Рекомбінантна плазмідна днк рspaa(tr), що кодує послідовність гена поверхневого антигену spaa erysipelothrix rhusiopathie

Рекомбінантна плазмідна ДНК pSPAA(tr), що кодує послідовність гена поверхневого антигену SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae, яка має довжину 6374 п.н. та містить наступні фрагменти: фрагмент ДНК довжиною 1085 п.н., який є фрагментом гена SPAA грампозитивної бактерії Erysipelothrix rhusiopathiae та має послідовність: - регуляторні елементи експресії цільового білка Т7/lас-промотор та Т7-термінатор загальною довжиною 62 п.н.; - огі - область початку реплікації плазмід СоІЕІтипу; - селективний маркер - ген стійкості до канаміцину Каn довжиною 812 п.н.; - огі fl - область початку реплікації бактеріофага fl довжиною 455 п.н., яка при трансформації клітин Escherichia coli штаму В121 (DE3)забезпечує синтез рекомбінантного білка SpaA Erysipelothrix rhusiopathie з М.м. 47 кДа. Корисна модель відноситься до біотехнології, зокрема, до генетичної інженерії, та може використовуватися для одержання рекомбінантного пове рхневого антигену SpaA грампозитивної бактерії Erysipelothrix rhusiopathie, придатного для виробництва вакцин ветеринарного призначення проти (19) UA (11) 58464 (13) U (21) u201012022 (22) 11.10.2010 (24) 11.04.2011 (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) ДЕРЯБІН ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ, ДЕРЯБІНА ОЛЕНА ГРИГОРІВНА, ГІЛЬЧУК ПАВЛО ВОЛОДИМИРОВИЧ, ТАРАСОВ ОЛЕКСАНДР АНАТОЛІЙОВИЧ, ОБРАЖЕЙ АНАТОЛІЙ ФЕДОРОВИЧ, СКРИПНИК ВАЛЕРІЙ ГРИГОРОВИЧ 3 бешихи свиней. Так, винахід стосується конструкції рекомбінантної плазміди, яка містить Nкінцевий фрагмент гена SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae, та при трансформації якою клітин Escherichia coli B121(DE3), забезпечують синтез рекомбінантного білка SpaA Erysipelothrix rhusiopathie з М.м.47 кДа. Бактерія Erysipelothrix rhusiopathiae відноситься до родини Corynebacteriaceae і є збудником хвороби - бешихи свиней (Erysipelas suum), яке характеризується запальною еритемою шкіри та септичними явищами, а також ураженням суглобів, веррукозним ендокардитом та некротичними ураженням шкіри. Бактерія грампозитивна, нерухома, являє собою тонку, пряму або трохи зігнуту паличку розміром (довжина 0,5-1,5 мкм, ширина 0,20,3 мкм). Культивуються в аеробних і анаеробних умовах. Збудник має високу стійкість у зовнішньому середовищі. Джерелом і резервуаром інфекції служать багато видів тварин (свині, вівці, велика рогата худоба, собаки, кури, качки, гризуни, риби, раки й ін.). Основне джерело інфекції - свині, у яких захворювання перебігає найчастіше в гострій формі, та гризуни. Основним засобом боротьби з даним захворюванням є імунопрофілактика із застосуванням вакцин основі живих авірулентних штамів збудника, або інактивованих вакцин на основі бактеринів чи лізатів патогенних штамів. Загальним недоліком використання вказаних типів вакцин є необхідність в культивуванні великих об'ємів бактерій Erysipelothrix rhusiopathiae, що може мати негативний вплив на оточуюче середовище, а також створювати загрозу інфікування персоналу. Тому на сьогоднішній день більш перспективним є отримання рекомбінантного поверхневого антигену SpaA Erysipelothrix rhusiopathiae шляхом мікробіологічного синтезу з використанням рекомбінантної плазмідної ДНК, що несе ген SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae, та штаму Escherichia coli, трансформованого цією плазмідною ДНК. Такий підхід забезпечує можливість синтезу цільового продукту в значно більшій кількості з використанням недорогої сировини. Залучення генноінженерних підходів при такому синтезі дозволяє створити оптимальні для бактеріальної експресії варіанти структурного гена, а також інших регуляторних елементів, що контролюють експресію. На сьогодні описано декілька варіантів отримання рекомбінантного білка SpaA Erysipelothrix rhusiopathiae в Escherichia coli з використанням рекомбінантних плазмід, придатного як для використання в якості антигену для імуноферментного аналізу, так і як кандидата у субодиничні вакцини. Так, в роботі Galan E. та Timoney J. [1] описаний спосіб поєднання фрагментів геномної ДНК Erysipelothrix rhusiopathiae, отриманої в результаті часткової переварки ферментом EcoR1, з фрагментами ДНК фага gt11 із подальшим зараженням рекомбінантними фагами культури Е. coli і отри 58464 4 мання в ній рекомбінантного білка. Недоліком даного методу є його складність і неможливість стандартного відтворення. Існує описання конструкції для отримання рекомбінантного поверхневого антигену Erysipelothrix rhusiopathiae а патенті Fischetti V.A. та ін. [2], які містять різні фрагменти гена SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae, отримані в ПЛР та клоновані в вектор серії pQE (Qiagen). Важливим недоліком цієї конструкції є можливість отримання в рекомбінантній формі лише С-термінальної частини білка SpaA Erysipelothrix rhusiopathiae, в інших випадках спостерігалася деградація продукту. Найбільш близькою конструкцією для отримання SpaA Erysipelothrix rhusiopathiae до тієї, що заявляється, є рекомбінантна плазміда, описана Imada Y. et.al [3] та, з незначними модифікаціями, Но То та Shinya Nagai [4]. Вектором для клонування і експресії рекомбінантних білків була плазміда pQE32 (Qiagen), яка містить сильний промотор фага Т5. Фрагменти гена SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae різної довжини отримували в полімеразній ланцюговій реакції зі специфічними олігонуклеотидними праймерами, після чого клонували в плазміду pQE32 і отриманою рекомбінантною плазмідою трансфікували клітини Е. соlі. Індукцію синтезу виконували ізопропіл--D-тіогалактопіранозидом (ІПТГ), отримані тільця включення денатурували за допомогою 6М гуанідин-хлориду та очищали методом афінної хроматографії. Недоліком описаної системи є використання недостатньо ефективного промотора для даного антигену, що не забезпечує синтез продукту в препаративній кількості; необхідність використання для індукції синтезу рекомбінантного білка ІПТГ, який є токсичною речовиною для клітин Е. соlі. До недоліків слід віднести і те, що достатня антигенна активність рекомбінантного білка спостерігалась лише при використанні конструкцій, які відповідали повному гену SPAA або його значній частині. Задачею корисної моделі є створення конструкції рекомбінантної плазмідної ДНК, яка відрізняється стабільністю та забезпечує підвищений рівень експресії цільового білка. Вказана задача вирішується за рахунок створення рекомбінантної плазмідної ДНК pSPAA(tr), що кодує послідовність гена поверхневого антигену SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae та штаму E.coli BL21(DE3), який несе вказану рекомбінантну конструкцію та забезпечує продукцію білка SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae. При цьому рекомбінантна плазмідна ДНК pSPAA(tr), що кодує послідовність гена поверхневого антигену SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae, має довжину 6374 п.н. та містить наступні фрагменти: - фрагмент ДНК довжиною 1085 п.н., який є фрагментом гена SPAA грампозитивної бактерії Erysipelothrix rhusiopathiae та має послідовність: 5 - регуляторні елементи експресії цільового білка - Т7/Lас-промотор та Т7-термінатор загальною довжиною 62 п.н.; - огі - область початку реплікації плазмід СоІЕІ-типу; - селективний маркер - ген стійкості до канаміцину Каn довжиною 812 п.н., який забезпечує стабільність плазміди; - огі fl - область початку реплікації бактеріофага fl довжиною 455 п.н.. Використання конструкції, що пропонується, забезпечує синтез рекомбінантного білка SpaA з М.м. 47 кДа. Опис корисної моделі супроводжується наступними фігурами: Фігура 1. Фізична карта рекомбінантної плазміди pSPAA(tr). Фігура 2. Нуклеотидна послідовність гену SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae для використання у корисній моделі. Сутність та переваги експресуючої рекомбінантної плазміди pSPAA(tr) демонструються з посиланням на наступні приклади. Приклад 1 Конструювання рекомбінантної плазміди pSPAA(tr) Для проведення процедури конструювання використовували плазміду рЕТ24а(+). Вказана плазміда, виробництва компанії Novagen (Madison, Wisconsin, USA), є доступною комерційно. T7/laс-промотор (16 п.н.) є синтетичним та видозміненим фрагментом ДНК промотора одного з ранніх генів фага Т7, а T7-термінатор (46 п.н.) є синтетичним та видозміненим фрагментом ДНК термінатора одного з ранніх генів фага Т7. Для синтезу в полімеразній ланцюговій реакції з метою отримання фрагменту гена SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae для подальшого клону 58464 6 вання, виділили ДНК із штаму "149" Erysipelothrix rhusiopathiae, та з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів #5714-388 (GCGGATCCATGACTGATGCTTATATTG), і #SPA1241 (GCTGTCGACATGACTTTCAGGCTCT), які фланкують фрагмент гена SPAA, синтезували в ПЛР цей фрагмент. 5'-кінець прямого та 3'-кінець зворотного праймерів містить додаткові фрагменти, комплементарні полілінкеру вектора рЕТ24а(+). ПЛР-продукт, синтезований з використанням таких "доважок", фланкували послідовностями вектора, тому він містить додаткові сайти для рестрикції з можливістю клонування у вектор. Всі параметри ПЛР оптимізували до умов, які забезпечують синтез ДНК з мінімальними помилками у послідовності. Ефективність ПЛР оцінювали електрофоретично. Для перевірки ідентичності ампліфікованого фрагмента до послідовності гена SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae, проводили його секвенування з використанням додаткового праймеру #SPA-795, яке підтвердило, що фрагмент гену SPAA синтезувався без помилок. Для клонування ПЛР-продукту використовували дві ендонуклеази рестрикції: ВаmНІ та SalI, сайти для яких фланкують відкриту рамку зчитування. Контроль повноти гідролізу ДНК цими ферментами контролювали електрофоретично, після чого проводили лігування з використанням лігази Т4 з подальшою трансформацією лігазною сумішшю компетентних клітин Е. соlі штаму XL-1. Клітини висівали на агаризоване середовище LB, яке має склад (на 1 дм3): бакто-триптон - 10 г, бактодріжджовий екстракт - 5 г, хлорид натрію - 10 г, бакто-агар 15 г, канаміцин - 50 мг, вода - до 1 дм3. Колонії трансформантів піддавали скринінгу на присутність в них рекомбінантної плазміди мето 7 дом ПЛР. Для цього замість матричної ДНК стерильним наконечником для автоматичної піпетки вносили слідову кількість клітин-трансформантів. Паралельно з цим колонії трансформантів пересівали у рідке середовище з метою виділення рекомбінантних плазмід з подальшим визначенням їх електрофоретичної рухливості. Результати аналізу рекомбінантних плазмід свідчили про те, що клонування ПЛР-продукту, який відповідає гену SPAA Erysipelothrix rhusiopathiae, пройшло успішно. Рекомбінантна плазміда pSPAA(tr) містила додатковий фрагмент ДНК, послідовність якого відповідає послідовності, представленій на Фігурі 2. Таким чином, заявлена корисна модель дозволяє одержати рекомбінантну плазміду pSPAA(tr) з підвищеною стабільністю, на основі якої отримують продуцент клітин Escherichia coli B121(DE3), здатний експресувати рекомбінантний білок SPAA Erysipelothrix rhusiopathiaep з М.м. 47 кДа. Джерела інформації 58464 8 1. Galan J.E. Cloning and expression in Escherichia coli of a protective antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae I J.E. Galan., J. F. Timoney. - Jour. Infection and immunity, 1990. Vol.58, No.9. - P. 3116-3121. 2. Patent WO 00/47744 Word Intellectual Property Organization, IPS C12N, 15/31, C07K 14/195, A61K 39/02. Antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae comprising an immuno-protective epitope / Fischetti V.A,, Court J., Shimoji Y.; Inventors / Applicants The Rockefeller University [US]. - Priority Data 10.02.1999; Public. Date 17.08.2000. 3. Imada Y. Enzyme-linked immunosorbent assay employing a recombinant antigen for detection of protective antibody against swine erysipelas / Imada Y., Mori Y., Daizoh M. - Journal of clinical microbiology, 2003. - Vol. 41, No 11. - P. 5015-5021. 4. Ho To Genetic and Antigen Diversity of the Surface Protective Antigen Proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae/ Ho To, S. Hagai - Clinical and Vaccine Immunology, 2007. - Vol.14, No 7. - P.813-820. 9 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 58464 Підписне 10 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601