Живильне середовище для пригнічування роїння бактерій роду proteus

Корисна модель належить до медицини, а саме до медичної мікробіології, зокрема до живильних середовищ для культивування бактерій роду Proteus. Диференціальною відзнакою бактерій роду Proteus є підвищена енергія росту, що характеризується здатністю створювати роєві колонії (Н-форма). Роїння здійснюється за рахунок подовжeних (20-30 m ) клітиншерверів через 3-4 години культивування на м'ясо-пептонному агарі. На створювання жгутикового апарату впливає стан живильного середовища - аерація. В аеробних умовах при рН=6,0 8,0 кількість жгутиків збільшується. При підвищeні концентрації агару, культивуванні при температурі t=45°С, додавання до середовища поверхово-активних речовин протей із Н-форми переходить в О-форму ізольовані колонії на агарі. Деякі дослідники для пригнічуванння роста використовували борний та етиловий спирти, жовч, фенол, мідний купорос. Отримання ізольованих колоній протея необхідно в клінічній медицині при встановленні і нфекційних агентів у урологічних хво р их т а хв о р их з о пікам и, тр авм ам и. Пр о те й дуж е ч ас то є внутрішньолікарняною інфекцією, а запальні процеси викликаються у хворих інші мікроорганізмами, тому для визначення ефективної терапії необхідно з'ясувати етіологічний фактор захворювання. Для вирощування протея застосовуються декіль ка живиль них середовищ: МПА, середовища Поскірєва [1,2]. Всі перераховані середовища виготовляються на основі м'ясо-пептонного агару. Відмінності між ними полягають в використанні додаткових стимуляторів росту: глюкози, лактози, пептона, що слугують діагностичним цілям при визначенні патогенних властивостей [2, 3]. Ознаками, що збігаються з суттєвими ознаками корисної моделі, що заявляється, є використання живильної білкової основи. Використання м'ясо-пептонного середовища (МПА) та харчових добавок (глюкоза, лактоза) зумовлює високу собівартість усіх наведених середовищ. Про то типо м середовища, яке про по нує ть ся, є середовище - аг ар Плоскірьова, до складу якого входять такі інгредієнти: Панкреатичний гідролізат кільки 16,0г/л Натрія гідроцитрат двозамісний 8,82г/л Лактоза 7,59г/л Натрія фосфат двозамісний 2,25г/л Натрія тіосульфат 0,86г/л Натрієві солі жовчних кислот 8,10г/л Натрія карбонат 1,42г\л Йод металевий 0,12г\л Нейтральний червоний 0,04г\л Бриліантовий зелений 0,02г\л Агар мікробіологічний 8,75г\л рН 7,2. 60г суміші розмішували в 1 літрі дистиль ованої води, кипятили та розливали стерильно в чашки Петрі. Ознакам и про то типу, що збіг ають ся з такими середовищам и, що пропонується, є наявність в середовищі натрія фосфат двозамісний, натрія карбонат, йод металевий та рН-7,2. На відміну від прототипу ми пропонуємо використовувати як живильну основу солянокислий гідролізат еритроцитарної маси крові людини замість панкреатичного гідролізату кільки й лактози та бентонітову глину катіони кальцію, міді, заліза. В основу корисної моделі покладено задачу розробити середовище для пригнічення росту бактерій роду протея шляхом заміни харчової сировини (панкреатичний гідролізат кільки, лактоза) продуктами переробки еритроцитарної маси з простроченим терміном дії (строк зберігання 10 років), забез печ ити пригнічення роїння та активність росту, яка перевищує або не поступається такій на середовищі-прототипі, і знизити таким чином його собівартість. Ознаки корисної моделі: основа - солянокислий гідролізат еритроцитарної маси крові людини, одержаний при концентрації соляної кислоти 1-5%; вміст амінного азоту - 120-140мг%, рН-7,2, вміст агар-агару - 2%, наявність натрія фосфат двозамісний, натрія карбонат, йода металевого та бентонітової глини. Ознакою, відмінною від прототипу, є використання як живильної органічної основи солянокислого гідролізата еритроцитарної маси крові людини, одержаної при концентрації соляної кислоти 1-5%, та бентонітової глини Ці ознаки є достатніми у всіх випадках, на які поширюється обсяг правової охорони. Відомості, що підтверджують можливість здійснення корисної моделі: Експериментально були одержані такі дані: - підібрано умови трансформації еритроцитарної маси крові людини та бентонітової глини у форму, придатну для культивування мікроорганізмів; - підібрано оптимальні концентрації натрія фосфата двозамісного, натрія карбоната та йода металевого, як складові частини живильної основи для пригнічення роїння протея; - підібрано оптимальну концентрацію амінного азоту для росту протея на даній основі. Еритроцитарна маса крові людини являє собою суміш еритроцитів, відокремлених від інших елементів крові, і має вигляд густої рідини темно-червоного кольору, термін зберігання в закритих флаконах 10 років. Було досліджено можливість одержання живильної основи з використанням кислотного та лужного гідролізу еритроцитарної маси крові людини. Для цього в роботу брали два флакони, один з яких відстоювали протягом однієї години і вносили різні концентрації НСl та NaOH у вигляді 36% та 40% розчинів відповідно. Другий флакон попередньо автоклавували 20 хвилин при 0,5атм, після цього еритроцитарна маса мала вигляд густого геля коричнево-червоного кольору. Гелеву основу розм’яли на невеликі шматочки, залили 0,2% оцетовою кислотою на 24 години, потім промили водою і внесли відповідні концентрації НСl та NaOH. Суміші автоклавували 2год при 1,5атм, після чого їх розбавляли дистиль ованою водою у відношенні 1:1 і освітлювали активованим вугіллям. Для цього в розбавлені гідролізати вносили активоване вугілля, (2г на 100мл), автоклавували 20хв. при 1атм. Просвітлені гідролізати еритроцитарної маси крові людини відфільтрували через склотканину (ватно-марлевий фільтр) і визначали вміст амінного азоту (табл. 1). Таблиця 1 Амінний азот, одержаний при різних концентраціях НСl та NaOH Концентрація гідролізуючого агента % Еритроцитарна масса 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0 10,0 18,0 25,0 Амінний азот, мг% НСl Амінний азот, мг% NaOH 314,3±36,5 316,7±25,6 270,8±23,7 264,9±19,6 276,8±26,8 112,9±15,2 102,1±10,3 97,5±9,7 112,4±23,1 175,1±21,4 213,6±22,8 196,7±23,6 181,1±21,4 226,8±28,9 224,8±29,9 245,9±31,5 Еритроцитарна маса після автоклавування 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0 10,0 18,0 25,0 Як видно із наведених данних, НСl забезпечує значний вміст амінного азоту при низьких концентраціях (1,0-5,0)%, NaOH дає задовільні значення амінного азоту при збільшенні концентрації до (10,0-25,0)%. Тому надалі гідроліз еритроцитарної маси здійснювали відповідно при 1,0% НСl та 10,0% NaOH. Спосіб приготуваний еритроцитарної маси (додавання кислоти та лугу в рідину та гель) не вплинув на вміст амінного азоту, однак по фізичним характеристикам (незначна кількість осаду, прозорість) в подаль шу роботу брали еритроцитарну масу, яку попередньо автоклавували і яка мала вигляд гелю. Для перевірки ростових якостей одержаних гідролізатів із них було виготовле но ж ивиль ні середовища з а таким про писом : г ідро ліз ати не йтр а ліз ув ал и 1 0 н NaO H т а 6 н НС l від по від но до р Н7 ,0 -7 ,2 і розбавляли водою до вмісту амінного азоту 120-140мг%. За рахунок нейтралізації надлишку кислоти та лугу утворювався NaCl, концентрація якого становила в середовищах із НСl - гідролізатів (0,50,8)%, а із NaOH - гідролізатів - порядку (7,0-9,0)%. В середовища вносили 2,0% агару, а потім стерилізували 30 хвилин при 1,0атм. Після стерилізації підтверджували вміст амінного азоту та рН середовища. Перевірку ростових якостей здійснювали за відомо ю мето д ико ю [3 , 4]; при ць ом у на виго товле ні середовища здійснюється висів культур в кількості 5´102 , 103 , 104 , 10 5, 10 6 мікробних клітин в 0,1мл фізіологіч ного розчину. Кіль кість мікробних клітин встановлювали по оптичному стандарту мутності. В роботу брали стандартні штами мікроорганізмів, які рекомендовані для перевірки контроля якості ж ивиль них середовищ. Наявність росту при висіві 5´10 2 та 10 3 мікробних клітин є індикаторами задовільної ростової якості середовища для взятого мікроорганізма [4, 5] (табл. 2). Таблиця 2 Ростові якості середовища із еритроцитарної маси у відношенні тест-культур мікроорганізмів Тест-штами Ростові якості по кількості колоній, що виросли Основа із NaСl-гідролізату Основа із NaOH-гідролізату П о с і в н а доза кліт и н 5´ 102 103 104 105 106 102 103 103 Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 102 102 102 Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 102 102 102 103 104 104 105 102 102 102 102 Bacillus subtilis АТСС 6633 Proteus vuigaris ATCC 4636 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcu s aureus ATCC 25923 Staphylococcu s aureus ATCC 6538 Candida albicans ATCC 885-653 5´102 103 104 105 106 5 колоній 1 7 18 колонія колоній колоній _ 10 колоній 102 2 7 колонії колоній 103 104 9 15 колоній колоній 102 103 103 102 102 6 колоній 5 14 колоній колоній Примітка : підрахунок через 24 години культивування Як видно із наведених в табл. 2 даних, в найбіль шій мірі середовище із НСl-гідролізату еритроцитарної маси крові людини підходить для Proteus vulgaris та S.aureus. Інші тест-культури виявляють ріст лише при високих пос івних доз ах, що св ідч ить про не пр идатність середовища д ля їх культивування. Відмічено, що на середовищах протей не дає роїння, колонії – відокремлені, сірого кольору, блискучі з рівними краями. При мікроскопічному дослідженні морфологія клітин відповідає протейній паличці - грамнегативні тонкі палички. Середовище на основі лужних гідролізатів еритроцитарної маси не мають ростових якостей, незважаючи на достатній вміст амінного азоту. Таким чином, живильна основа, одержана із еритроцитарної маси крові людини з просроченим терміном зберігання НСІ-гідролізом, є прид атною д ля вирощування протея і стафілококів. Відмінною ознакою є те, що на середовищі протей не дає роїння і це середовище може використовуватись в якості диференціального. Оптималь ні параметри гідролізу - (1,0-5,0)% соляної кислоти. Для конструювання живильного середовища для протея необхідно було підібрати концентрацію амінного азоту, яка б забезпечувала оптимальний ріст цього мікроорганізма, а також порівняти його ростові якості зі стандартним агаром Плоскірєва. Для цього було приготовано ряд живильних середовищ з різним вмістом амінного азоту, в межах (100,0-180,0)мг%. На чашки Петрі було висіяно штам P.vulgaris АТСС 4636 в діапазоні посівної дози 5´102-10 6 мікробних клітин (табл. 3). Таблиця 3 Активність росту P. vulgaris на розроблюваному середовищі із еритроцитарної маси крові людини при різних значеннях амінного азоту Значення амінного азоту, мг% Активність росту, умовні одиниці (+ - ++++) Посівна доза 103 104 105 5х102 106 90 +++ +++ +++ ++++ ++++ 100 +++ +++ +++ ++++ ++++ 120 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 140 +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 150 ++ +++ +++ +++ +++*) 170 + ++ +++ +++ +++*) 180 + + ++ ++ ++*) Примітка: *) - наявність форм незоалансованого росту. Облік результатів проведено через 24 год. Як видно із наведених даних, вміст амінного азоту, що є оптималь ним для росту мікроорганізму P.vulgaris, знаходиться в межах (100,0-140,0)мг%. Таким чином, проведені експерименти дають можливість прийняти такі параметри при виготовленні середовища для протея із еритроцитарної маси: 1) білкова основа - солянокислий гідролізат еритроцитарної маси, одерж аний солянокислим гідролізом при концентрації кислоти (1,0-5,0)%; 2) вміст амінного азоту - (100-140)мг%. Виготовлення білкової основи здійснюється за такою методикою: 100г еритроцитарної маси, яка попередньо було автоклавована і має вигляд гелю розламують, перемішують до однорідної маси, заливають 0,2% оцетовою кислотою і залишають на 3 доби міняючи кислоту, на 4 добу промивають водою та вносять комерційну соляну кислоту до кінцевої концентрації (1,0-5,0)%, закорковують ватно - марлевим корком і автоклавують 2 години при 1,5атм. Після автоклавування одержується рідина коричневого кольору з осадом. В гідролізат вносять дистильовану воду у відношенні 1:1 та активоване вугілля із розрахунку 2,0г на 100мл; суміш автоклавують 20 хвилин при 1атм і відфільтровують через склотканину, полотно або ватно-марлевий фільтр. Одержаний гідролізат являє собою прозору рідину світло - коричневого кольору і має характеристики, наведені в табл. 4. Таблиця 4 Характеристика солянокислого гідролізата еритроцитарної маси крові людини, одержаного із 100г еритроцитарної маси № серії 1 2 3 Об'єм одержаного гідролізату, мл 120 150 180 Fe2+, мг/мл Загальний азот, мг% Амінний азот, мг% 4,3 5,3 6,1 378 350 300 234 324 260 Для підвищення мінераль них сполук: заліза, міді, цинку, в середовище додали бентонітову глину. Для з'ясування питання оптимальної концентрації глини було виготовлено 4 зразки з різним її вмістом в діапазоні концентрації від 4,0 до 10,0%, після чого здійснено висів P. vulgaris на кожному із зразків. Окрім того бентонітова глина сприяла освітленню середовища, придаючи світло-коричневий колір та прозорість. Вміст посівної куль тури протея дорівнював 5´102 та 103 мікробних клітин на мл. Данні надані в таблиці 5. Таблиця 5 Вплив вмісту бентонітової глини на ростову активність живильного середовища Зразки середовища Активність росту протея на середовищах з глиною 1 1-й зразок 4,0г глини на 100мл 2-й зразок 6,0г/100мл 3-й зразок 8,0г/100мл 4-й зразок 10г/100мл Інкубація 24 години Інкубація 48 годин Посівна доза мікробних клітин на мл. 103 103 5´102 5´102 2 3 4 5 8 колоній 12 колоній 10 колоній 12 колоній 34 колонії 45 колоній 26 колоній 47 колоній 38 колоній 50 колоній 38 колоній 52 колонії 22 колонії 34 колонії 22 колонії 34 колонії Як видно із наведених даних, оптимальна кількість глини в складі розробленого середовища становить (6,08,0)г/100мл. Менша кількість не забезпечує доброго росту, а більша є необгрунтованою. В агарі Плоскірєва міститься велика кількість солей та фарбників. Тому для з'ясування ростової якості було виготовлено декілька серій живильного середовища (еритроцитарна маса та бентонітова глина) з допоміжними інгредієнтами, які містяться в агарі Плоскірєва. Вміст посівної культури протея дорівнював 5´102, 103 та 104 мікробних клітин на мл. Дані надані в таблиці 6. Таблиця 6 Активність росту P. vulgaris на розроблюваному середовищі із еритроцитарної маси крові людини з бентонітовою глиною при різних значеннях допоміжних інгредієнтів Серії середовищ 1 Ер-маса + допоміжні речовини Ер. маса + солі Ер. маса + красителі Ер. маса +Na фосфат + йод Ер. маса + Na карбонат + йод Ер. маса + солі натрія + йод Ер. маса + солі + нейт. чер. + бр зелений Ер. маса + солі + нейтр. черв. Ер. маса + солі + бр. зелений Акти вність рос ту при відпо відній посі вній до зі 5x102 103 104 2 3 4 2 Наявність роїння протея 5 30 колоній 32 колонії 10 відсутнє 34 колонії роїння 34 колонії роїння 68 колоній роїння відсутнє роїння 30 колоній 42 колонії 102 відсутнє 34 колонії 48 колоній 102 відсутнє 56 колоній 102 103 відсутнє 38 колоній 73 колонії 102 відсутня 35 колоній 61 колонія 102 відсутнє 32 колонії 59 колоній 102 відсутнє Данні вказують на те, що втрата здатності до роїння штамами протея пов'язана тільки з осмотичним тиском середовища. Тому була відібрана серія середовища, де містить ся частковий склад солей (натрія фосфат двозамісний і натрія карбонат) та йод. Виготовлення живиль ного середовища для куль тивування Proteus sp. включає такі етапи: - нейтралізація гідролізату до рН7,0-7,2; - розбавлення до вмісту амінного азоту (100-140)мг%; - внесення агар-аг ару - 2,0%, натрія фосфата двозамісного 2,25г/л, натрия карбоната 1,42г/л, йода металевого 0,12г/л; - стерилізація 20 хвилин при 120С0 Приклад 1 100мл еритроцитарної маси крові людини, одержаної з Областної станції служ би крові м.Харкова, автоклавували 20 хвилин при 0,5атм, отриманий гель розтирали та заливали 0,2% розчином оцетової кислоти, відстоювали 3 доби, міняючи кислоту. Вносили 1,0% НСl у вигляді 36,5%-ної комерційної кислоти. Розрахунок необхідної кількості здійснили за правилом змішування: 36,5 1 ч НС І 35,5-1,0 1 100,0-х 0 35,5 ч Н2О 100,0 2,8мл 35,5 НСl Суміш проавтоклавували 2год при 1,5атм., в одерж аний продукт коричневого кольору внесли активоване вугілля (2,0г), 100мл дистильованої води і проавтоклавували 20хв при 1атм. Просвітлений гідролізат світлого сірувато-коричневого кольору відфільтрували через склотканину, визначили вміст амінного азоту, який склав 234мг%. Кількість солянокислого гідролізата, необхідного для приготування 1л середовища, розрахували, виходячи із міркування, що концентрація амінного азоту в готовому середовищі повинна становити 120мг%, за правилом змішування 12мл гідролізата нейтралізували внесенням 40% NaOH до рН7,2 за індикаторним папером, після чого вносили дистильовану воду до 1000,0мл. Кінцевий рН7,2 встановлювали за рН-метром, вносили 2,0% агару, натрія фосфат двозамісний 2,25г/л, натрія карбонат 1,42г/л, йод металевий 0,12г/л, бе нто нітова г лина (6 ,0 8,0)г\л, автоклавували 20 хв илин при 1атм. Одержане середовище за розрахунковими даними містить 0,67% NaCl. Одержане середовище було використане для пригнічення роїння бактерій протея: 4636 АТСС (музейний), №46, 87, 93, 125, (клінічні) в порівнянні з агаром Плоскірєва. Для цього на чашки Петрі суцільним газоном засівали по 0,2мл 5-ти м лн-ої куль тури дослідж уваних штамів. Піс ля 24 год куль тивування культуру змивали фізіологічним розчином і визначали кількість змитих клітин за стандартом каламутності. Порівняння одерж аних резуль татів давало мож ливість судити про продуктивність дослідж уваних середовищ для стафілококів (табл. 7). Таблиця 7 Продуктивність досліджуваних середовищ для протея Штами протея 1 №4636 АТСС №46 (клінічний) №8 7 (клінічний) №93 (клінічний) №125 (клінічний) Кількість КЛІТИН, м лрд/чашку х± Середовище із Агар Плоскирьова еритроцитарної маси та бентонітової глини 2 3 1000,0±100,0 500,0±100,0 900,0±80,0 700,0±50,0 1300±200,0 900,0±80,0 1000,0±100,0 500,0±100,0 1200,0±150,0 1000,0±90,0 t (df=5) Р 4 3,03 2,5 2,52 3,03 2,64 5 р