Оптичний денсітометр для аналізу спектрів

Изобретение относится к устройствам для измерения распределения оптической плотности различных спектров, представляющих собой последовательность окрашенных пятен, нанесенных на однородную прозрачную или непрозрачную подложку, например, электрофореграмм, хроматограмм, для их последующей математической обработки, Изобретение может быть использовано в биологии, медицине, химии, физике для обработки электрофоретических, хроматографических и др. спектров в диагностических или исследовательских целях. Известны оптические денситометры для анализа спектров [1, с. 190-194; 2, с.226-230], содержащие источник света и жестко соединенный с ним основной фотоприемник, между которыми расположен облучаемый элемент в виде устройства сканирования, установленный с возможностью перемещения относительно источника света, при этом основной фотоприемник присоединен к прямому или дифференциальному входу согласующего усилителя, выход которого подключен ко входу аналогоцифрового преобразователя и блок управления, выход которого подключен к устройству сканирования, Данные денситометры используются для определения количеств веществ, например белков, после их разделения методом электрофореза на пористых подложках. Результат получают путем математической обработки кривой распределения оптической плотности электрофореграммы, которая представляет собой спектр, составленный из последовательности пятен белков, окрашенных специальными красителями. Для снятия такой кривой спектр устанавливается в оптический денситометр, в котором производится сканирование - перемещение ее через падающий световой луч и регистрация интенсивности прошедшего или отраженного луча. Полученная таким образом кривая в виде последовательности пиков подвергается аналого-цифровому преобразованию и последующей математической обработке [3, с.72-74]. Рассчитываются площади пиков Αι: здесь хнi. xki - координаты начала и конца 1-того пика; Di(x) - значение оптической плотности в измеряемой точке электрофореграммы, которая пропорциональна количеству вещества (белка). Процентное содержание отдельных веществ в смеси Κ i определяют по формуле: Разрешающая способность денситометра определяется шагом квантования -минимальным расстоянием между двумя точками спектра, для которых независимо друг от друга может быть измерено пропускание, а, затем, рассчитаны значения оптической плотности. Повышение разрешающей способности увеличивает число измеряемых точек, а следовательно, и исходных данных для расчета, тем самым существенно снижая его погрешность [4, с.301-329]. Вместе с тем, это влечет за собой увеличение объема вычислений, что требует увеличения памяти вычислительного устройства. Из известных оптических денситометров для анализа спектров наиболее близким по технической сути является денситометр [3, с.72-76], содержащий источник света и жестко соединенный с ним основной фотоприемник, между которыми расположен облучаемый элемент в виде устройства сканирования, установленный с возможностью перемещения относительно источника света, при этом основной фотоприемник присоединен к прямому или дифференциальному входу согласующего усилителя, выход которого подключен ко входу аналого-цифрового преобразователя и блок управления, выход которого подключен к устройству сканирования. Денситометр дополнительно содержит светофильтр, установленный между источником света и устройством сканирования, и встроенный микропроцессор, подключенный к выходу аналого-цифрового преобразователя. Денситометр работает следующим образом. Луч света от источника света, пройдя сквозь светофильтр и измеряемый спектр, попадает на фотоприемник, который преобразует световой поток в электрический ток, пропорциональный величине пропускания сканируемого участка спектра. Согласующий усилитель преобразует этот ток в напряжение, поступающее в аналого-цифровой преобразователь, где оно преобразуется в двоичный цифровой код. Информация в цифровой форме обрабатывается встроенным микропроцессором, работающим по жесткой программе. В его память вводятся координаты кривой, причем координате X соответствует расстояние от точки старта до точки измерения, а координате Υ - величина оптической плотности, измеренная в этой точке. При этом производится квантование сигнала с шагом 0,1 мм. Максимальное количество точек, вводимых в память микропроцессора, по которым происходит обработка результатов измерения, - 256. Микропроцессор рассчитывает распределение оптической плотности, производит коррекцию базовой линии (уровень оптической плотности фона), логарифмирование сигнала, интегрирование кривой и отдельных пиков, определение границ пиков, соответствующее отдельным фракциям, вычисление результатов и их регистрация, вывод кривой на самопишущий прибор. Недостаток данного денситометра состоит в большой погрешности определения Κι, которая обусловлена следующими факторами: - малой разрешающей способностью, обусловленной большим шагом квантования, а следовательно, ограниченным количеством измеряемых точек, не позволяющим повысить точность вычислений; - отсутствием схемы прецезионного независимого позиционирования координаты X, что не позволяет исключить погрешность, вносимую неточностью перемещения устройства сканирования, а именно отсутствием точного сопоставления величин измеренной оптической плотности координатам X тех точек спектра, для которых они определяются; - отсутствием схемы учета нестабильности получения источника света, что повышает вероятность случайных искажений считываемого сигнала; - конечной шириной спектра пропускания светофильтра, что повышает вероятность попадания в считываемый сигнал информации о посторонних примесях, имеющих спектр поглощения, близкий к спектру поглощения определяемых веществ [4, с.48-50]. В прототипе не предусмотрена возможность измерения оптической плотности спектров на непрозрачных подложках. В основу изобретения поставлена задача совершенствования оптического денситометра для анализа спектров путем увеличения количества точек измерения оптической плотности спектра при точном определении их позиции, учета нестабильности излучения источника света, что обеспечивает уменьшение погрешности измерения оптической плотности и за счет этого повышение точности количественной обработки спектров на подложках. Поставленная задача решается тем, что оптический денситометр для анализа спектров, содержащий источник света и жестко соединенный с ним основной фотоприемник, между которыми расположен облучаемый элемент в виде устройства сканирования, установленный с возможностью перемещения относительно источника света, при этом основной фотоприемник присоединен к прямому или дифференциальному входу согласующего усилителя, выход которого подключен ко входу аналого-цифрового преобразователя, и блок управления, выход которого подключен к устройству сканирования, согласно изобретению дополнительно содержит по меньшей мере два оптических элемента, первый из которых жестко соединен с устройством сканирования и содержит последовательность оптических неоднородностей. расположенных не перпендикулярно направлению сканирования, а второй жестко соединен с источником света и содержит по меньшей мере одну оптическую неоднородность, не перпендикулярную каждой оптической неоднородности первого оптического элемента, вспомогательный фотоприемник, подключенный к блоку управления и жестко соединенный с источником света так, что между ними находятся оба оптических элемента, опорный фотоприемник, подключенный к дифференциальному или прямому входу согласующего усилителя, жестко соединенный с источником света и расположенный между ним и устройством сканирования, оптический расщепляющий элемент, расположенный между источником света и устройством сканирования, причем дополнительный выход блока управления соединен с пусковым контактом аналогоцифрового преобразователя. В денситометре, согласно изобретению, по меньшей мере первый оптический элемент представляет собой дифракционную решетку. В денситометре, согласно изобретению, оптический расщепляющий элемент представляет собой оптический клин. Денситометр, согласно изобретению, дополнительно содержит вспомогательный источник света, жестко связанный со вспомогательным фотоприемником и расположенный так, что между ними находятся первый и второй оптические элементы. Денситометр, согласно изобретению, дополнительно содержит оптический собирающий элемент, а также второй основной фотоприемник, жестко связанные с источником света и расположенные между ним и устройством сканирования, причем второй основной фотоприемник подключен к прямому входу согласующего усилителя через дополнительный переключатель. В денситометре, согласно изобретению, в качестве по меньшей мере одного источника света используется лазер. Данный денситометр имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом. Элементы с оптическими неоднородно-стями (дифракционные решетки) образуют основу схемы прецизионного независимого позиционирования координаты X. Ее использование позволяет значительно уменьшить шаг квантования, увеличив при этом количество точек измерения оптической плотности, и, следовательно, повысить разрешающую способность прибора по сравнению с прототипом. Шаг квантования определяется периодом используемых оптических элементов ^дифракционных решеток), который должен быть не меньше длины волны основного или вспомогательного источника излучения. Так как в оптических денситометрах используются источники света с длинами волн по меньшей мере 0,0002 мм, то минимальная величина периода дифракционных решеток имеет то же значение. Таким образом, шаг квантования предлагаемого денситометра составляет по меньшей мере 0,0002 мм, в то время как в прототипе он равен 0,1 мм. Следовательно и число точек измерения, используемых для обсчета может быть в несколько сотен раз большим, чем у прототипа. Квантование сигнала производится не задающим генератором, или каким-либо внешним устройством, а самим устройством сканирования. При его перемещении вместе с жестко связанной с ним первым оптическим элементом (дифракционной решеткой) вдоль второго оптического элемента (дифракцинной решетки) луч основного или вспомогательного источника света, который проходит через оба оптических элемента и падает на вспомогательный фотоприемник, модулируется таким образом, что блок питания генерирует управляющие импульсы, которые запускают аналого-цифровой преобразователь. Схема прецизионного независимого позиционирования координаты X позволяет исключить погрешности, связанные с неточностью относительного перемещения устройства сканирования, так как собственно измерение оптической плотности производится только в течение каждого управляющего импульса. При этом сканируется участок спектра не длиннее одного периода оптических элементов (дифракционных решеток), т.е. по меньшей мере 0,0002 мм. Так как эта величина на 5-6 порядков меньше длины всего сканируемого спектра, то этот участок можно считать точкой. Значение координаты X измеряемой точки определяется только соответствующим ей количеством управляющих импульсов, выработанных блоком управления с момента старта, а не точностью перемещения устройства сканирования. Таким образом, каждому значению измеренной оптической плотности спектра сопоставлена координата X той точки, в которой эта оптическая плотность измерена с точностью до размера одной оптической неоднородности первого и второго оптических элементов (периода решеток). Кроме того, в денситометре можно использовать любой привод устройства сканирования и, даже, перемещать его вручную без увеличения погрешности. В качестве источника света используется лазер, излучение которого строго монохромное, что уменьшает вероятность в попадания в считываемый сигнал информации о посторонних примесях со спектрами поглощения, близкими к спектру поглощения определяемых веществ. Прибор содержит схему учета нестабильности излучения источника света, что устраняет вероятность случайных искажений считываемого сигнала, вызванных нестабильностью излучения источника света. Для обсчета кривой используется не встроенный процессор с ограниченными возможностями, работающий по жесткой программе, а любой внешний компьютер с любым программным обеспечением, которое имеется в достаточном количестве. Это позволяет значительно расширить диапазон возможностей денситометра, в том числе и за счет дополнительного снижения погрешности программными средствами. В данной разработке за счет использования новых технических решений удалось значительно уменьшить погрешность определения Κι по сравнению с прототипом. По мнению автора, заявляемое техническое решение соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень", так как оно является новым и не следует явным образом из известного уровня техники. Испытания опытного образца предлагаемого денситометра показали, что его абсолютные погрешности меньше погрешностей прототипа [3, с.74-75]. Данные приведены в сравнительной таблице. Конкретный пример выполнения изобретения представлен на чертеже. Оптический денситометр содержит источник света - лазер 1; оптический расщепляющий элемент оптический клин 2; цилиндрическую линзу 3; призму 4; оптический собирающий элемент - сферическое зеркало 5; спектр 6, расположенный на устройстве сканирования 7; основные фотоприемники: первый 8, второй 9; переключатель 10; опорный фотоприемник 11; плоское зеркало 12; первый оптический элемент дифракционную решетку 13; второй оптический элемент - дифракционную решетку 14; вспомогательный фотоприемник 15; микродвигатель 16; ходовой винт 17; гайку 18; согласующий усилитель СУ; блок управления БУ; аналого-цифровой преобразователь АЦП; панель управления ПУ. Данный денситометр работает следующим образом. Луч лазера 1 проходит через оптический клин 2, цилиндрическую линзу 3, призму 4, отверстие в сферическом зеркале 5 и попадает в спектр 6, который лежит на устройстве сканирования 7. Если спектр 6 выполнен на прозрачном носителе, то луч, пройдя сквозь нее и специальное отверстие в устройстве сканирования 7, попадает на первый основной фотоприемник 8. Если спектр 6 выполнен на непрозрачном носителе, то отраженный от нее луч, претерпев диффузное рассеяние, собирается оптическим собирающим элементом - зеркалом 5 и концентрируется на втором основном фотоприемнике 9. Луч лазера 1 изначально имеет круглое сечение с диаметром порядка 0,5-3 мм. Пройдя, через цилиндрическую линзу 3, он растягивается в полосу. Попадая в призму 4, за счет полного внутреннего отражения от ее наклонной плоскости, он поворачивается на 90°. Поворот луча предусмотрен для того, чтобы иметь возможность расположить лазер горизонтально, уменьшив габариты прибора. Кроме того это позволяет использовать лазеры любой мощности и габаритов. Нижняя грань призмы 4 имеет криволинейную поверхность, которая, выполняя роль цилиндической линзы, сжимает луч, уменьшая его поперечный размер. На спектр падает плоский луч толщиной 0,001-0,05 мм. Ослабленный спектром луч, попадая на фотоприемник 8 или 9, возбуждает в них фототок И, который через переключатель 10 подается на прямой или дифференциальный вход согласующего усилителя. На его дифференциальный или прямой вход подается сигнал I2 от опорного фотоприемника 11, на который падает опорный луч, отраженный одной из поверхностей оптического клина 2. В данном конкретном примере СУ выполнен таким образом, что оба сигнала в нем усиливаются, и выполняется их сравнение по формуле: где I - выходной сигнал; к - коэффициент, который определяется параметрами усилителей и учитывается при калибровке прибора. Формула (3) эквивалентна выражению для определения оптической плотности как логарифма отношения интенсивностей проходящего и падающего света. Таким образом, выходной сигнал пропорцинален величине оптической плотности, что делает его пригодным для обсчета с помощью любого программного обеспечения. Величина выходного сигнала согласующего усилителя определяется результатом сравнения интенсивности ослабленного спектром основного луча с интенсивностью опорного луча, играющего роль эталона. Таким образом, в выходном сигнале СУ отсутствуют любые составляющие, вызванные изменением яркости источника света. Выходной сигнал СУ подается на аналоговый выход денситометра, где может быть считан показывающим прибором или усилителем "Υ" самопишущего прибора, и на блок аналого-цифрового преобразователя, где он преобразуется в двоичный код. Схема независимого позиционирования координаты X с использованием дифракционных решеток действует следующим образом. Вспомогательный луч, отраженный от второй поверхности оптического клина 2, поворачивается в горизонтальную плоскость зеркалом 12, проходит через дифракционные решетки 13 и 14 и падает на вспомогательный фотоприемник 15. Подвижная дифракционная решетка 13 жестко закреплена на устройстве сканирования 7, неподвижная решетка 14 - на корпусе денситометра. Вспомогательный луч, пройдя сквозь дифракционную решетку 13, подвергается дифракции на ее оптических неоднородностях, образуя интерференционную картину, которая, в свою очередь дифрагирует на оптических неоднородностях дифракционной решетки 14. Из-за изменяющейся разности фаз интерференционных картин, которая возникает во время движения устройства сканирования, интенсивность максимумов результирующей интерференционной картины (кроме нулевого) колеблется по гармоническому закону. Следовательно, также колеблется и фототок фотоприемника 15. Период колебаний определяется размерами оптических неоднородностей (периодом дифракционных решеток) таким образом, что максимум возникает каждый раз, когда устройство сканирования со спектром проходит расстояние соответствующее размеру одной неоднородности (периоду решеток). Каждому максимуму гармонической кривой соответствует определенное положение устройства сканирования 7. Гармонический сигнал от фотоприемника 15 поступает в блок управления (БУ), где он преобразуется в двоичную последовательность управляющих импульсов, определяющих шаг квантования, который имеет минимальную величину 0,0002 мм. Начало каждого импульса соответствует прохождению устройством сканирования расстояния, соответствующее размеру одной неоднородности (периоду решеток). Блок управления подает эти импульсы на пусковой контакт аналогоцифрового преобразователя. При подаче импульса последний переходит из режима ожидания в режим преобразования. Таким образом, замер (объем цифровой информации) оптической плотности спектра происходит каждый раз, как только спектр пройдет расстояние, соответствующее размеру одной неоднородности (периоду решеток). Причем, имеет место точное сопоставление величин оптической плотности спектра координатам X тех точек, для которых она определяется. Длина области спектра, в которой измеряется оптическая плотность после каждого запуска аналого-цифрового преобразователя не превышает размера одной неоднородности (периоду решеток), т.е. 0,0002 мм. Сумма управляющих импульсов, при известном соответствии каждого размеру одной оптической неоднородности первого и второго оптических элементов (периоду решеток), однозначно определяет расстояние, пройденное устройством сканирования с момента старта, т.е. координату X измеряемой области спектра с максимальной точностью 0,0002 мм. БУ суммирует управляющие импульсы и выдает сумму на аналоговый выход координаты X. С него сигнал, величина которого точно соответствует положению устройства сканирования 7, подается на усилитель "Y" самопишущего прибора. Следовательно, позиционирования координаты X зависит не от точности выполнения схемы сканирования, а только от положения устройства сканирования 7. Это делает возможным использование привода и передач любого типа, или перемещение спектра вручную. Управление денситометром производится с панели управления (ПУ). При подаче с нее команды "Пуск" БУ подает постоянное напряжение на микродвигатель 16, который посредством ходового винта 17 и гайки 18 приводит в движение устройство сканирования 7. Скорость перемещения задается с ПУ величиной напряжения. По мере его продвижения в счетчиках БУ производится подсчет и накопление управляющих импульсов. При достижении определенного их количества, заданного посредством переключателей с ПУ (определенной длины хода устройства сканирования 7), переключается полярность микродвигателя 16, и устройство сканирования движется в обратную сторону. При этом управляющие импульсы вычитаются из ранее накопленных. Когда устройство сканирования возвращается на исходную позицию, т.е. количество накопленных импульсов становится равным нулю, питание с микродвигателя 16 снимается и его контакты замыкаются. Управляющие импульсы подаются на аналого-цифровой преобразователь (АЦП). Начало каждого импульса является началом преобразования аналогового сигнала. Окончание импульса - окончание преобразования. Таким образом, информация на выход АЦП подается дискретно: каждому импульсу (каждому положению устройства сканирования 7) соответствует свое значение оптической плотности. Считывание оптической плотности производится с минимальным шагом квантования 0,0002 мм. Максимальное число точек, по которым обсчитывается кривая, определяется выражением 1_/0,0002, где L длина спектра. Например, для обсчета спектра длиной 100 мм будет использовано до 100/0,0002 - 500000 точек, а не 256 как в прототипе. Максимальное число точек определяется длиной спектра и ограничено только емкостью оперативной памяти используемого компьютера. Положение каждой измеряемой точки определяется количеством запусков АЦП с момента старта при известном соответствии каждого управляющего импульса размеру одной оптической неоднородности первого и второго оптических элементов (периоду решеток). Логарифмированный квантованный сигнал в цифровой форме подается на вход внешнего компьютера для последующей обработки с помощью любого программного обеспечения. При этом может быть рассчитано распределение оптической плотности, произведена коррекция базовой линии, интегрирование кривой и отдельных пиков, определение границ пиков, соответствующее отдельным фракциям, вычисление результатов и их регистрация, вывод кривой и результатов расчета на печать. Причем погрешность определения содержания белков может быть дополнительно уменьшена за счет применения методов математической статистики [4]. Денситометр может быть изготовлен с использованием существующего оборудования и материалов на приборостроительных заводах.