладі 1, за виключенням того, що досліджували вплив термінів інкубації посівів на вірогідність діагностики. Досліджували зразки здерев'янілих пагонів і коренів рослин, інфікованих збудником БРВ. 10 Облік посівів (десять повторностей кожного зразку) проводили через 4 і 7 діб інкубації. При інкубації посівів напротязі 4 діб збудник БРВ нами не був виявлений в усіх повторностях деяких зразків, на той час, як через 7 діб інкубації ми могли виявити патоген в усіх повторностях усіх досліджених зразків. Результати порівняльного дослідження наведені у таблиці 3. Таблиця 3 Залежність вірогідності діагностики БРВ від термінів інкубації посівів Зразок 1Л 2Л 7К 4К 4П 2П Джерело виділення Вірогідність діагностики, % 4 дні інкубації 7 днів інкубації пагони 90 100 пагони 100 100 корені 100 100 корені 90 100 корені 100 100 корені 100 100 Вірогідність виявлення збудника БРВ при 4 добах інкубації складала у середньому 97 %. Збільшення терміну інкубації до 7 діб і 10 діб призводить до підвищення вірогідності до 100 %, але використання терміну 10 діб не є доцільним, тому для збереження часу здебільшого використовували термін інкубації 7 діб. Приклад № 4 Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як і у прикладі 1, за виключенням того, що проводили порівняльне тестування колоній у суміші і окремих колоній, які виросли при посіві зразків. Досліджували інфікований і здоровий рослинний матеріал, а також ґрунт. З викорис 10 днів інкубації 100 100 100 100 100 100 танням одного ампліфікатору "Терцик" фірми "ДНК-Технология" (Росія) за один робочий день можливо протестувати 37 зразків. Як видно з таблиці 4, при посіві зразків різного походження виростає різна кількість колоній бактерій. При тестуванні кожної колонії окремо згідно прототипа на аналіз одного зразка з 130 колоніями необхідно витратити 4 робочих дні, на аналіз зразка з 82 колоніями - 3 дні. Натомість, тестування суміші колоній дозволяє прискорити процес діагностики БРВ з 2-4 робочих днів до одного робочого дня, тобто пропонуємий техпроцес є більш продуктивним по часу. Таблиця 4 Залежність витрат робочого часу на тестування зразків від способу тестування колоній бактерій, які виросли при посіві зразка Зразок Джерело виділення Кількість колоній зразка 1М 5М 12П 4КС 5КП пагони пагони корені ґрунт ґрунт 3 45 53 130 82 Час тестування зразків, робочі дні окремі колонії за прототисуміш колоній за пропонуємим пом способом 1 1 2 1 2 1 4 1 3 1 Вірогідність тестування колоній у суміші не зменшується у порівнянні з тестуванням окремих колоній. Порівняльне дослідження проводили наступним чином. Колонії бактерій, які виросли при посіві зразків на середовище Рой і Сасера на чашці Петрі, були розділені за трьома секторами, суміш колоній кожного з окремих секторів була пересіяна на скошений картопляний агар, і потім ДНК даної суміші штамів протестована як одна проба. Зразки зневеликою кількістю вирослих колоній (до 5) були розділені на сектори за кількістю колоній. Кожна колонія у даному випадку тестувалась окремо. Потім із посівів зразків на чашках Петрі суміш колоній усіх секторів була пересіяна на скошений картопляний агар і протестована як одна проба. Як видно з таблиці 5, якщо хоча б в одному з трьох секторів або в одній з колоній, протестованій окремо, виявлявся збудник БРВ, тестування всіх колоній зразку у суміші відповідно показувало наявність збудника БРВ у даному зразку. 11 19085 12 Таблиця 5 Вірогідність тестування окремих колоній або колоній бактерій у секторах і суміші колоній, які виросли при посіві зразка Зразок 1М 5М 12П 4КС 5КП Джерело виділення пагони пагони пасока ґрунт ґрунт Вірогідність тестування, % окремих колоній або колоній у секторах суміші колоній 100 100 100 100 0 0 100 100 100 100 Приклад № 5 Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як і у прикладі 1. Застосовували різні температури відпалу: 48°С, 50°С, 52°С, 55 °С. Результати випробувань наведені у таблиці 6. Таблиця 6 Вірогідність діагностики при різних температурах відпалу праймерів Температура відпалу, % Температура відпалу, °С 48 50 52 53 55 праймери ipt 94 98 100 100 100 Аналіз результатів випробувань, представлених у таблиці 5, показує, що з підвищенням температури відпалу для обох пар праймерів вірогідність тестування зростає, однак при використанні температур відпалу 52°С, 53°С і 55°С вірогідність є сталою і дорівнює 100 %. У використанні у пропонуємому техпроцесі температури, вищої за 52°С, не було потреби. праймери virD2 92 96 100 100 100 Приклад № 6 Умови проведення випробувань пропонуємого техпроцесу такі ж, як у прикладі 1, за виключенням того, що змінювали кількість циклів ампліфікації для пари праймерів virD2. Результати представлені у таблиці 7. Таблиця 7 Залежність вірогідності тестування vіrD2 - позитивних зразків від кількості циклів ампліфікації Кількість циклів ампліфікації 35 37 38 40 Як видно з таблиці 7, у результаті проведених випробувань було встановлено, що оптимальна кількість циклів ампліфікації дорівнює 37, при цьому досягається 100 % вірогідність тестування. Вірогідність тестування при 40 циклах ампліфікації, як у прототипа, складала 95 % із-за утворення у низці повторностей неспецифічних ампліконів. При 35 циклах вірогідність складала усього 94 % із-за того, що утворювалася недостатня кількість продукту ампліфікації. Вірогідність тестування, % 94 100 97 95 У результаті експериментальних досліджень техпроцесу діагностики БРВ встановлено, що сукупність відомих і нових ознак пропонуємого техпроцесу дозволяє вирішити поставлену задачу підвищення вірогідності діагностики за рахунок отримання технічного результату - наявності чітких одиничних смуг ампліконів ДНК певного розміру у випадку тестування усіх зразків, що містять збудника БРВ. Додатково пропонуємий техпроцес дозволяє зменшити трудові і матеріальні витрати. 13 19085 Пропонуємий техпроцес діагностики бактеріального раку винограду з підвищеною до 100 % вірогідністю дозволив забезпечити тестування рослинного матеріалу винограду і ґрунту виноградників 21 господарства України і 6 господарств Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 14 Республіки Молдова, що у короткі терміни зробило можливим відбір ділянок для закладання насаджень винограду і виробництво здорового посадкового матеріалу. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601