Олігоетергуанідиновий комплекс з металом як бактерицидна речовина

Олігоетергуанідиновий комплекс з металом формули: 2 3 Суть корисної моделі пояснюється наступним прикладом: Приклад 1. Отримання олігоетергуанідинового комплексу з металом. У реактор загружають 36г. епоксидної смоли Epicot-828 (м.м. 360) (0,1 моля) який розчиняють в етанолі - концентрація 80%, та поступово прикапують спиртовий розчин 10,9г гуанідинхлориду (0,2молю) у 10,9г етанолу. Реакцію проводили 2-3 години при 50-60°С. Контроль за завершеністю реакції проводили титрометричним методом по вмісту епоксидних груп та методом 14 спектроскопії по зникненню смуг поглинання епоксидних груп 920см -1 та титр уванням кінцевих аміногруп. MM отриманого продукту 590. До отриманого олігомеру в спиртовому розчині додавали розчин ацетату міді в диметидформаміді при співвідношенні олігомер:сіль 2:1. Комплекс висушували при температурі 50-60°С та зниженому тиску. Як еталон порівняння використовували відому бактерицидну речовину алкоксиметилметиламонійметасульфат, комерційна назва алкамон ДС [2] формули: та синтезований нами раніше гуанідинвмісний аддукт [4] формули: Для визначення бактерицидної активності синтезованої сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом щодо грампозитивних та грамнегативних бактерій як тест-культури використовували штами Чеської (ССМ), Американської (АТСС) та Української (УКМ) колекцій мікроорганізмів та деякі ізоляти, які на даний час підтримуються у науково-методичній лабораторії мікробіологічного профілю кафедри біології НаУКМА, зокрема: Escherichia coli BE, Pseudomonas aeruginosa ССМ 1961; Serratia marcescens ССМ 1257; Enterobacter cloaceae; Klebsiella pneumoniae; Micrococcus luteus ССМ 169Тип; 38091 4 Staphylococcus aureus ССМ 209; Corynebacterium ammoniagenes АТСС 6871ТипКМ У = Ac-732; Corynebacterium variable АТСС 15753Тип=УКМ Ac717; Rhodococcus erythropolis УКМ Ac-741Тип і Bacillus subtilis ССМ 104 (Тип - штам, типовий для виду). Усі бактерії культивували на м'ясопептоновому агарі (МПА) (Difco, США), для культивування кишкової палички застосовували діагностично-диференційне середовище Ендо (Fluka, США). Бактерицидну активність та мінімальну пригнічувальну концентрацію (МПК) сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом щодо тест-культур визначали методом розведень у МП А в модифікації реплік [6]. Мінімальною пригнічувальною концентрацією вважали ту найменшу концентрацію сполуки у середовищі, за якої ріст мікроорганізмів був відсутній [5, 6]. Знезаражувальну активність сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом визначали суспензійним методом [7, 8]. Оптимальний час дії вказаної сполуки за певних концентрацій визначали через 15 та 30 хвилин шляхом висіву на середовище МПА чи Ендо за методом Yould [7]. Ефективність знезаражувальної дії сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом визначали за кількістю клітин, що вижили, розраховуючи їх життєздатність за формулою: C=lgNt/Ntk, де Nt - кількість бактерій, які вижили після обробки речовиною, Ntk - кількість бактерій у контролі за той самий проміжок часу. Досліди проводили у 3х повторах, отримані результати обробляли математично на ПК. Дослідження бактерицидності сполуки, синтезованої за прикладом 1, щодо різних груп бактерій засвідчує, що вона виявляє максимальну біоцидну дію щодо грампозитивних бактерій. За концентрації 2.5 ррм M1Сu у середовищі не росла жодна з досліджених тест-культур - представників різних родів грампозитивних бактерій (таблиця 1). Більш стійкими до сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом виявилися представники грамнегативних бактерій. Порівняно з грампозитивними бактеріями, найменша концентрація M1Cu, що пригнічувала ріст грамнегативних культур, була вищою в 4 рази. Серед згаданих тест-культур найбільш чутливими виявилися представники видів Е. coli BE, P. aeruginosa CCM 1961, Е. cloaceae та К. рпеитопіае. Усі перераховані штами не росли за концентрації М1Сu 10 ppm. Найбільш стійким до цієї сполуки виявився штам S. marcescens CCM 1257 лише підвищення концентрації до 240 ppm призводило до 100 % пригнічення росту цієї культури. Визначення МПК для представників різних родів грампозитивних бактерій дозволило з'ясувати, що сполука олігоетергуанідинового комплексу з металом виявляє щодо них різну біоцидну активність (таблиця 2). Так, найменшу МІЖ (0.5 ppm) було зареєстровано для М. luteus CCM 169Тип і S. aures CCM 209. 5 38091 6 Таблиця 1 Бактерицидна активність синтезованої сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом (приклад 1) щодо різних представників грампозитивних і грамнегативних бактерій Тест-культура (рід, вид, штам) Кінцева концентрація сполуки олігоетергуанідинового комплексу з Контроль металом у середовищі (ррт): 2.5 5.0 10 25 50 100 200 250 Грампозитивні бактерії Micrococcus luteus CCM 169Тип Corynebacterium ammoniagenes АТСС 6871Тип Corynebacterium variabile АТСС 15753Тип Rhodococcus erythropolis УКМ Ac-741Тип Staphylococcus aureus CCM 209 Bacillus subtilis CCM 104 -15 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 ++++10 -9 -6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 ++++4 -9 -6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 ++++13 -12 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 ++++14 -12 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 ++++14 -8 -8 -8 -8 ++++14 Enterobacter cloaceae Serratia marcescens CCM 1257 Escherichia coli BE Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 Klebsiella pneumoniae ++++9 -8 -8 -8 Грамнегативні бактерії ++++6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 ++++8 ++++12 ++++8 ++++8 ++++8 ++++2 ++++12 ++16 -6 -+32 -12 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 ++++26 ++10 +10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 ++++8 ++++9 ++++6 -6 -6 -6 -6 -6 -6 ++++8 -12 Примітки: У таблиці наведено зведені дані після висіву культур на чашки Петрі з різними концентраціями сполуки. Індексом позначено кількість повторів дослідів (n). Інтенсивність росту культур визначали за 4-х бальною системою і, відповідно, позначали як: "-" - ріст мікроорганізмів відсутній, "+" - ріст поодиноких колоній, "++" - слабкий суцільний ріст, "+++" - суцільний ріст, "++++" - суцільний рясний ріст, подібний до росту в контролі. Пригнічення росту коринебактерій, зокрема С. ammoniagenes АТСС 6871Тип та С. variabile АТСС 15753Тип забезпечувала концентрація 1 ppm. Найбільш стійкими до новосинтезованої сполуки виявилися штами R. erythropolis УКМ Ас741Тип і В. subtilis CCM 104, для яких визначена МПК становила - 2.5 ppm. Пригнічення росту грамнегативних тест-культур вимагало вищих концентрацій сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом, хоча, як і у випадку грампозитивних бактерій, спостерігали вибірковість дії. Так, для Е. coli BE було визначено найнижче серед грамнегативних бактерій значення МПК - 2.5 ppm. Практично однаково сполука M1Cu впливала на штами P. aeruginosa CCM 1961 (МПК=6.0 ppm), К. рnеumоnіае і Е. сlоасеае (МПК=10 ppm, відповідно), тоді як найвище значення МПК було зафіксовано для штаму S. marcescens CCM 1257-240 ppm. 7 38091 8 Таблиця 2 Мінімальна пригнічувальна концентрація сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом щодо різних представників грамнегативних і грампозитивиних бактерій МПК сполук, ppm Сполука олігоетергуанідино- Сполука гуанідиновмівого комплексу з металом сний аддукт [4] Грампозитивні бактерії Micrococcus luteus CCM 169Тип 0.5 10 Corynebacterium variabile ATCC 15753Тип 1.0 10 Coryne bacterium ammoniagenes ATCC 6871 Тип 1.0 10 Rhodococcus erythropolis УКМ Ac-741Тип 2.5 10 Staphylococcus aureus CCM 209 0.5 10 Bacillus subtilis CCM 104 2.5 10 Грамнегативні бактерії Enterobacter сіоасеае 10 100 Serratia marcescens CCM 1257 240 200 Escherichia coli BE 2.5 10 Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 6.0 50 Klebsiella рпеитопіае 10 50 Тест-культура (рід, вид, штам) Примітка: CCM - Чеська колекція мікроорганізмів; ATCC - Американська колекція типових мікроорганізмів; УКМ - Українська колекція мікроорганізмів. Отримані дані засвідчують, що введення в гуанідиновмісний олігоетер перехідного металу міді та зв'язування його у вигляді комплексу призводить до підвищення бактерицидної активності, порівняно зі сполукою гуанідиновмісний аддукт, яку використовували як еталон порівняння [4]. Результати порівняльної оцінки чутливості тесткультур - представників різних родів грампозитивних і грамнегативних бактерій представлено у таблиці 2. Відомо, що така бактерицидна речовина, як алкамон ДС широко використовується для знезараження обладнання медичних установ і харчової промисловості, дезінфекції рук, санації ротоглотки тощо. Дані літератури засвідчують, що алкамон ДС виявляє антимікробну дію як щодо грампозитивних (S. aureus), так і грамнегативних (P. aeruginosd) бактерій [3]. Порівняльний аналіз МПК сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом та референс-речовин (зокрема, гуанідиновмісного аддукту та алкамону ДС), дозволив з'ясувати, що олігоетергуанідиновому комплексу з металом притаманна значно вища бактерицидна активність як щодо грампозитивних, так і грамнегативних бактерій (таблиця 3). Так, порівняно зі сполукою олігоетергуанідиновим комплексом з металом, МПК сполук гуанідиновмісного аддукту і алкамону ДС щодо грампозитивних бактерій була вищою у 20 та 390 разів, а щодо грамнегативних бактерій - у 8,3 та 32,5 рази, відповідно. Таблиця 3 Мінімальна пригнічувальна концентрація сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом та референс-речовин щодо грампозитивиних і грамнегативних бактерій Тест-культура (рід, вид, штам) Staphylococcus aureus CCM 209 Escherichia coli BE Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 МПК сполук, ppm Сполука олігоетергуанідинового ком- Сполука гуанідиновмісний Алкамон ДС плексу з металом аддукт [4] [3] 0.5 10 195 2.5 10 НВ 6.0 50 195 З огляду на те, що синтезована сполука у подальшому може бути запропонована як складова дезінфікувальних засобів та антисептиків, було досліджено її знезаражувальну активність щодо S. aureus CCM 209. Вивчення дезінфікуючої дії M1Cu показало, що в момент внесення суспензії клітин S. aureus CCM 209 до розчину згаданої сполуки, концентрацією 2 ррм, кількість життє здатних клітин одразу зменшувалась на -3,6 lg, а за подовження часу експозиції до 30 хв к ультура втрачала життєздатність на -4,9 lg КУО/мл. Тобто, застосування розчину сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом концентрацією 2 ррм упродовж 30 хв забезпечило інактивацію 99,99 % клітин, що свідчить про високу знезаражувальну ефективність даної сполуки. 9 38091 Таким чином, у результаті проведених досліджень встановлено, що за концентрації 2.5 ppm не росте жоден із представників грампозитивних мікроорганізмів. Пригнічення грамнегативних бактерій вимагає вищих концентрацій, зокрема, 100 % пригнічення їхнього росту забезпечує концентрація 240 ppm. На прикладі штаму S. aureus CCM 209 доведено високу знезаражувальну активність сполуки олігоетергуанідинового комплексу з металом. Отже, можна стверджувати, що введення перехідного металу (міді) в гуанідиновмісний олігоетер завдяки утворенню комплексу призводить до підвищення бактерицидності щодо грамнегативних і грампозитивних бактерій, порівняно з такою у сполуки гуанідинвмісного аддукту та відомої бактерицидної речовини алкамону ДС. Джерела: 1. Бражко О.А. Антимікробна дія гідразидів та іліденгідразидів (хінолін-2-ілтіо)карбонових кислот // Мікробіол. журн. - 2005. - Т. 67, №1. - С.4953. 2. Степура Л.Г., Радченко О.С., Фуртат І.М., Ми хальський Л.О. Бактерицидні властивості катіонних та інших поверхнево-активних речовин // Агроекологічний журнал. - 2002. - №4. - С.60-63. 3. Радченко О.С., Степура Л.Г., Фуртат І.М., Ми хальський Л.О., Крамарєв С.О. Перспектив Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 10 ність застосування четвертинних амонійних сполук для санації слизових оболонок та дезинфекції ран // Інфекційні хвороби. - 2002. - №1. - С.59-63. 4. Патент України № 69869. Гуанідинвмісний аддукт як бактерицидна речовина / М.Я. Вортман, П.В. Вакулюк, О.Є. Завгородня, І.М. Фуртат, А.Ф. Бурбан, Н.С. Клименко, М.Т. Брик, В.В. Шевченко; Заявлено 12.12.2003; Опубл. 15.09.2004; Бюл. №9, 2004. 5. Василевская И.А., Сергейчук М.Г., Згонник В.В., Фуртат И.М., Ми хальский Л.А. Усовершенствование метода бактериологического контроля в производстве лизина // Мікробіол.журн. - 1996. 58, №5. - С.66-76. 6. Yauld J.P. Quantity and anality in the diagnosis of ururory troot infection // Brit. J. Urol. 1965. - 37. №1. - P. 7-12. 7. Фур тат І.М., Нів'євська Т.В., Горбатько Л.О., Михальський Л.О. Дезінфікуюча дія перекису водню та лізоформіну на грамнегативні бактерії, які контамінують виробництва харчової промисловості // Магістеріум. Природничі науки (Національний університет "Києво-Могилянська академія"). - К.: Видавничий дім "KM Academia", 2004. - Вип. 16. - С.29-35. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601