Спосіб одержання бактеріальних препаратів

1 Спосіб одержання баїсгеріальних препаратів комплексної дії, що включає змішування бактеріальної суспензії з торфом, який відрізняється тим, що додають водну витяжку біогумусу як джерело фізіологічно активних сполук 2 Спосіб по п 1, який відрізняється тим, що культуральну рідину бактерій та водну витяжку біогумусу використовують у співвідношенні 1 1 3 Спосіб по п 1, який відрізняється тим, що торф використовують нестерильний, а фактором обмеження розвитку грибної мікрофлори є водна витяжка біогумусу Винахід відноситься до біотехнологм, а саме до виробництва бактеріальних препаратів ВІДОМІ способи одержання біологічних препаратів землеудобрювальної дм, в яких мікроорганізми, як діючий інгредієнт, іммобілізуються на твердому субстраті-носм, яким може бути торф [Основы технологии ризоторфина, его производство и применение в сельском хозяйстве страны Хотянович А В, Познякова А И Минеральный и биологический азот в земледелии СССР 1985], сапропель [АвтсвСССР №1314661 АІ С 12 N 1988], гідролізний ЛІГНІН [ Автсв СССР № 628143 С 05 F И/08 ,1978] та ІНШІ тверді носи -вугілля, вермікуліт, поліакриламід тощо [ Хотянович А В Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе 1991] Незалежно від вибору субстратаносія, бактеріальні препарати при незаперечній екологічній ДОЦІЛЬНОСТІ застосування мають такий недолік, як нестабільність їх ефективності Достовірний господарський ефект вони забезпечують лише в 70% їх застосування [Хотянович АВ Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе 1991] На ефективність бактеріальних препаратів може негативно вплинути вологість та температура ґрунту Так, висів бактеризованого насіння у сухий чи холодний грунт не забезпечить позитивного ефекту від бактеризації використовуються для приготування бактеріальних землеудобрювальних препаратів, повинні бути попередньо стерилізовані При цьому теплова стерилізація часто є неприйнятною для стерилізації великих об'ємів через низьку теплопровідність матеріалів При стерилізації торфу і сапропелю внаслідок жорсткої стерилізації утворюються токсичні речовини, які стримують розвиток бактерій-шокулянтів Прийнятний же для стерилізації вищезазначених субстратів-носмв метод опромінення гамарадіаційними променями є енергоємким і екологічно недоцільним Завдання винаходу - одержання бактеріальних препаратів високої ефективності, стабільних за позитивним впливом на розвиток сільськогосподарських культур і спрощення та здешевлення процесу їх виробництва Поставлене завдання вирішується тим, що на відміну від відомого способу виготовлення біопрепаратів на основі стерильного торфу (прототип), крім бактеріальної культури до нестерильного торфу додається водна витяжка з біогумусу у співвідношенні з бактеріальною культурою 1 1 Водна витяжка біогумусу є одночасно джерелом фізіологічно активних щодо рослин речовин та антифунгальних сполук [Патент України №14916 А 01 N 61/00 1997], які інгібують розвиток грибної мікрофлори в препараті Крім того, азотофіксувальні бактерії біогумусу, що потрапляють у препарат з водною витяжкою, є суттєвим якісним доповненням При цьому одержані біопрепарати набувають ознак Крім того, всі субстрати-носм, що О со 47304 чотирьох досліджених сортах На сорті Аеліта комплексної дм, включаючи рістстимулювання, що надбавка урожаю зерна не була достовірною, але позитивно позначається на розвитку рослин спостерігалась чітка тенденція до її зростання Нижченаведені приклади демонструють суть Приклад 2 винаходу Готовили комплексний препарат як і в Приклад 1 попередньому прикладі і перевіряли Культуру бактерій Azospinllum brasilense, його ефективність у виробничих дослідах з двома стандартний штам 18-2, вирощували глибинним сортами гречки Площа ділянок, способом в рідкому живильному середовищі, зайнятих рослинами кожного сорту, дорівнювала 2 5 га рекомендованому для даного виду бактерій 9 Одержану культуральну рідину з титром 5 0х10 Результати досліду приведені в таблиці 2 клітин/мл добавляли в КІЛЬКОСТІ 25МЛ ДО 150Г не Як свідчать приведені дані, новий біопрепарат стерильного повітряно-сухого розмеленого торфу комплексної дії сприяє значному зростанню Одночасно додавали водну витяжку біогумусу врожайності культури (одна частина біогумусу до восьми частин води) в Приклад З КІЛЬКОСТІ 25мл До одержаної маси з вологістю Культуру бактерій Azospinllum hpoferum, 55%, добавляли 8мл 50% розчину декстрину, стандартний штам 4014, вирощували глибинним перемішували і ставили на дорощування за способом в рідкому живильному середовищі відомим способом Через 20 днів визначали титр Одержану культуральну рідину з титром 4 3х109 A brasilense в препараті Чисельність клітин клітин/мл використовували для приготування дорівнювала 4 млрд в 1 грамі Крім того, препарат комплексного біопрепарата із залученням водної містив 1,5 млрд інших азотофіксувальних витяжки біогумусу Паралельно готовили препарат бактерій Одержану гектарну дозу біопрепарату за існуючою технологією [Хотянович А В Методы досліджували по ефективності впливу на культивирования азотфиксирующих бактерий, урожайність гречки різних сортів в умовах способы получения и применения препаратов на польових ДОСЛІДІВ Контролями в дослідах були их основе 1991] Ефективність біопрепаратів рослини без бактеризації та варіант з інокуляцією перевіряли в модельному ДОСЛІДІ з ячменем при біопрепаратом, одержаним на основі A brasilense, використанні важкого ізотопу (15N) Згідно штам 18-2, традиційним способом Одержані одержаних даних, застосування результати свідчать про переваги експериментального препарату сприяє експериментального препарату (табл 1) Надбавка збільшенню біологічного урожаю ячменю (сума до контролю була достовірною по всіх надземної маси та коренів) на 110% у порівнянні з випробуваних сортах гречки Переваги нового контролем та на 31 5% препарату до відомого достовірні на трьох із Таблиця 1 Ефективність комплексного біопрепарата на гречці Сорти гречки Аеліта Варіанти Контроль Інокуляція A brasilense, шт 18-2 Інокуляція комплексним біопрепаратом HIPos Роксолана Контроль Інокуляція A brasilense, шт 18-2 Інокуляція комплексним біопрепаратом HIPos Рада Контроль Інокуляція A brasilense, шт 18-2 Інокуляція комплексним біопрепаратом HIPos Кара-Даг Контроль Інокуляція A brasilense, шт 18-2 Інокуляція комплексним біопрепаратом HIPos Урожайність, ц/га 122 132 136 05 11 2 11 0 122 06 137 141 153 04 11 5 123 140 06 Надбавка до контролю ц/га % 10 82 14 11 5 10 89 04 16 29 11 7 08 25 69 21 7 Таблиця 2 Ефективність експериментального препарату на гречці вумовах виробничого досліду Сорт Роксолана Варіанти Контроль Урожайність, ц/га 92 Надбавка до контролю ц/га % 47304 Продовження таблиці 2 Сорт Урожайність, ц/га Комплексний біопрепарат Контроль Комплексний біопрепарат Вікторія Варіанти Надбавка до контролю ц/га % 23 25 0 11 5 11 3 134 21 186 ризосфери ячменю з атмосфери Отже застосування нового біопрепарату дозволяє інтенсифікувати розвиток рослин При цьому азотний метаболізм їх у значній мірі забезпечується за рахунок екологічно безпечного біологічного азоту порівняно з препаратом, приготовленим за існуючою технологією (табл 3) Аналіз ізотопного складу зразків показує, що при використанні комплексного біопрепарату значно (у 2,3 рази) зростає надходження в рослини біологічного азоту, зв'язаного азотофіксувальними бактеріями Таблиця З Вплив комплексного бюпрепарата на урожайність ячменя та азотне живлення рослин Азот, мг/посудину Варіанти Контроль Інокуляція A hpoferum Комплексний біопрепарат HIPos БІОЛОГІЧНИЙ урожай, г/посудину загальний (А) добрив* (В) 1 315 2 105 6 97 9 03 3 32 4 30 2 765 11 86 5 72 0 310 1 98 Надбавка біологічного азоту до насіння біологічний контролю, (А-В-С) (С) мг/посудину 2 25 1 40 2 25 2 48 1 08 0 80 2 25 3 89 2 49 * - внесено мінерального азота 13 мг/посудину Приклад 4 Культуру бактерій Rhizobium legummosarum, стандартний штам 363, вирощували на рідкому живильному середовищі, рекомендованому для даних бактерій Одержану культуральну рідину з титром 4 8x109 клітин/мл добавляли в торф при різних співвідношеннях з водною витяжкою біогумусу Проводили дорощування бактерій за відомим способом ДОСЛІДНІ партії препаратів перевіряли в умовах вегетаційного досліду з горохом Враховували чисельність азотофіксувальних бульбочок та визначали активність азотфіксації Найбільш ефективним є біопрепарат, виготовлений з бактеріальної суспензії та водної витяжки біогумусу при співвідношенні 11 Активність зв'язування атмосферного азоту при цьому перевищувала показники контрольного варіанта в 36 разів Порівняно з іншими варіантами активність азотфіксації була вищою в 1 3-26 разів в залежності від досліджуваних співвідношень інгредієнтів препарата (табл 4) Приклад 5 Культуру бактерій Azospinllum brasilense, стандний штам 18-2, вирощували глибинним способом в рідкому живильному середовищі рекомендованого складу Одержану культуральну рідину з титром 6 2x10 клітин/мл використовували для приготування бактеріальних препаратів за різними технологіями 1) при добавленні суспензії до стерилізованого тепловим способом торфу, 2) при добавленні суспензії до нестерильного торфу, 3) при добавленні до нестерильного торфу бактеріальної суспензії і водної витяжки з біогумусу у співвідношенні 11 Проводили дорощування бактерій за відомим способом Одержані біопрепарати зберігали на протязі 6 МІСЯЦІВ, у динаміці визначали чисельність клітин Azospinllum brasilense Одержані результати свідчать про інтенсивний розвиток азоспірил в стерильному торфі та в дослідному препараті при добавленні витяжки з біогумусу (табл 5) При цьому в експериментальному препараті активно розвивались азотофіксувальні бактерії інших таксономічних підрозділів (до 1 млрд, клітин на 1 г торфу), що забезпечувало високу ефективність препарату Добавлення суспензії азоспірил до нестерильного торфу не забезпечило достатнього розвитку бактерій через інтенсивне заростання субстрату грибною мікрофлорою Гриби не розвивалися в торфі при добавленні водної витяжки біогумусу внаслідок антифунгальних и властивостей Це дає змогу зберігати високий титр бактеріальних клітин на протязі 6 МІСЯЦІВ зберігання препарату 47304 Таблиця 4 Вплив співвідношення бактеріальної азотофіксувального симбіозу Варіанти Контроль Комплексний біопрепарат (співвідношення бак суспензії до витяжки 0,25 1 75) Комплексний біопрепарат (співвідношення бак суспензії до витяжки 0 5 15) Комплексний біопрепарат (співвідношення бак суспензії до витяжки 1 1) Комплексний біопрепарат (співвідношення бак суспензії до витяжки 1 5 0 5) Комплексний біопрепарат (співвідношення бак суспензії до витяжки 1 75 0 25) HIPos суспензії і водної витяжки біогумусу на ефективність Чисельність азотофіксувальних бульбочок на коренях гороха, од/рослину 5 7 Активність азотфіксації, мкг N/ рослину за годину 22 1 014 46 3 180 31 2 350 33 2 361 47 0 090 0 087 0 120 Таблиця 5 Розвиток A brasilense штам 18-2 при внесенні в субстрат (торф) Варіанти Стерильний торф + A brasilense Нестерильний торф + A brasilense Комплексний біопрепарат (нестерильний торф + A brasilense + водна витяжка біогумусу) • Чисельність бактерій в торфі в залежності від строків зберігання, млн клітин на 1г 1 МІСЯЦЬ 2 місяць 3 МІСЯЦЬ 4 місяць 3500 0 3200 0 1500 0 900 0 1300 0 100 0 20 0 01 3000 0 2700 0 1600 0 950 0 Таким чином, пропонована форма бактеріальних препаратів відрізняється стабільною ефективністю внаслідок комплексного впливу на рослину азотофіксувальних бактерій та фізіологічно активних ріст стимулюючих речовин Процес виготовлення бактеріальних препаратів при цьому спрощується і є більш дешевим, оскільки потреба в стерилізації субстрату відпадає Науково-технічна література 1 Основы технологии ризоторфина, его производство и применение в сельском хозяйстве страны /Хотянович А В, Познякова АИ Минеральный и биологический азот в земледелии СССР, М-1985, С 157-164 2 Автсв СССР №1314661 АІ С 12 N Ул Способ размножения и сохранения клубеньковых бактерий, используемых при производстве нитрагина/ М И Мильто, А И Карбанович, М 3 Лопотко, П Л Кузьмицкий - Опубл 15 03 88, Бюл № 10 3 Автсв СССР №628143 С 05 F 11/08 Способ получения наполнителя для нитрагина /В И Сабельникова, М М Волоскова, В В Котень, М А Негру - Опубл 15 10 78 , Бюл №38 4 Хотянович А В Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе - Ленинград, 1991 -43с 5 Патент України №14916 А 01 N 61/00 Спосіб одержання бюстимулятора росту та розвитку рослин з гумусовміщуючих речовин / 1 П Ушаков, І М Титов - Опубл ЗО 06 97, Бюл №3 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71