Спосіб виявлення специфічного алергену

Спосіб виявлення специфічного алергену, що полягає у фотоелектричному вимірюванні оптичної щільності цитратної крові в контрольному та дослідник зразках з попередньою інкубацією цих зраз 34280 завжди проводиться з урахуванням даних алергологічного анамнезу та клініки. З іншого боку, лабораторні методи діагностики надзвичайно важливі для постановки етіологічного діагнозу лікарської хвороби, оскільки з їх допомогою уявляється можливість із великої кількості призначених хворому медикаментів виявити конкретний лікарський препарат, винний у розвитку алергічного стану. Дня специфічної етіологічної діагностики алергічних захворювань і яскравого їх представника лікарської хвороби - застосовують різноманітні імунологічні та біофізичні способи виявлення специфічного алергену. Відомий спосіб виявлення специфічного алергену за допомогою тесту лімфобластичної трансформації, який полягає в культивації на середовищах 199 або Хенкса контрольних та дослідних зразків гепаринізованої периферичної крові в присутності стимулятора бластогенеза генеза фітгемаглютиніну (ФГА) протягом 3 днів відповідно з фізіологічним розчином і з алергеном, який підозрюється як специфічний. Потім готують зі зразків крові морфологічні препарати, або добавлять в зразки крові Н-тимідин. При оцінці результатів використовують морфологічний метод, або радіоімунний метод, при цьому в контрольному і дослідник зразкам підраховують кількість сенсибілізований лімфоцитів за кількістю трансформованих лімфоцитів у лімфобласти [3]. Недоліком цього способу при його виконанні є низька точність і велика тривалість виконання, обумовлені суб'єктивністю в разі морфологічного підрахунку результатів, а в разі підрахунку результатів зі включення мітки з Н-тимідином недолік способу полягає в необхідності мати стерильні бокси і радіоімунологічну лабораторію з гамма лічильником. Відомий також спосіб виявлення специфічного алергену з використанням методу альтерації лейкоцитів, який полягає в попередній інкубації протягом години при кімнатній температурі контрольних і дослідник зразків гепаринізованої крові відповідно з фізіологічним розчином або з алергеном, який підозрюється як специфічний, потім до зразків крові додають розчин акрідинового оранжевого і через 3-5 хвилин готують препарати на предметних скельцях у формі "живої краплі", при цьому кров прикривають покривним склом. Підрахунок реакції ведуть в темній кімнаті за допомогою люмінесцентного мікроскопу з використанням імерсійного об'єктиву. Підраховують кількість альтерованих лейкоцитів в контрольному і дослідних зразках і при різниці, більшій ніж 30%, реєструють існування сенсибілізації до алергену, який досліджується [4, 5]. Недоліком цього способу при його виконанні є низька точність, велика тривалість і складність виконання, обумовлені необхідністю мати спеціальну лабораторію, яку потрібно затемнювати, люмінесцентний мікроскоп, а головне, спеціально підготовлених кваліфікованих фахівців у зв'язку з тим, що спосіб не автоматизований, і тому не виключена суб'єктивність при підрахунку результатів. Відомі й інші способи виявлення специфічного алергену, наприклад, за допомогою методу інгбіції міграції лейкоцитів, прямого та непрямого тесту Шеллі, тромбоцитопенічного тесту, реакції мікро преципітації Уаньє, радіоалергосорбентного тесту визначення специфічного імуноглобуліну Е, тесту специфічного розеткоутворення, надслабкої хемілюмінесценції сироватки крові [6]. Однак майже всі ці імунологічні та біофізичні способи виявлення алергену дуже трудомісткі, тривалі за часом постановки, вимагають дефіцитних реактивів, дорогого обладнання, віварію (наприклад, непрямий тест Шеллі), забезпечення умов роботи в радіоімунологічних лабораторіях і відрізняються суб'єктивністю оцінок і низькою точністю результатів діагностики. Все це обмежує широке їх використання у клініці, тим більше при масовик обстеженням. Саме тому пошук експрес-методів виявлення сенсибілізації організму до специфічних алергенів, менш трудомістких, більш доступних і швидких за строками виконання та видачі результатів, є вельми актуальним і перспективним. Виявлена в останні роки відповідальність еритроцитів в механізмах розвитку алергічних реакцій, поруч із клітинними елементами білої крові [7, 8, 9], дозволила використати цю залежність при розробці способів експрес-діагностики алергії різної етіології [10]. Найбільш близьким до запропонованого, обраним як прототип, є спосіб виявлення специфічного алергену з використанням кислотних еритрограм, який полягає у фотоелектричному вимірюванні кінетики гемолізу еритроцитів під дією гемолітичної речовини з попередньою інкубацією цитратної крові з алергеном і без нього. Оцінка результатів здійснюється в умовних одиницях за різницею часу гемолізу еритроцитів у контрольному і дослідних зразках крові [11]. Недоліком цього способу при його виконанні є низька точність, велика ймовірність помилкового виявлення специфічного алергену та його невиявлення, тривалість і складність реалізації способу. В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб виявлення специфічного алергену, в якому шляхом дій, що забезпечують оцінку величини і швидкості седиментації еритроцитів за загальногруповими параметрами їх руху, забезпечив би підвищення точності і швидкості виявлення специфічного алергену, зниження ймовірностей помилкового виявлення специфічного алергену та його невиявлення, а також зниження складності реалізації способу. Можливість реалізації способу досягається шляхом реєстрації зображень кожного з осаджений еритроцитів і вимірюванні їх координат у процесі седиментації у динаміці, тобто у декількох послідовник моментах часу, визначенні загальногрупової координати, як середньої арифметичної від координат усіх зареєстрованих осаджених еритроцитів для кожного моменту часу, а також визначенні величини та швидкості седиментації еритроцитів як відношення змінення загальногрупової координати до інтервалу часу, за який воно сталося. Для цього готують контрольний і дослідні зразки цитратної крові шляхом додання до контрольного зразка фізіологічного розчину, а до дослідник зразків - алергенів, які підозрюються як специфічні і винні у розвитку алергічного стану. Далі ці зразки інкубують при кімнатній температурі, центрифугують і одночасно опромінюють джерелом випромінювання у видимому діапазоні світлових хвиль. 2 34280 Промодульований кожним із зразків світловий потік реєструють приймачем випромінювання, і, таким чином, виявлять еритроцити в зразках, а також їх місцезнаходження (координати). Поставлена задача вирішується тим, що в способі виявлення специфічного алергену з використанням кислотних еритрограм, який полягає у фотоелектричному вимірюванні кінетики гемолізу еритроцитів під дією гемолітичної речовини з попередньою інкубацією еритроцитів з алергеном і без нього, додатково, з метою підвищення точності, зниження імовірностей помилкового виявлення специфічного алергену та його невиявлення, зменшення тривалості й складності діагностики, здійснюють центрифугування досліджуваної цитратної крові і при цьому одночасно вимірюють координати кожного з виявлених у ній еритроцитів, далі у динаміці для кожного моменту вимірювання визначать загальногрупову координату усіх виявлених еритроцитів як середнє значення їх координат, причому величину седиментації еритроцитів і її середню швидкість оцінюють за зміненням положення загальногрупової координати, після чого визначають показник відношення величини седиментації еритроцитів і її середньої швидкості у контрольному та дослідних зразкам, і при відміні цього показника від одиниці на 30% і більше виявлений алерген розцінюють як специфічний. Суть запропонованого способу полягає в наступному. Досліджувану цитратну кров, попередньо інкубовану з фізіологічним розчином та алергеном відповідно у контрольному та дослідних зразках, центрифугують і при цьому одночасно вимірюють координати кожного з виявлений у цих зразках еритроцитів. Далі у динаміці для кожного моменту вимірювання визначають загальногрупову координату усіх осаджених еритроцитів як середнє значення їх координат. Величину седиментації еритроцитів та її середню швидкість оцінюють за зміненням положення загальногрупової координати. Для виявлення специфічного алергену визначають відносний показник як відношення величини седиментації еритроцитів і її середньої швидкості у контрольному та дослідних зразках. При відміні цього показника від одиниці на 30% і більше приймається рішення про виявлення специфічного алергену. Спосіб, що пропонується для виявлення специфічного алергену, може бути реалізований за допомогою відомих приладів [12]. Приклад автоматизованого комплексу, який реалізує запропонований спосіб, складається з апаратного блоку та ПЕОМ. В апаратному блоці знаходиться центрифуга (ротор та електропривод), регулятор швидкості електродвигуна. Зняття інформації здійснюється оптоелектронним способом за допомогою джерела світла і лінійки фотоприймачів (ФП), які з'єднані з ПЕОМ через стандартний інтерфейс. Як фотоприймачі можуть бути використані фотодіоди (наприклад, ФД-256К). Фотодіоди зібрані в лінійку, при цьому два з них виконують адресні функції. Ротор являє собою плоский диск, розташований вертикально. Всього на диску розташовується 15 капілярів. Світло від джерела світла проводить крізь щілини в кришці та диску через освітлену частину крові (плазму) і потрапляє на фотодіоди. Біля кожного капіляру (по краю дис ку) є отвори, причому на одній позиції їх два, які служать для лічби капілярів та числа обертів (два отвори). Імпульси світла через отвори потрапляють на адресні фотодіоди. Позиція з двома отворами вважається останньою (п'ятнадцятою). Обертання ротору здійснюється за допомогою електроприводу від центрифуги ОПН-8. ПЕОМ, що використовується в автоматизованому комплексі, здійснює функції керування, зняття, обробки та архівування інформації. Вимірювальна інформація, що надходить від фотоприймачів, записується в буферний регістр і зберігається в ньому "від капіляру до капіляру". При цьому номер фотодіода в лінійці використовується як координата. Тому координати зареєстрованих еритроцитів, що седиментуються, визначаються як номери фотоприймачів, в яких відбулась реєстрація. Зв'язок з ПЕОМ здійснюється через паралельний інтерфейс. Через нього в апаратний блок надходять сигнали керування приводом, освітлювачем та вводом-виводом інформації. Спосіб реалізують таким чином. Взяту у хворого цитратну кров, оброблену шляхом додання до контрольного зразка фізіологічного розчину, а до дослідних зразків - алергенів, які підозрюються як специфічні і винні у розвитку алергічного стану, вводять у прозорі вимірювальні комірки, якими є звичайні капіляри Панченкова для аналізу ШОЕ та інкубують їх протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Після підготовки вихідних даних (дата, прізвище пацієнта, час і вид дослідження та ін.) капілярів роблять пуск двигуна з пульту керування (клавіатури) ПЕОМ. При обертанні ротору в прозорих вимірювальних комірках відбувається відцентрова седиментація еритроцитів, швидкість якої залежить від частоти обертання ротору. Світло від джерела світла через щілинні діафрагми і освітлені ділянки проб крові (плазму) в прозорих вимірювальних комірках потрапляє на фотоприймач. Джерело світла створює лінійно розподілений світловий потік. Фотоприймач, виконаний у вигляді лінійки фотодіодів, розраховано на максимальну глибину осадження еритроцитів. Фотодіоди виробляють імпульсні сигнали, які надходять до буферного регістру інтерфейсу. Буферний регістр може бути виконаний на RS-тригерах типу КМОН. При цьому фотодіоди можуть бути ввімкнені за фотодіодним способом з великими навантажувальними опорами, які підключаються безпосередньо до Sвходів тригерів без додаткових підсилювачів. Як двигун та електронний блок керування двигуном можуть бути використані відповідні вузли стандартної медичної центрифуги типу ОПН-8. Інформацію з фотоприймача зчитують через певні інтервали часу впродовж заданого часу аналізу. Для ідентифікації прозорих вимірювальних комірок (капілярів) поблизу кожної з них роблять отвори для лічби, а біля останньої - їх два - для реєстрації кінця оберту. Світло, яке проводить крізь ці отвори, приймають двома додатковими фотодіодами. Інформацію про глибину осадження в кожній вимірювальній комірці вводять у ПЕОМ у формі одномірного масиву одиниць і нулів, який в ідеальному випадку мав би вигляд: 11111...1111100000...00000, тобто межа між одиницями та нулями являла б собою межу поділу плазма - еритроцити. Насправ 3 34280 ді вигляд первинного масиву виходить більш складним: 10011...1011100010...10000, що приводить до зниження точності виявлення межі поділу. Це, в свою чергу, приводить до зниження точності етіологічної діагностики алергії, великої ймовірності помилкового виявлення специфічного алергену та його невиявлення. Для усунення цього недоліку у запропонованому способі величину седиментації еритроцитів і її швидкість визначають за зміненням положення загальногрупової координати. Наприклад, еритроцити були зареєстровані 1, 3, 5 фотодіодами: 10101...00000...0000. Тоді їх координати є Xi={1, 3, 5}. Загальногрупова координата, яку визначають як середнє арифметичне (відношення суми значень координат). Далі знаходять значення загальногрупової координати (згк), які визначають в ряд послідовник моментів часу tj:Xзгк. Швидкість осадження еритроцитів (ШОЕ) в цьому випадку визначають як відношення різниці значень загальногрупових координат, отриманих у різні моменти часу до інтервалу часу між їх вимірами, а середню ШОЕ - як середнє арифметичне від отриманих значень швидкостей за час проведення дослідження. Для цього вимірюють значення координати кожного з виявлених еритроцитів, далі визначають у динаміці для кожного моменту вимірювання загальногрупову координату усіх виявлених еритроцитів як середнє значення їх координат, причому величину седиментації еритроцитів і її середню швидкість оцінюють за зміненням положення загальногрупової координати, після чого визначають показник відношення величини седиментації еритроцитів і її середньої швидкості у контрольному та дослідних зразках, і при відміні цього показника від одиниці на 30% і більше виявлений алерген розцінюють як специфічний. Приклади конкретного використання способу. Приклад 1. Хвора Т.В.М., 66 років, і.х. № 45, знаходилась на лікуванні в зв'язку з некротичним васкулітом у клініці Українського науководослідного інституту дерматології та венерології. В анамнезі цукровий діабет, стенокардія, нирковокам'яна хвороба. На фоні лікування васкуліту у хворої з'явилися волдирні висипи, що було розцінено як алергічна реакція на якийсь лікарський препарат. За даними анамнезу виявити медикамент, винний у розвитку алергічної реакції за типом кропив'янки, було неможливо. Тому у хворої на дослідження була забрана натще кров, котра була змішана з розчином 3,8% цитрату натрію в співвідношенні 1:5. Потім цю цитратну кров капіляром Панченкова набирали до позначки 60 і переносили в рядок васерманівських силіконованих пробірок, в одну з яких додавали фізіологічний розчин капіляром Панченкова до позначки 40 (контрольний зразок), а в останні, - наприклад, медикаментозні алергени в концентрації 250 мкг/мл, які підозрювалися у розвитку алергічного стану (дослідні зразки). Суміш у кожному із зразків ретельно змішували і набирали до позначки 0 капіляром Панченкова, індивідуально підібраним для кожної суміш. Інкубацію проводили при кімнатній температурі 15 хвилин, а потім капіляри Панченкова з контрольним і дослідними зразками цитратної крові вставляли в радіальні камери для вимірювальних комірок автоматизованого комплексу седиментації еритроцитів. Досліджувану цитратну кров центрифугували, для чого з пульту керування ПЕОМ запускали двигун і за допомогою розробленої програми визначали величину седиментації та середню швидкість осадження еритроцитів за зміненням положення загальногрупової координати в контрольному та дослідних зразках, після чого визначали показник відношення величини седиментації та середніх швидкостей осадження еритроцитів у контрольному та дослідних зразках, і при відміні цього показника від одиниці на 30% і більше виявлений алерген розцінювали як специфічний. За допомогою автоматизованого комплексу седиментації еритроцитів у хворої Т.В.М. були апробовані медикаменти, котрі у неї підозрювались у розвитку її алергічного стану. Постановка етіологічного діагнозу та підтвердження клінічного діагнозу було проведено у хворої за 30 хвилин. Аналіз результатів седиментації еритроцитів показав, що у хворої виражена сенсибілізація до бромгексину (ШОЕ 1,5 у.о.), супрастину (ШОЕ 1,7 у.о.), ксантинолу нікотинату (ШОЕ 1,5 у.о.). Це дозволило рекомендувати хворій індивідуалізований комплекс терапії та профілактичних заходів. Приклад 2. Хвора C.І.M., 27 років, і.x. № 2203, заходилася на лікуванні у дерматологічному відділенні Українського НДІ дерматології та венерології в зв'язку з дискоїдним червоним вовчаком. В анамнезі - поліноз, актинічна й медикаментозна алергія з 1990 року. На фоні лікування у хворої поряд з клінічними проявами, характерними для основного захворювання, з'явилися волдирні висипи. Перед лікарем постало питання - чи це ідіопатична кропив'янка, чи це лікарська хвороба, тому що від цього залежало призначення того чи іншого терапевтичного комплексу. Хвору обстежували за допомогою автоматизованого комплексу седиментації еритроцитів. Аналіз результатів свідчив, що у хворої є сенсибілізація до тіосульфату натрію (ШОЕ 1,9 у.о.), супрастину (ШОЕ 1,7 у.о.), ревіту (ШОЕ 1,7 у.о.), що було виявлено за 20 хвилин. Хворій були призначені відповідна терапія та рекомендації з профілактики рецидивів алергічний реакцій на медикаменти. Приклад 3. Хвора С.Г.А., 53 роки, і.х. № 2517, знаходилася на лікуванні у дерматологічному відділенні Українського НДІ дерматології та венерології у зв'язку з псоріазом, псоріатичною артропатією. З березня 1999 року стала помічати гіперчутливість до деяких медикаментів. В анамнезі нейро-циркуляторна дистонія, гіпертонічна хвороба. На фоні лікування псоріазу у хворої спостерігали розвиток алергічної реакції за типом алергічного дерматиту. Треба було встановити етіологічний діагноз лікарської хвороби. У хворої забрали кров і провели дослідження за допомогою автоматизованого комплексу седиментації еритроцитів. Аналіз результатів свідчив, що хвора має сенсибілізацію до метіндолу (ШОЕ 1,8 у.о.). Була призначена відповідна терапія та рекомендовані засоби з профілактики рецидивів лікарської хвороби. Для перевірки ефективності запропонованого способу було обстежено 52 хворих на лікарську 4 34280 хворобу. Паралельно у цих же хворих оцінювали швидкість осадження еритроцитів, навантажених медикаментозним алергеном, у традиційній постановці за Панченковим, за допомогою реакції агломерації лейкоцитів (РАЛ), а також за способом кислотних еритрограм, при якому оцінювали термін максимального гемолізу еритроцитів, попередньо навантажених медикаментозним алергеном. Як свідчить аналіз результатів проведених досліджень, специфічний алерген, який може бути відповідальним за розвиток алергічного стану, за класичним специфічним імунологічним методомреакції агломерації лейкоцитів (РАЛ) було зареєстровано у 80% хворих на лікарську хворобу, за методом Панченкова в його традиційній постановці у 75% хворих, при використанні методу кислотних еритрограм (прототип) - у 61,5% хворих, в той час як при використанні запропонованого способу - у 90,3% хворих із 100 відсотків. Термін виявлення специфічного алергену при використанні реакції агломерації лейкоцитів складає 5-6 годин, методу Панченкова в його традиційній постановці – 3,03,5 години, методу кислотний еритрограм (прототип) - близько 2-х годин, при використанні запропонованого способу – 20-30 хвилин. Таким чином, спосіб, що пропонується, порівняно з прототипом, за рахунок використання центрифугування і визначення загальногрупової координати дозволяє підвищити швидкість і точність отримання результатів дослідження, а також знизити складність досліджень та ймовірність помилкового виявлення специфічний алергенів та їх невиявлення. Джерела інформації 1. Новиков Д.К. Клиническая аллергология: Справ. пособие. - Минск: Вышэйш. шк., 1991. – 511 с. 2. Солошенко Э.Н. Лекарственная болезнь: патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика // Харьковский мед. журнал. - 1996. - № 12. – С. 42-46. 3. Солошенко Э.Н., Брайловский А.Я., Базарнова М.А. Тест лимфобластической трансформа ции при лекарственной аллергии // Клин. медицина. - 1971. - № 6. - С. 131-136. 4. Солошенко Э.Н. Реакция аллергической альтерации лейкоцитов в диагностике лекарственных дерматозов // Дерматология и венерологгия. - К.: Здоровье, 1980. - Вып. 15. - С. 13-16. 5. Польнер А.А., Серова Т.И. Применение базофильного теста и реакции торможения миграции лейкоцитов для диагностики лекарственной аллергии // Научные труды Центрального института усовершенствования врачей. - 1977. - Т. 217. – С 17-20. 6. Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунологические исследования в клинике. - К.: Здоровье, 1978. - 160 с. 7. Столяр Г.М., Никифиров В.И. Об участии эритроцитов в реакции аллергизации // Труды Горьковского мед. института. – 1975. - Вып. 65. С. 235-240. 8. Эритроциты при некоторых аллергических заболеваниях / В.А. Одиноко ва, Д.Б. Каликштейн, Л.А. Мороз и др. // Лаб. дело. – 1985. - № 6. С. 344-347. 9. О механизме деструкции эритроцитов при иммунизации / Е.Г. Кирдей, В.И. Нечаев, А.П. Федосеев и др. // Гематология и трансфузиология. 1984. - № 12. - С. 21-24. 10. Каганович Д.И., Анисичкина З.Ф., Эритрограммы как метод выявления малых концентраций химических веществ на организм подростков // Гигиена и профзаболевания. – М., 1972. - С. 131-134. 11. Использование метода кислотных эритрограмм с лекарственными аллергенами для специфической диагностики лекарственной болезни / Э.Н. Солошенко, В.И. Мацкивский, Е.А. Пипа и др. // Дерматология и венерология. – К.: Здоровье. 1985. - Вып. 20. - С. 33-36. 12. Солошенко Э.Н., Тарасов И.А., Гончаров Н.П., Маухивский В.И. Устройство для оценки сенсибилизации организма к лекарственным и химическим алергенам. А.с. СССР № 1656457 от 04.01.88, БИ № 22, 1991. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5