Спосіб одержання вітамін к-залежних протеїнів за допомогою методів мембранної хроматографії

1 Способ получения агентов, содержащих инаїсгивированньїе действием вируса витамин К зависимые компоненты плазмы, такие как протеин С, протеин S, факторы II, VII, IX и/или X, как и их комбинации, такие как PPSB - препараты, согласно которому источник, содержащий эти компоненты, подвергают следующим этапам обработки a) твердофазное хроматографирование источников, содержащих компоненты подлежащие разделению, проводят на анионообменных материалах, которые представляют собой рыхлую объемную массу, мембраны и/или компакт-диски, в условиях относительно низкой ионной силы, удаляют элюент, и, если возникает необходимость, направляют его на дальнейшую переработку с целью получения других полезных веществ, b) извлекают адсорбированный на твердой фазе материал, c) произвольно, приспосабливают ионную силу и/или значение рН фракции, содержащей элюат, к условиям, необходимым для последующей очистки, d) осуществляют анионообменную мембранную хроматографию, аффинную мембранную хроматографию с использованием иммобилизированных веществ, имеющих высокий или низкий молекулярный вес и проявляющих высокую степень сродства к витамин К - зависимым компонентам плазмы, таким как протеин С и протеин S, или хроматографию, основанную на гидрофобном взаимодействии, e) фракционируют отдельные компоненты путем ступенчатого промывания за счет изменения ион ной силы, полярности и/или значений рН применяемых для этого систем растворителей, f) произвольно осуществляют аффинную мембранную хроматографию, д) произвольно собирают элюат, в котором содержатся не поддавшиеся разделению вещества, и повторно подвергают его процедуре f) с использованием пригодных для нее аффинных материалов, п) извлекают связанные с аффинным материалом вещества, изменяя условия аффинного связывания, после чего концентрируют полученный элюат путем снижения количества так званых промывных вод, использованных для элюции, при этом вирус - инактивацию с помощью ионных и/или неионных детергентов проводят перед каждым этапом хроматографической очистки и/или осуществляют указанную вирус - инактивацию термообработкой и/или фильтрацией на стадии, требующей такую процедуру 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что в качестве источника, содержащего витамин К - зависимые компоненты плазмы, такие как протеин С и протеин S, используют свежевзятую плазму крови или плазму крови, хранящуюся при температуре таяния 3 Способ по любому из пп 1-2, отличающийся тем, что твердофазную экстракцию проводят с использованием поперечно сшитых полисахаридов, модифицированных основными группами, таких как SephadexR, или с использованием анионообменных мембран, соответствующим образом модифицированных 4 Способ по любому из пп 1-3, отличающийся тем, что мембранную хроматографию осуществляют с использованием мембран, которые были модифицированы DEAE или четвертичными аминами, или с использованием мембран, которые были модифицированы аффинными лигандами с малым или большим молекулярным весом, способными избирательно связываться с желанными компонентами плазмы ( аффинная мембранная хроматография) 5 Способ по любому из пп 1-4, отличающийся тем, что в качестве аффинной хроматографии используют гепарин - аффинную мембранную хроматографию с иммунноаффинными хромато О (О 44261 графическими мембранами, содержащими иммобутилфосфат билизированные антитела, направленные против 9 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся извлекаемых компонентов, или мембранную афтем, что вирус - инактивацию осуществляют нафинную хроматографию, основанную на испольгреванием фракции до температуры от 55°С до зовании гидрофобных лигандов 70°С в течение периода времени от 5 до 30 часов в присутствии стабилизаторов, таких как сахара, 6 Способ по п 5, отличающийся тем, что в качеаминокислоты, двухвалентные катионы и/или гестве гидрофобных лигандов, пригодных для мопарин дификации носителя, используют 2гидроксиаминоалкильные группы, такие как 210 Способ по п 9, отличающийся тем, что стагидроксиаминопропил и/или гидрофобные лиганбилизаторы удаляют путем выполнения процесды, такие как пропил, бутил, фенольные группы и сов обессоливания, таких как диафильтрация или другие подобные лиганды, проявляющие способультрафильтрация, гепарин - аффинной хроматоность изменять свою гидрофобность графией или анионообменной хроматографией или при помощи носителей, модифицированных 7 Способ по любому из пп 1-6, отличающийся DEAE или четвертичноаммониевыми соединетем, что ионную силу регулируют после выполнениями, или гидрофобными лигандами ния операций хроматографирования разбавлением или обессоливанием, такими как диа - или 11 Способ по любому из пп 1-10, отличающийся ультрафильтрация или путем добавления агентов, тем, что для процесса хроматографирования исповышающих ионную силу пользуют материал в виде частиц, образующих объемную рыхлую массу, из которой изготавли8 Способ по любому из пп 1-7, отличающийся ваются мембраны и/или компакт-диски тем, что процесс вирус - инактивации фракции, полученной после хроматографической очистки, 12 Способ по любому из пп 1-11, отличающийся проводят детергентами, такими как ионные и/или тем, что полученные фракции концентрируют пуанионные детергенты, в присутствии ди - или тритем лиофилизации или их сушат распылением алкилфосфатных соединений, таких как три - н Настоящее изобретение относится к способу получения агентов, содержащих инактивированные действием вируса витамин К - зависимые компоненты плазмы крови, такие как протеин С и протеин S из продукта, содержащего эти компоненты Витамин К - зависимые компоненты плазмы, такие как протеин С, протеин S, факторы II, VII, IX и X являются составными частями плазмы крови, которые играют важную роль в патофизиологии процесса каскада тромбообразования в кровеносных сосудах Данные факторы используются в качестве медикаментов при терапевтическом лечении пациентов, у которых проявляются симптомы заболеваний, вызванных соответственно дефицитом этих факторов В настоящее время нельзя рассматривать плазму крови в качестве источника промышленного получения упомянутых выше факторов, ввиду ограниченности ее запасов Итак, учитывая этические и экономические причины, должна быть решена задача разделения и изоляции названых «витамин К»-зависимых компонентов плазмы, таких как протеин С, протеин S, с как можно более высоким выходом, каждого из факторов, с одной стороны, и с обеспечением выделения каждого из указанных факторов по отдельности, с другой стороны Предметом настоящего изобретения является создание метода, способного решить поставленную задачу Согласно изобретению, поставленная задача решается способом, признаки которого представлены в первом пункте формулы изобретения В способе по данному изобретению использование мембранной хроматографии играет важную роль В публикации Josic et al Jornal of Chromatography 632 (1993), 1-10, описана целесообразность использования гепарин - аффинной хроматографии для разделения протеинов плазмы от каскада сгустков крови Описано выделение антитромбина III и разделение фактора IX и фактора X после предварительной сепарации методом анионной хроматографии Процесс обогащения образцов, содержащих фактор IX и фактор X, осуществляется в соответствии с Н G J Brummelhuis in J M Curling (Editor) "Methods of Plasma Protein Fractionation", Academic Press London, Orlando, 1980, p 117 Высокоразрешающая мембранная хроматография сыворотки и плазменных протеинов хорошо известна из публикации Josic et al Jornal of Chromatography, 590 (1992), 5 9 - 7 6 В данной работе описан процесс разделения сыворотки и плазменных протеинов Например, были разделены плазменные протеины из тканей печени и почек Неожиданно было обнаружено, что витамин К - зависимые плазменные ингредиенты, такие как протеин С, протеин S, факторы II, VII, IX и X могут быть получены в больших дозах и с высокой степенью чистоты, благодаря использованию описываемого способа На первом этапе осуществления способа источник, содержащий соответствующие витамин К зависимые плазменные компоненты, такие как протеин С и протеин S, подвергали твердофазной экстракции на анионообменных мембранах, при этом указанным источником преимущественно является свежевзятая плазма крови или оттаявшая плазма крови Как анионообменное средство 44261 используют макрочастицы, представляющие собой рыхлый объемный материал в виде мембран или компактных дисков Твердофазовая экстракция на полисахаридах, которые могут быть модифицированны щелочными группами или поперечно сшитыми, является предпочтительной Более конкретно, могут быть использованы такие материалы как полисахариды, модифицированные диэтиламиноэтиловыми группами (DEAE) или четвертичными аминами Таким образом, могут быть R использованы материалы типа Sephadex P 50 В частности, DEAE-модифицированные разделительные материалы используются для выделения фактора XI При твердофазной экстракции источник, подвергающийся процессу экстрагирования, наносится на вышеуказанные твердофазные материалы Твердофазная экстракция осуществляется, предпочтительно, в условиях низкой ионной силы После этапа промывания, который проводится факультативно, т е является необязательным, элюент, так называемые промывные воды, собирают и он затем может быть использован для дальнейшей переработки Так, при выделении фактора IX, образец предпочтительно фильтруют через соответствующим образом модифицированную мембрану После этого фильтрат может быть использован, в частности, например, для получения альбумина Протеины, а именно, фактор II, особенно фактор IX и фактор X, связанные с мембраной или с соответствующим материалом твердой фазы, последовательно элюируются из них, т е вымываются, в условиях более высокой ионной силы При использовании DEAE-мембран или мембран модифицированных четвертичными аминами, раскрываются такие особенности, которые демонстрируют преимущество предлагаемого способа в сравнении со способом твердофазной экстракции, когда в качестве вышеупомянутых экстракционных материалов используют материалы в виде макрочастиц Материал, адсорбированный на твердой фазе, затем десорбировали из мате риал а-носителя действием растворов, которые имели повышенную ионную силу После чего ионную силу полученной фракции приспосабливают к условиям необходимым для осуществления последующих операций разделения с помощью подходящих для этого приемов, например, разбавлением, ультрафильтрацией или диафильтрацией, или добавлением агентов, способных повышать ионную силу После этого возможно применение анионообменной хроматографии или аффинной мембранной хроматографии, использующей иммобилизированные вещества, имеющие высокий или низкий молекулярный вес, которые также имеют высокое сродство к "витамин К" - зависимым компонентам плазмы, которые должны быть выделены точно также, как протеин С и протеин S Этот этап хроматографической очистки может быть также выполнен на материалах, используемых для хроматографии, в основе которой лежит процесс гидрофобного взаимодействия Согласно изобретению, как анионообменные материалы должны быть приняты во внимание, в частности, мембраны модифицированные диэтиламиноэтиловыми группами или четвертичными аминами В качестве веществ, имеющих высокое сродство к "витамин К" - зависимым компонентам плазмы, таким как протеин С и протеин S, могут быть использованы лиганды, обладающие иммунным сродством Лиганды с иммунным сродством представляют собой антитела, действие которых направлено против факторов, которые должны быть выделены Так, например, для выделения фактора IX, должны быть использованы мембраны несущие соответствующие иммобилизированные антитела, действие которых направлено против указанного выше фактора IX Вещества, которые не задерживаются анионообменной мембранной или иммуноаффинной мембраной, вымываются, их можно отобрать и подвергать дальнейшей обработке Типичные лиганды, используемые для гидрофобной хроматографии, демонстрируют некоторые последовательные изменения гидрофобности Они включают, например, ациклические или эпициклические алифатические соединения, имеющие, например, от Сі до Сів-алкиловьіе цепи или ароматические компоненты, которые также могут быть модифицированы полярными протонными или полярными непротонными лигандами, такими как циано группа В качестве гидрофобных лигандов, пригодных для осуществления хроматографии с использованием гидрофобного взаимодействия, особенно следует отметить пропиловые, бутиловые, фенильные группы, посредством которых материал-носитель был модифицирован, а также подобные им лиганды, демонстрирующие последовательное изменение гидрофобности Последовательное изменение гидрофобности может быть также осуществлено посредством полярных групп Так, в частности, 2гидроксиаминоалкильные группы, такие как 2гидроксиаминопропильные группы, используются как гидрофобные лиганды для выделения фактора IX Следующий этап включает дальнейшее фракционирование адсорбированных компонентов плазмы, основанный на использовании изменений в ионной силе и/или изменений значений рН и включает многоступенчатое промывание системой растворителей высокой ионной силы, которые имеют различные значения полярности или системой растворителей, реверсирующей сродство между лигандами и субстратом Упомянутый выше процесс может быть приспособлен для корректировки ионной силы фракции, вымываемой из мембраны, в зависимости от условий дальнейшей очистки Этап f) пункта 1 включает аффинную мембранную хроматографию Аффинную хроматографию в контексте способа, осуществляемого согласно изобретению, следует понимать как таковую, которая включает гидрофобную хроматографию Соответствующие лиганды были охарактеризованы выше Мембранная хроматография в контексте способа по настоящему изобретению, также относится к процессам хроматографии, в которых используют мембраны, модифицированные 44261 8 иммуноаффинными лигандами В частности, в ляется с применением иммобилизированных веданном случае, используют моноклональные анществ с малым и большим молекулярным весом, титела против "витамин К" -зависимых компоненимеющих высокую степень сродства к "витамин К" тов плазмы, таких как протеин С и протеин S, при- зависимым компонентам плазмы, таким как прочем данные моноклональные антитела теин С и протеин S, которые, преимущественно, предварительно иммобилизируют на мембране выделены из человека или мышей Операции хром ато граф и чес ко го разделения Вещества, имеющие сродство к витамин К витамин К - зависимых компонентов плазмы, таких зависимым компонентам - факторам II, VII, IX или как протеин С и протеин S в образце, могут осуX, а также протеину С и протеину S - иммобилизиществляться с использованием материалов субруются на носителе посредством химически акстрата, модифицированных ионообменными груптивных групп Предпочтительно, чтобы данные пами, особенно анионообменными, с одной активные группы не непосредственно воздействостороны, или с использованием модифицированвали на материал-носитель, а через конец променых иммуноаффинными лигандами материалов, с жуточной пластины Иммобилизация веществ, другой стороны имеющих сродство к указанным факторам, осуществляется их связыванием с активными группами, Мембраны из указанных материалов для осутакими кактозил, трезил, гидразид и другими Соществления процесса хроматографирования изгоответствующие процедуры известны из публикатавливаются с использованием любого из известции Т М Phillips "Affinity Chromatography", в ных современных способов Предпочтительно, "Chromatography", (E Heftmann, Ed), 5th edition, мембраны состоят из такого материала, как моElsevier, Amsterdam 1992 дифицированная целлюлоза или синтетическое волокно Более конкретно, мембраны также как и Антитела могут также быть предварительно компактные диски изготавливаются из пористого адсорбированы на мембранах, несущих лиганды полиглицидил метакрилата и/или из других пориспротеина А или протеина G Извлечение антител тых гидрофильных материалов, имеющих подоб(опорожнение хроматографической колонки), моную структуру, таких как гидрофилизированный жет быть предотвращено образованием поперечполистирол но сшитых ковалентных связей Для поперечного связывания антител и мембранных протеинов А и Мембраны, пригодные для разделения, состоG возможно применение способа, подобного тому, ят из набора тонких пористых пленок целлюлозы в котором используют рыхлые носители Преимуили искусственного волокна, в первом случае, а во щество иммобилизации на протеине А или провтором случае, они состоят из компактных дисков, теине G состоит в том, что антитела иммобилизисделанных из силикагеля или полимерных носированны исключительно на постоянном сегменте телей Материалы, из которых выполнены указанмолекулы (fc) Таким образом, антиген-связанная ные мембраны или диски, должны быть снабжены часть остается свободной и не вовлекается в просоответствующими ионообменными группами или цесс взаимодействия с соответствующими фактоиммунноаффинными лигандами В качестве ионорами обменных групп, более предпочтительно, анионобменных групп могут быть использованы четВирус-инактивация осуществляется путем обвертичноаммониевые соединения или работки фракции, полученной после хроматографической очистки с детергентами, такими как иондиэтиламиноэтиловые (DEAE) группы В качестве ные и/или неионные поверхностно-активные катионообменных групп, в основном, могут быть вещества, в частности, в присутствии ди- или трииспользованы катионообменные группы слабых алкилированных фосфатных соединений, таких, или сильных кислот, так например, используют как, например, три-н-бутилфосфат согласно метоматериалы модифицированные остатками сульду, описанному в ЕР 0131740 А1 В основном, вифокислота или фосфорной кислоты рус-инактивация может быть также осуществлена Ионообменные группы могут связываться, а перед первой операцией процесса хроматографимогут и не связываться, с волокнами субстрата рования Предпочтительно, для вирусмембран посредством так называемой промежуинактивации используют TntonR X - 100 точной пластины Материалы, снабженные проTween/TNBP (три-н-бутилфосфат) Хорошие ремежуточными пластинами, называются также мазультаты получены также если используют холат териалами со щупальцами Подходящие натрия/TNBP Предпочтительно, количество иснаполнители и лиганды описаны в патенте DE пользуемых детергентов по весу достигает 15% 4204694 Частицы глюкозамина, например, могут быть также использованы в качестве прокладки Однако, вирус-инактивация может быть также Анионообменные группы, такие как DEAE или сообеспечена и тепловой обработкой Согласно этой единения четвертичного амина, также могут свяпроцедуре, после первого этапа хроматографирозываться с мембранами изготовленными из пования витамин К- зависимые компоненты плазмы, ристого глицид ил метакрилата или из других такие как протеин С и протеин S, подвергаются вышеупомянутых материалов Анионообменные процессу пастеризации Подходящий способ группы связываются либо непосредственно с мапредложен в патентной заявке Германии Р териалом, образующим мембрану, либо через 4318435 9 В соответствии с материалами этой промежуточную пластину, каковой являются часзаявки, фракции, обогащенные фактором VIII, тицы глюкозамина приводят в контакт с ди- или триалкилфосфатом и дополнительно - с увлажняющим агентом в приВ другом варианте осуществления способа по сутствии стабилизаторов, таких как сахара, амиданному изобретению используют аффинную нокислоты, двухвалентные катионы и/или гепаримембранную хроматографию, которая осуществ 44261 на одновременно или последовательно подвергают тепловой обработке при несколько повышенной температуре в пределах от 55°С до 70°С в течении периода времени от 5 часов до 30 часов И при желании, для удаления вирусов может быть проведена фильтрация Существует возможность комбинирования двух методов вирус-инактивации, обработки детергентами и нагревания, а также фильтрации При изолировании фактора IX операцию пастеризации, предпочтительно, выполняют после операции f) по п 1 формулы За этим этапом может следовать осуществление другого этапа мембранной хроматографии с целью удаления химических реагентов, использованных в указанной операции Предпочтительно, что бы добавленные ранее стабилизаторы были удалены при помощи мембран, модифицированных DEAE или соединениями четвертичного аммония, которые располагаются на поверхности хроматографического мате риал а-носителя при помощи прокладки При выбранных условиях, стабилизаторы не задерживаются указанным анионобменным материалом, тогда как факторы адсорбируются на хроматографическом материале Стабилизаторы, которые, в основном состоят из веществ с низким молекулярным весом, могут также быть удалены при помощи ультра или диафильтрации Полученные фракции, содержащие витамин К - зависимые компоненты плазмы, такие как протеин С и протеин S, затем концентрируют, если это необходимо Методы концентрации, сами по себе, являются процедурами включающими удаление растворителя, обычно воды, при мягких условиях Они включают, в частности, процедуры, когда растворитель удаляется в условиях пониженного давления, такие как, например, лиофилизация (высушивание в замороженном состоянии) или высушивание распылением Использование мембранной хроматографии в способе по настоящему изобретению, в частности, обладает преимуществом в сравнении с известными способами, которое состоит в том, что хроматограф и чес кое разделение происходит значительно быстрее Кроме того, однажды использованные мембраны могут использоваться повторно несколько раз В сравнении с предлагаемым способом, материалы из которых состоит твердая фаза в способах из существующего уровня техники не могут быть повторно использованы и должны быть удалены после первого же применения Более детально способ по предложенному изобретению проиллюстрирован процессом выделения фактора IX 10 Пример 1 Размороженная плазма крови подвергается твердофазной экстракции на Sephadex P 50 После извлечения веществ, адсорбированных на твердой фазе, ионная сила полученной фракции доводится до значения от 10 до 20мМ раствором цитрата натрия при рН 7 4 и подвергается хроматографированию на мембранах из DEAE GuickDisk (диаметр мембраны - 25мм, толщина - Змм) Давление - приблизительно Збара Хроматографирование проводят при объемной скорости потока, составляющей 5мл/мин Объединенные фракции содержат смесь фактора II и фактора VII и может быть подвержена дальнейшей переработке Максимум, выделенный затем из колонки, содержит смесь фактора IX и фактора X Мембранная хроматография проводится в условиях градиента, который изменяется от первоначально указанного буферного раствора до буферного раствора, содержащего 1М раствор хлорида натрия, а также от 10 до 20мМ раствора цитрата натрия с рН 7 4, используемого в качестве раствора В Если использовать мощный ионообменник, имеющий большую площадь размещения лигандов, то можно достичь повышенной эффективности предложенного способа Предельный параметр процесса определяется селективностью хроматографического материала Степень градиента извлечения будет зависеть от степени поверхностного расположения лигандов на носителе Смесь, содержащая фактор IX и фактор X, затем подвергается дальнейшему хроматографированию Емкостная нагрузка материала, используемого при мембранной хроматографии, равна или больше емкостной нагрузки материала в виде частиц, учитывая, что оба случая основываются на заданном количестве материала Пример 2 Фракция, полученная в соответствии с Примером 1 и содержащая фактор IX и фактор X обрабатывается затем согласно методу, изложенному в Journal of Chromatography, 632 (1993), 1 - 10 Фракция, содержащая фактор IX и фактор X, полученная согласно способу, описанному в Примере 1, подвергается гепарин-аффинному мембранному хроматографированию на компакт-дисках После применения буфера с относительно низкой ионной силой, материал промывается буфером, имеющим значение ионной силы около 500мОсм Затем фактор IX выделяется благодаря использованию градиента, который стартует от 500мОсм до ЮООмОсм Фактор, выделенный таким образом, имеет высокую степень чистоты Практический выход очищенного фактора IX, начиная от первой операции процесса обработки, составляет около 87% ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90