Вакцина ротавірусна інактивована для імунізації тварин

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению инактивированных вакцин для иммунизации животных, и может быть использовано для специфической профилактики рота вирусного гастроэнтерита. Известна инактивированная ротавирусная вакцина для пассивной иммунизации телят против ротавирусного гастроэнтерита [1]. Вакцина состоит из ротавируса крупного рогатого скота с биологической активностью 3-10 ЦПД 50/мл и содержит формалин в качестве инактиватора в конечной концентрации от 0,05 до 0,10% и бисульфат натрия. Перед введением вакцины животным (коровам) в нее добавляют адъювант - водно-масляную эмульсию, что повышает ее иммуногенность. Как следует из технической сущности, известная техническая вакцина является токсичной, так как практически нельзя достичь полной инактивации формалина, который является токсичным для микроорганизмов; обладает низкой иммуногенностью, что обусловлено необходимостью введения в нее адьюванта, действие которого направлено на повышение иммуногенности и характеризуется нестабильностью при хранении, т. к. известно, что стабильность ротавирусных вакцин не превышает 24 месяца. Наиболее близкой к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является ротавирусная вакцина, содержащая ротавирус обезьян SA-11, инактивированный формалином /WO 94/01134. кл. А 61 К 39/42, 20.04.94/ [2]. Для вакцины [2] присущи те же недостатки, что и для вакцины [1]: токсичность, низкая иммуногенность, нестабильность при хранэнии. Подтверждением указанных свойств вакцины [2] служат данные, полученные при исследовании ротавирусной вакцины с использованием вирусного материала, полученного нами из штамма ротавируса обезьян SA-11 с антигенной активностью 1:1024 в ΡΗΓΑ (реакции непрямой гемагглютинации) ГАЕ/0,25 мл и биологической активностью 105· ЦПД 50/мл. Вакцину готовят путем добавления к вирусному материалу формалина до конечной концентрации 0,1% и последующей инактивации вируса в течение 72 часов при 37°С. Полученную формалинизированную вакцину испытывают на иммуногенность у кролей и стабильность ротавирусных антигенов при хранении. Результаты приведены в табл. 1, где о тражены основные свойства вакцины. Как следует из данных табл. 1, ротавирусная вакцина, полученная из вируса с высокой антигенной активностью, обладает низкой иммуногенностью против ротавирусного гастроэнтерита, выраженной титром антиротавирусных антител в РТНГА (реакции торможения непрямой гемагглютинации), равном 1:640; характеризуется невысокой стабильностью, составляющей всего 24 месяца и является токсичной. К недостаткам получения известной вакцины следует отнести довольно большую продолжительность ее получения, обусловленную медленным протеканием инактивации вируса формалином. В основу изобретения поставлена задача разработки состава ротавирусной инактивированной вакцины для иммунизации животных, состоящей из штамма ротавируса обезьян SA-11 и производного платины (II) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), что позволяет получить вакцину нетоксичную, характеризующуюся высокой иммуногенностью против рота вирусного гастроэнтерита и стабильностью при минимальных затратах времени на ее получение. Для решения поставленной задачи предложена вакцина ротавирусная инакти-вированная для иммунизации животных, содержащая вакцинный штамм ротавируса обезьян SA-11 и производные платины (II) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) общей формулы [1]: при следующем соотношении компонентов, мас.%: Система, состоящая из штамма ротавируса обезьян SA-11 и заявляемых производных платины (II) с полианионом ДНК, обеспечивает формирование иммуностимулирующего комплекса "ротавирусные протективные антигены - производные платины (И) с полианионом ДНК". Комплекс обеспечивает эффективную инактивацию вируса, усиливает иммуногенность и повышает стабильность вакцины при значительном сокращении времени получения нетоксичной инактивированной вакцины. Производные, платины (II) с польанио-ном ДНК известны [Патент ЕР № 0374267, кл. А 61 К 35/28, 31/555, 1990]. Данные соединения синтезированы для применения в качестве действующего ве щества лекарственного препарата противоопухолевого действия. Соединения платины не обладают иммунодепрессивным действием и не являются токсичными в концентрациях, используемых для приготовления вакцины (полулегальная доза ЛД50 равна 102 мг/кг тела), в то время, как на одну иммунизацию животного расходуется максимально 144 мг. Согласно изобретению, полученная вакцина является нетоксичной, обладает высокой иммуногенностью, характеризуемой титрами антител в РТНГА на уровне 1:16400, повышенной стабильностью, характеризуемой постоянством величин титров антиротавирусных антител в РТНГА в течение не менее 40 месяцев при стандартных условия х хранения. Вакцину готовят следующим образом. Культуру клеток, например Vero, инфицируют ротавирусом обезьян группы А с антигенной активностью (1:64)-(1:1024) ΡΗΓΑ ГАЕ/0.25 мл и биологической активностью 1·105·51·107·5 ЦПД/50 мл, активированным трипсином. Информационные клетки инкубируют при 37°С в течение 48 часов, а затем разрушают информационные клетки трехкратным замораживанием и оттаиванием для увеличения выхода вируса. Затем вирусный материал осветляют при низкоскоростном центрифугировании и вводят во взаимодействие с производным платины (II) с полианионом ДНК, термостатируют при 37°С не менее 90 мин для инактивации вируса. В качестве производных платины (II) с полианионом ДНК общей формулы: используют следующие соединения: Соединение I при поли{гексакис[хлораминдиакваплатина (II)]}-μ-дезоксирибонуклеат формулы х=0, у=12, m=6n, соединение II при х=2· y=10; m=4n; r=6; поли{бис{гидроксохлораминакваплатина тетракис[хлороаммндиакваплатина (II)}- μ -дезоксирибонуклеат формулы г=6; (II) Соединения I, II, III представляют собой мелкокристаллические порошки желтого цвета, без запаха, устойчивые на воздухе, способные в течение года храниться без изменения свойств. Полученный конечный продукт представляет собой инактивированную ротавирусн ую вакцину для иммунизации сельскохозяйственных животных против ротавирусного гастроэнтерита и имеет следующий ингредиентный состав, мас.%: Серии полученной ротавирусной вакцины испытывали на иммуногенность, токсичность, стерильность, безопасность и стабильность. Иммуногенность вакцины - специфическая активность, исследуют в лабораторных теста х с эритроцитарным ротавирусным диагностикумом фирмы "Ростэпидкомплекс" в реакции торможения непрямой гемагглютинации и выражают титрами антиротавирусных антител в РТНГА [Зарубинский В. Я., Колпаков С. А. Применение реакции непрямой гемагглютинации для диагностики ротавирусного гастроэнтерита// Вопр. вирусологии, - 1989, № 2, - С. 250-253]. Стабильность вакцины - характеризуется временем, в течение которого сохраняется постоянным величина титра антиротавирусных антител в РТНГА. Токсичность вакцины - определяется стандартным методом и оценивается по цитотоксическим дозам ЦТД 50/мл. Безопасность вакцины -характеризуется отсутствием инфекционной активности в культуре клеток и определяется по ЦПД 50/мл. Стерильность вакцины - характеризуется отсутствием роста м/о при посеве на сахарный бульон, ΜΠΑ, среду Сабуро [Общие требования, предъявляемые к стерильности биологических препаратов // Требования к биологическим препаратам, № 6 - Wld. Hlth Org. techn. Rep. Ser., 1972, № 486]. Пример. Взвесь культуры клеток Vero в ростовой питательной среде, состоящей из основной среды Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в посевной концентрации 300 тысяч клеток на мл вносят в сосуды для культивирования и выращивают в стационарных условиях до образования в них монослоев. Затем культуральную среду из сосудов удаляют и вносят на монослой посевной ротавирус обезьян штамма SA-11, активированный трипсином, в конечной концентрации 10 мкг на 1 мл вирусной суспензии, с антигенной активностью 1024 в ΡΗΓΑ ГАЕ/0,25 мл и биологической (инфекционной) активностью 105,5 ЦПД 50/мл. Адсорбцию вируса проводят в течение 2 часов при температуре 37°С. Затем неадсор-бировавшийся вирус удаляют, а монослои клеток дважды отмывают любым сбалансированным солевым раствором, например, раствором Хенкса. После чего в сосуды добавляют среду для размножения вируса, состоящую из стандартной основной среды Игла и трипсина (конечная концентрация трипсина в среде 1 мкг/мл). Инфицированные культуры инкубируют при 37°С в течение 48 часов. После окончания инкубирования остатки клеточного монослоя вместе с вирусосодержащей жидкостью подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию, собирают вирусосодержащий материал и освобождают его от обломка клеток центрифугированием при 1000g в течение 20 минут, Затем к 100 мл осветленной вирусной суспензии добавляют 10 мл раствора поли{гексакис[хлороаминакваплатины (II)]}-μ-дезоксирибонуклеата (соединение Ill) в конечной концентрации 0,2136 мг/л (в пересчете на платину) и инкубируют при 37°С в течение 90 минут. Полученный продукт представляет собой инактивированную ротавирусную вакцину при следующем соотношении компонентов, мас. %: Вакцина нетоксична, безопасна, стерильна, обладает иммуногенностью 1:16400 РТНГА у кролей, стабильна в течение 40 месяцев (табл. 2, пример 5). В табл. 2 отражены составы вакцин, полученные с использованием ротавируса обезьяны SA-11, обладающие различной антигенной активностью, и содержащие производные платины (II) с полианионом ДНК, количество которых находится как в заявляемом диапазоне, так и за его пределами. Установлено, что количественный и качественный состав вакцины выбран из условий, обеспечивающих полную инактивацию ротавируса обезьян SA-11, иммуногенность у кролей и стабильность вакцины при минимальном времени инактивации вируса (табл. 2, примеры 1-19). Оптимальным с точки зрения достижения технического результата является содержание в вакцине производных платины (II) с полианионом ДНК в диапазоне (5,3-81) χ χ 10"3% мае. (в пересчете на платину). Содержание в вакцине производных платины (II) с полианионом ДНК ниже заявляемого предела, даже при использовании ротавируса обезьян SA-11 с высокой антигенной активностью, не обеспечивает вакцине стерильность, безопасность и высокую иммуногенность против ротавирусного гастроэнтерита: титр антиротавирусных антител в РТНГА составляет всего 1:640, что находится на уровне, достигаемом известной вакциной (табл. 2, пример 21). Верхний предел содержания в вакцине производных платины (II) с полианионом ДНК ограничен тем, что дальнейшее увеличение не способствует улучшению качества вакцины и является нецелесообразным (табл. 2, пример 22). Оптимальными значениями антигенной активности ротавируса SA-11, обеспечивающими высокую эффективность вакцины в заявляемом диапазоне содержания производных платины (II) с полианионом ДНК, является (1:64)-(1:1024) ΡΗΓΑ ГАЕ/0.25 мл. Использование ротавируса с антигенной активностью ниже заявляемого предела при максимальном содержании соединения III (платины) приводит к получению вакцины с низкой иммуногенностью: титр антивирусных антител составляет 1:1280, что практически соответствует иммуногенности известной вакцины (табл. 2, пример 20). Верхний предел величины антигенной активности ротавируса обезьян SA-11 ограничен биологическими свойствами системы "вирус-клетка". Экспериментально установлено, что в течение 1,5 ч достигается полная инактивация ротавируса обезьян SA-11 в присутствии производного платины (II) с полианионом ДНК в заявляемом диапазоне его содержания, что обеспечивает получение инактивированной вакцины. Уменьшение времени инактивации ротавируса приводит к получению вакцины, которая является опасной, т. к. содержит неинактивированный вирусный материал (табл. 2, пример 24). Увеличение времени инактивации ротавируса не сказывается на повышении качества вакцины и является нецелесообразным (табл. 2, пример 23). Данные табл. 3 поддерживают высокую иммуногенность предложенной ротавирус-ной вакцины при вакцинации различных видов животных. Преимущества предложенной рота вирусной инактивированной вакцины для иммунизации животных по сравнению с известной ротавирусной вакциной подтверждаются данными, представленными в табл. 1 и 2. Как следует из сопоставительного анализа качества и эффективности вакцин, предложенная вакцина превосходит известную по следующим показателям - по иммуногенности против ротавирусного гастроэнтерита в 6-25 раз, что выражается в увеличении титров антиротавирусных антител в 6-25 раз, например у кролей; - по стабильности приблизительно в 2 раза, что выражается в увеличении времени постоянства титров антиротавирусных антител приблизительно в 2 раза; - является нетоксичной. Данная вакцина, как и известная, является стерильной и безопасной. Кроме того, для получения данной вакцины требуется в 48 раз меньшие затраты времени за счет более быстрой и эффективной инактивации вируса. Следует подчеркнуть, что разработанная вакцина - ротавирусная инактивированная -соответствует основным направлениям создания современных вакцинных препаратов, состоящим в совершенствовании их композиций путем использования в составе иммуностимулирующи х комплексов (ИСКО-Мов).