Рекомбінатний імунотоксин і спосіб його одержання

Винахід стосується галузі медицини і може бути використаний для створення ліків. Новий напрямок, що народився майже десять років тому і який дістав активний практичний вихід за останній час, присвячено створенню лікарських засобів нової генерації, зміст якої полягає у безпосередній доставці ліків до клітини. В основу такого напрямку покладено особливість високо-афінної взаємодії комплексу "ліганд-рецептор", учасниками якого є, з одного боку, різноманітні ліганди, що є своєрідною "адресою" для посадки на рецептори, а з іншого - специфічний спектр рецепторних білків цитоплазматичної мембрани клітини, які мають відповідні ділянки, що "впізнають". Використання таких природних можливостей організмів дало передумови для розробки і створення ряду лікарських засобів білкової природи, т.з. fusion-білків, що мають специфічні адресні частини. Змінивши адресну частину, можна "примусити" потрібний рецептор клітини "впізнати" ліганд, що містить нову адресну частину, використовуючи т.з. феномен "адресної доставки". Найбільша перевага в цьому розумінні віддається бактеріальним токсинам, здатним пошкоджувати клітину господаря, тим або іншим чином викликаючи її загибель. Даний винахід стосується імунотоксину на основі білка, токсична частка якого представлена каталітичною і трансмембранною частками дифтерійного токсину (DT), а адресна частина - інтерлейкіном 2 людини (IL-2). Даний білок має як цитотоксичну дію по відношенню до клітин-продуцентів рецептора IL-2, так і імуносупресивну дію. Отже, він може бути застосований для лікування таких патологій, як T-клітинний лейкоз, лімфогранулематоз, різноманітні аутоімунні захворювання, в т.ч. діабет 1 типу, ревматоїдний артрит і т.п., а також при трансплантації органів і тканин. Найбільш дослідженим об'єктом, що несе сильний токсичний початок, є дифтерійний токсин (DT) з Corynebacterium diphtheriae. Він має три структурно-відокремлених домена, що володіють різноманітними функціями [2]. На фіг.1 представлено просторову структуру DT. Зокрема, каталітичний домен відповідає за ADP-рибозилювання фактора елонгації 2, що призводить до порушення роботи білоксинтезуючого апарата клітини і, в подальшому, до її загибелі. Трансмембранний домен несе гідрофобні, мембранноасоційовані ділянки, що проникають через мембрану; він потрібний для транслокації каталітичної частки токсину в цитозоль клітини. Рецепторний домен служить для впізнання токсину клітиною через відповідні поверхові рецептори, проникаючи в клітину у відповідь на зниження pH в ендосомі [1.3]. В нормі таким рецептором є гепарин-зв'язуючий епідермальний фактор зростання (HB-EGF-like) [4]. Послідовне розташування всіх доменів представлено на фіг.2. До нинішнього моменту у світі накопичено досить широкий матеріал, що стосується як структурних, так і функціональних особливостей рекомбінантних імунотоксинів, у тому числі створених і на основі дифтерійного токсину. Різноманітність генетичних форм химерних токсинів зумовлена пошуком найбільш оптимальної конструкції як з точки зору її токсичності, так і високої афінності взаємодії з рецептором. В зв'язку з цим існуючі рекомбінантні токсини відрізняються, по-перше, адресною частиною, по-друге, якістю точкових амінокислотних замін, спрямованих на підвищення активності знову синтезованого білка і, потретє, довжиною лінкеру, що з'єднує ферментно-трансмембранну частину токсину з "новою" адресою. Відомі імунотоксини на основі DT, в яких N-термінальний фрагмент токсичної частини представлений двома першими доменами і характеризується, в основному, двома варіантами послідовностей, довжиною 389 і 486 амінокислотних залишків. Крім адресних частин, вони відрізняються довжиною лінкеру, що з'єднує трансмембранний домен DT і знов приєднану послідовність адреси [5]. Найбільш близьким за технічною суттю і результатом, що досягається, до запропонованого винаходу є рекомбінантний імунотоксин на основі DT і IL-2, в якому токсична (каталітично-трансмембранна) частина (DT) має довжину 389 амінокислот та спосіб його одержання, який полягає в конструюванні плазміди рДТІ23, і клонування фрагмента послідовності інтерлейкіну 2 [6]. У вищезазначеному технічному вирішенні для експресії та нароботки злитого білка використовувався штам-продуцент на основі E.coli. Однак, це може потягти за собою ряд проблем. По-перше, використання тілець включення для експресії створює чисто технологічні труднощі, що стосуються виділення, очищення і стабільності химерного білка. По-друге, як грам-негативна бактерія оболонка E.coli містить токсичні ліпополісахариди, якими може забруднюватися препарат. Крім того, система протеолізу в E.coli налаштована на розпізнання "свій-чужий", тому існує висока ймовірність протеолітичного розщіплення гібридного білка, що тягне за собою сегрегаційну і структурну нестійкість і, як наслідок, зниження продуктивності рекомбінантної популяції. Завданням данного винаходу є створення злитого білка DT-IL2 та розробка способу його одержання, що дозволяє забезпечити високу токсичність і здатність секретуватися у позаклітинний простір. Поставлене завдання вирішується рекомбінантним імунотоксином, що описується та який містить каталітичну і трансмембранну частки дифтерійного токсину довжиною 482 амінокислоти і адресну частину, представлену інтерлейкіном 2 людини і який має амінокислотну послідовність: Поставлене завдання вирішується також описуваним способом одержання рекомбінантного імунотоксину DT-IL2, який містить конструювання гібридної плазміди на основі вектора pBR 322 по сайтах рестрикції EcoRI-Hindlll, точковий мутагенез для одержання ApaLI сайта в районі 482 амінокислотного залишку DT шляхом заміни останнього тиміну в сайті gtgcat на цитозин, модифікацію білок-синтезуючого апарату штаму-продуцента PW8 уведенням необхідної тРНК, що зв'язує утворену тРНК з лейциновим кодоном cta IL2, клонування фрагмента послідовності IL2 по сайтах ApaLI-ApaLI з наступним уведенням одержаного фрагмента в ApaLI-сайт вектора pSUL17M, сортування, клонування і відбір канонічних клонів, що містять шуканий рекомбінантний імунотоксин DT-IL2. Створення винаходу грунтується на вивченні довжини лінкеру імунотоксину, яке дозволило зробити висновок, що він не повинен бути занадто великим, тому що дещо змінена трьохвимірна структура імунотоксину в результаті приєднання "чужого" домену може сприяти посиленню протеолітичної деградації імунотоксину. Для двох відомих варіантів рекомбінантних токсинів довжина такого лінкеру складає 2 і 99 амінокислот відповідно. При конструюванні також необхідно було врахувати, що лінкерна ділянка не повинна містити сайта, відповідального за зв'язування з рецептором до нативного дифтерійного токсину (дикого типу). Така ділянка починається в районі 482 залишку. Таким чином конструкція, що пропонується, названа DT482-IL2, містить більш короткий лінкер, що сприяє, з одного боку, більшій стійкості до протеазів, а з іншої - дозволяє адресній частині бути більш гнучкою, що сприяє підвищенню афінності взаємодії з рецептором. Більш того, запропонована конструкція, на відміну від відомої, дозволяє зберегти каталітичне важливі амінокислотні залишки, Ser466 і Агд458, які є невід'ємною частиною активного центру. Таким чином, винахід, що пропонується, має такі переваги перед існуючими аналогами, у тому числі прототипом. По-перше, лінкер характеризується збереженням всіх амінокислотних залишків, необхідних для виконання каталітичної функції активного центру. По-друге, продуцент, обраний нами для нароботки злитого білка, є більш переважним, ніж E.coli. Зокрема, імунотоксин, що синтезується, секретується у позаклітинний простір, що технологічно більш ефективно, і крім того, штам PW8, що використовується, дозволений для промислового застосування. На фіг.1 показана трьохвимірна структура дифтерійного токсину, виконана з використанням програмивізуалізатора WebLab Viewer [7] (координати атомів взяті з Брукхевенського банку даних [8]. На фіг.2 трьох-доменна організація дифтерійного токсину: C-каталітичний, T-трансмембранний, R-peцепторний домени відповідно. Числа вказують номери амінокислот, відповідні доменам. Нумерація амінокислотних залишків відповідає зрілому білку, що не має сигнальної послідовності (перші 25 залишків не беруть участі в нумерації). На фіг.3 дана первинна послідовність рекомбінантного білка. Сигнальну послідовність виділено курсивом, інтерлейкінову частину - дрібним шрифтом. Кращий варіант здійснення винаходу. Спосіб конструювання злитого білка DT482-IL2 має такі стадії: 1. Отримання гібридної плазміди PSUL17. Після індукції бактеріофагу b налидиксовою кислотою було проведене виділення ДНК цього бактеріофагу, що містить повну послідовність дифтерійного токсину. Після обробки одержаної ДНК рестриктазами EcoRI-Hindlll проводять виділення фрагменту, кодуючого DT. На наступному етапі проводять уведення виділеного фрагменту ДНК DT в плазміду pBR322 по вказаних сайтах рестрикції для одержання гібридної плазміди pSUL17. 2. Точковий мутагенез для отримання АраLI сайта. З метою створення злитого білка DT-IL-2 і враховуючи структурно-функціональні особливості обох білків, використовують ApaLI сайт як "стикувальний вузол" між каталітично-трансмембранною частиною DT і IL-2. Останній має даний унікальний сайт на 5'-кінці. Що стосується послідовності DT, то в районі 482 залишку є ділянка gtgcat (Val482His483), у якій заміна одного нуклеотиду також призведе до одержання ApaLI сайта, gtgcac. 3. Модифікація білок-синтезуючого апарату штаму PW8. Оскільки як штам-продуцент використовують PW8 Corynebacterium diphtheriae, то необхідно врахувати особливості блок-синтезуючого апарату даного продуцента з метою подальшого безпомилкового синтезу злитого білка, що містить інтерлейкін-2 людини. Було з'ясовано, що пул лейцинових кодонів cta IL-2 є мінорним для Corynebacterium diphtheriae. В зв'язку з цим необхідно видозмінити білок-синтезуючий апарат, для чого уводимо у хромосому штаму-продуцента ген потрібної тРНК так, щоб тРНК, що утворюється, була здатна зв'язуватися з вищезазначеним кодоном. 4. Клонування кодуючого фрагмента послідовності IL-2. Після виділення тотальної мРНК IL-2 з культури тимоцитів людини проводять полімеразну ланцюгову реакцію, сполучену із зворотною транскрипцією (праймери 5'GTGCACCTACTTCAAGT3' i 3'GGGGTGCACTTAATTATCAAGTTAGTG 5'AMV-ревертаза, PFU-1-полімераза для ПЦР). Отримані амплікони обробляють рестриктазою ApaLI. Після виділення необхідного фрагмента ДНК проводять уведення ApaLI-ApaLI фрагмента в ApaLI-сайт pSUL17M. Отримані таким чином гібридні плазміди, що відрізняються напрямком вбудованого фрагмента, піддають сортуванню і клонуванню для відбору канонічних клонів, що містять шуканий злитий білок (pSUL178). 5. Проведення трансформації клітин потрійного лізогену PW8 по бактеріофагу b плазмідою pSUL178. 6. Здійснення селекції стабільних клонів, що секретують шуканий білок DT482-IL2. В результаті здійснення способу отримано цільовий продукт, що має амінокислотну послідовність, представлену на фіг.3. Таким чином, генно-інженерна конструкція, що пропонується, дозволяє одержувати злитий білок найбільш ефективним способом, який може бути легко адаптований до існуючих промислових технологій. Препарат DT482-IL2 має як протипухлинну активність, знищуючи малігнізовані T-клітини, так і імунносупресивною активністю, що може бути використане при лікуванні аутоімунних захворювань та трансплантації органів і тканин. Джерела інформації 1. Bell, C.E., Eisenberg, D. (1996) Crystal structure of diphtheria toxin bound to nicotinamide adenine dinucleotide. Biochemistry 35, 1137 - 1149. 2. Bennett, M.J., Choe, S. Eisenberg, D. (1994) Refined structure of dimeric diphtheria toxin at 2.0 A resolution. Protein Sci 3, 1444 - 1463. 3. London, E. (1992) How bacterial protein toxins enter cells: the role of partial unfolding in membrane translocation. Mol. Microb. 22, 3277 - 3282. 4. Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. (1995) Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015 - 1019. 5. Shaw, J.P., Akiyoshi, D.E., Arrigo, D., A., Rhoad, A.E., Sullivan, B., Thomas, J., Genbauffe, F.S., Bacha, P., Nichols, J.C. (1991) cytotoxic properties of DAB486EGF and DAB389EGF, epidermal growth factor (EGF) receptor-targered fusion toxins. J. Biol Chem. 266, 21118 - 21124. 6. Заявка RU №93055180, Бюл. №23, 1996. 7. WebLab Viewer; http://www.msi.com. 8. Bernstein, F.C., Koetzie, T.F., Williams, G.J.B., Meyer Jr. E.F., Brice, M.D., Rodgers, J.R., Kennard. O., Shimanouchi, T. and Tasumi, M. (1977) The Protein Data Bank: A computer-based archival file for macromojecular structures. J. Mol. Biol. 112, 535 - 542.