Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною дією

Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з протизапальною, знеболюючою та 3 54663 засіб з комплексною знеболюючою та гіпотензивною дією у поєднанні з протизапальною дією. Завданням корисної моделі є створення способу одержання комплексу біологічно активних речовин шляхом екстрагування листя гледичії звичайної гарячою водою при заданих параметрах способу, в результаті чого одержують біологічно активну субстанцію у формі сухого екстракту з протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною дією, яка може бути використана як діюча речовина у складі лікарських засобів, виконаних у різних лікарських формах і придатних до тривалого застосування внаслідок м'якої дії, практичної нетоксичності і відсутності побічних ефектів, притаманних засобам рослинного походження. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання комплексу біологічно активних речовин з протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною дією шляхом принаймні трикратної екстракції подрібненої рослинної сировини водою при температурі 90-100°С з подальшим об'єднанням відфільтрованих екстрактів, їх упарюванням та сушкою, згідно з корисною моделлю передбачено, що в якості рослинної сировини використовують листя гледичії звичайної (Gleditsia 4 triacanthos L.), першу екстракцію здійснюють при співвідношенні сировина:екстрагент 1:10, а наступні екстракції - при співвідношенні 1:9 при тривалості кожного етапу екстракції 1,5 години. Заявлений спосіб передбачає використання в якості рослинної сировини листя гледичії звичайної [4], що мають переважно спазмолітичну дію. Фармакологічна активність рослини визначається вмістом алкалоїду тріакантину у її листі. Спазмолітична дія тріакантину подібна до ефекту папаверину, але у 4-5 разів менш токсична. Існують дані про жовчогінну та гіпотензивну дію тріакантину. Проте його знеболююча дія невідома з джерел інформації. Вибір екстрагенту та параметрів заявленого способу здійснено експериментальним шляхом з урахуванням ступеня біологічної активності одержаних комплексів, ефективності, доступності та нешкідливості реактивів, практичного відтворення способу у промислових умовах. Експериментально встановлено, що використання в якості екстрагента гарячої води при одержанні комплексу біологічно активних речовин (БАР) з листя гледичії забезпечує їх найбільш повну екстракцію (табл.1). Таблиця 1 Вибір екстрагента за кількісним виходом екстрактивних речовин Екстрагент Кількісний вихід екстрактивних речовин, % Вода, 90°С 30% етанол 50% етанол 70% етанол 96% етанол 38,80 34,76 27,39 28,14 24,64 Передбачене заявленим способом підвищення температури води до 90-100°С і трикратна екстракція сировини новими порціями екстрагенту інтенсифікує процес екстрагування, що дозволяє максимально вилучити БАР з сировини. Крім того, такий екстрагент також вигідний з боку технологічних вимог до здійснення способу, бо є доступним, дешевим та екологічно безпечним. Сумарне співвідношення сировини до екстрагента 1:28 знайдено експериментально і є оптимальним для вибраної сировини. На першому етапі екстракції співвідношення сировина:екстрагент становить 1:10 (враховується поглинання частини екстрагента сировиною), а на другому і третьому - 1:9. Менша кількість екстрагента на кожному з етапів не дозволяє ефективно провести екстракцію і створює труднощі технологічного характеру. Більша кількість екстрагента є нераціональною, тому що необхідна екстракція досягається заявленою кількістю екстрагента. Тривалість кожного з етапів екстракцій 1,5 години є необхідною і достатньою для вичерпного вилучення з сировини комплексу біологічно активних сполук з протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною дією. Заявлений спосіб виключає обробку екстракту спиртом етиловим, яка призводить до зменшення біологічної активності цільового продукту. В результаті здійснення заявленого способу одержують комплекс БАР - порошок світлокоричневого кольору зі специфічним запахом, гір кувато-кислий на смак, добре розчинний у воді, практично не розчинний в ефірі, хлороформі. Таким чином, використання листя гледичії при сукупності параметрів заявленого способу дозволяє одержати комплекс біологічно активних сполук, який має протизапальну, знеболюючу та гіпотензивну дію. Заявлений спосіб є новим, невідомим з джерел інформації. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Зібране у період з червня по вересень висушене і подрібнене до часток 2-5мм листя гледичії завантажують у реактор з мішалкою і паровою сорочкою, заливають гарячою водою 90°С у співвідношенні сировина:екстрагент 1:10. Екстракцію проводять протягом 1,5 годин при перемішуванні і постійно витриманій температурі 90°С. Процедуру повторюють ще двічі при відношенні сировини до екстрагенту 1:9. Відфільтровані водні витяги об'єднують і упарюють на вакуумно-випарювальному апараті до повного висушування. Сухий екстракт подрібнюють. Вихід готового продукту становить 19,5-20,5% від повітряно-сухої сировини. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1 1,1кг подрібненого повітряно-сухого листя гледичії завантажували у реактор з мішалкою і паровою сорочкою, заливали 11л гарячої води 90°С і перемішували протягом 1,5 годин при постійно витриманій температурі 90°С. Екстракцію повторювали двічі, додаючи по 9,9л води. Одержані 5 54663 екстракти 9,8л, 9,2л і 9,3л відповідно, об'єднували і упарювали на вакуумно-випарювальному апараті до повного висушування. Сухий екстракт подрібнювали. Вихід цільового продукту склав 220,0г, тобто 20%. Приклад 2 Протизапальну активність комплексу БАР листя гледичії, одержаного за заявленим способом, вивчали на моделі карагенінового і формалінового 6 набряків на білих щурах, які були розподілені на 5 груп: дослідні, ті, яких лікували одержаним препаратом листя гледичії у дозах 25, 50, 100мг/кг, ті, яких лікували препаратом порівняння і контрольні. В якості препарату порівняння використовували диклофенак натрію в оптимальній для нього дозі 10мг/кг. За критерій протизапальної активності було обрано відсоток пригнічення набряку. Результати представлені у таблиці 2. Таблиця 2 Порівняльна оцінка протизапальної активності одержаного препарату листя гледичії на моделях карагенінового та формалінового набряків лапок щурів (М±m, n=7-10) Варіанти досліду Інтактна група Диклофенак натрію Препарат гледичії Препарат гледичії Препарат гледичії Інтактна група Диклофенак натрію Препарат гледичії Вихідна товщи- Товщина лапки % набряку(у порі- Протизапальна активна лапки щура через 3 години внянні з вихідним) ність, % (мм) (мм) Карагеніновий набряк (1% р-н карагеніну) 0,1мл субплантарно 4,46±0,10 7,15±0,19 60,30% 0 10 4,52±0,09 5,66±0,14 25,80% 57,2% 25 3,89±0,12 5,16±0,18 32,92% 45,4% 50 4,32±0,10 5,19±0,16 20,57% 65,9% 100 4,06±0,08 4,73±0,09 16,42% 72,8% Формаліновий набряк (2% р-н формаліну і 0,1мл субплантарно 4,11±0,13 8,46±0,19 107,2% 0 10 4,42±0,13 7,57±0,25 73,1% 31,8% 50 4,42±0,17 7,64±0,24 76,4% 28,7% Доза мг/кг Аналіз даних таблиці 2 свідчить, що на моделях карагенінового набряку препарат листя гледичії у дозах 50 і 100мг/кг виявляє виражений протизапальний ефект і перевищує препарат порівняння - диклофенак натрію на 15,2% і 27,3% відповідно. На моделі формалінового набряку препарат гледичії дещо поступився дії референс-препарату. Приклад 3 Знеболюючу активність препарату гледичії, одержаного за заявленим способом, вивчали на 76 білих нелінійних щурах-самцях у порівнянні з референс-препаратом - диклофенаком натрію, визначали на моделі електричного подразнення слизової оболонки прямої кишки. За поріг больової чутливості (ПБЧ) приймали найменшу силу електричного струму, яка викликала больове відчуття у тварини, що проявлялось у локалізації болі і/або відсмикування лапок від підлоги. Досліджуваний препарат вводили внутрішньошлунково у дозах 25, 50 і 100мг/кг після попереднього розчинення у дистильованій воді. Диклофенак натрію (10мг/кг) вводили внутрішньошлунково одноразово. Порівнювали вихідні показники ПБЧ та зміни його через 2 години після введення досліджуваних препаратів. Результати досліджень наведені у таблиці 3. Таблиця З Вплив препарату гледичії на поріг больової чутливості на моделі електричного подразнення слизової оболонки прямої кишки щурів у порівнянні з диклофенаком натрію (М±m, n=7-17) Варіант досліду Дистильована вода Диклофенак натрію Препарат гледичії Препарат гледичії Препарат гледичії Доза, мг/кг Вихідний ПБЧ (mА) 10 25 50 100 4,0±0,19 4,71±0,13 4,50±0,19 4,29±0,21 4,43±0,23 Аналіз даних таблиці 3 свідчить, що препарат гледичії проявляє більш виражений знеболюючий ефект, проте за силою дії він поступається референс-препарату - диклофенаку натрію. Приклад 4 Дослідження гіпотензивної дії препарату гледичії звичайної, одержаного за заявленим спосо ПБЧ через 2год. після внутрішньошлункового введення сполук 4,14±0,21 6,26±0,17 5,36±0,24 5,50±0,24 5,29±0,26 % підвищення ПБЧ порівняно з вихідним 3,6% 33,8% 19,4% 28,9% 20,2% бом, проводили на самцях білих нелінійних щурів масою 430-500г під кетаміновим наркозом (100мг/кг) за допомогою флуометру "Transonic Animal Research Flowmeters Т106 Series" (USA). Артеріальний тиск вимірювали за допомогою датчика "Transonic Pressure Transducer", який приєднували до внутрішньовенного катетера і вводили у 7 загальну сонну артерію [5]. Для попередження зсідання крові у датчик і катетер вводили гепарин (із розрахунку 0,1мл гепарину + 0,9мл ізотонічного розчину натрію хлориду). Величина артеріального тиску (AT) вимірювалась у мм.рт.ст. Реєструвались вихідні значення AT, а також зміни його спочатку через 5 хвилин, а потім кожні 10 хвилин протягом 1 години після одноразового внутрішньовенного (у стегнову вену) введення досліджуваного препарату у дозі 50мг/кг. Контрольною групою слугували тварини, яким замість досліджуваних препаратів внутрішньовен 54663 8 но вводили еквівалентну кількість ізотонічного розчину натрію хлориду. В якості референс-препарату було обрано 2% розчин папаверину гідрохлориду у дозі 10мг/кг. Крім дослідів на інтактних тваринах, гіпотензивна дія сумарного препарату гледичії звичайної досліджувалась на моделі гіпертензії, яку відтворювали внутрішньовенним введенням адреноміметика мезатона (10мкг/кг), який вводили внутрішньовенно за 10 хвилин до досліджуваного препарату. Результати досліджень наведені у таблиці 4. Таблиця 4 Зміни артеріального тиску під впливом сумарного препарату гледичії у порівнянні з папаверину гідрохлоридом у щурів (М±m, n=5) Вихідний AT, мм.рт.ст. 57,8±2,78 56,2±2,33 59,6±1,72 59,0±2,21 Через 10хв. Час після введення препаратів після мезато5хв. 10хв. 20хв. 30хв. 40хв. 50хв. ну Контроль (ізотонічний розчин натрію хлориду) 58,0 56,6 55,0 55,8 54,0 53,8 ±2,81 ±2,44 ±2,88 ±2,92 ±2,59 ±2,82 -3,5% Препарат гледичії (50мг/кг внутрішньовенно) 59,4 58,0 55,0 51,2 51,0 50,6 ±2,48 ±2,97 ±2,74 ±1,85 ±1,34 ±1,33 -8,8% 111,6 110,2 101,2 97,6 90,4 86,4 84,6 ±2,25 ±2,15 ±1,36 ±2,5 ±1,47 ±0,68 ±0,81 +87,8% -18,9% Папаверину гідрохлорид (10мг/кг внутрішньовенно) 55,2 50,8 49,8 46,8 46,2 45,8 ±1,88 ±1,53 ±1,11 ±1,32 ±1,07 ±1,16 -20,5% За даними табл.4 препарат гледичії проявляє гіпотензивну дію, і дещо перевищує референспрепарат, що підтверджується його здатністю знижувати артеріальний тиск у сонній артерії щурів на 10,8% у порівнянні з вихідним рівнем. Попереднє введення -адреноміметика мезатону підвищує гіпотензивний ефект препарату; зменшення артеріального тиску складає 25,9%, що дещо перевершує дію референс-препарату папаверину гідрохлориду. Приклад 5 Дослідження гострої токсичності препарату гледичії, одержаного за заявленим способом, проводили у діапазоні доз від 100мг/кг до 1000мг/кг. Препарат вводили дослідним тваринам внутрішньоочеревинно у відповідних дозах, розчиняючи його у необхідній кількості фізіологічного розчину. Якщо обсяг препарату перевищував 5мл, введення проводили дрібно протягом доби. Для розрахунку середньої летальної дози (ЛД50) через 14 днів визначали відсоток летальності у кожній групі тварин і за допомогою таблиць, а також розрахунків відповідно до методу пробіт-аналізу кривих летальностей за В.Б. Прозоровським визначали значення ЛД50 [6]. При дослідженні низьких та середніх доз препарату видимих ознак впливу на зовнішній вигляд, апетит чи поведінку щурів зареєстровано не було. 60хв. 54,4 ±2,99 -5,9% 50,0 ±1,3 -10,8% 82,6 ±1,17 -25,9% 45,6 ±1,75 -22,7% Відсутність летальності у щурів дозволяє вважати, що значення ЛД50 для препарату гледичії перевищує максимальну дозу, яку використовували в експерименті, тобто у щурів при внутрішньочеревинному введенні ЛД50>1000мг/кг. Дане значення ЛД50 дозволяє віднести препарат гледичії за класифікацією К.К. Сидорова до VI класу токсичності відносно нешкідливі речовини [6]. В результаті здійснення заявленого способу одержують комплекс біологічно активних речовин з вираженими фармакологічними активностями: протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною, який є перспективним для використання в якості лікарської субстанції при створенні лікарських препаратів з широким спектром фармакологічної активності. Заявлений спосіб дає змогу раціонального використання вітчизняних сировинних ресурсів, є економічним, безпечним і легко відтворюваним на підприємствах фармацевтичної галузі України. Джерела інформації: 1. Патент на винахід 77795, Україна, МПК(2006) А61К36/185, А61Р1/04 (2006.01), А61Р29/00, А61Р39/00, заявл. 22.11.2004, опубл. 15.01.2007, Бюл. №1. 2. Патент на винахід 79383, Україна, МПК(2006) А61К36/61 (2007.01), А61Р29/00, заявл. 28.11.2005, опубл. 11.06.2007, Бюл. №8. 9 54663 3. Патент на корисну модель 23647, Україна, МПК(2006) А61К36/00, заявл. 19.10.2006, опубл. 11.06.2007, Бюл. №8. 4. Современная фитотерапия / Под ред. В. Петкова, София, «Медицина и физкультура», 1988, С.148-149. Комп’ютерна верстка А. Рябко 10 5. Доклінічні дослідження лікарських засобів (Методичні рекомендації) / За ред. Стефанова О.В. - К.: Авіценна, 2001. - 527с. 6. Прозоровский В.Б. Практическое пособие по ускоренному определению средних эффективных доз и концентрации биологически активных веществ. - СПб, 1992 - 42с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601