Спосіб стандартизації квіток ромашки лікарської (matricaria recutita l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Спосіб стандартизації квіток ромашки лікарської (Matricaria recutita L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах, що включає використання методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), який відрізняється тим, що квітки ромаш 3 64788 Як зазначалося, в сировині квіток ромашок містяться біологічно активні речовини апігенін та лютеолін [1, 2]. Виходячи з цього, з застосуванням методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), нами було розроблено хроматографічну методику визначення апігеніну та лютеоліну в сировині квіток ромашки. За розробленою методикою було проаналізовано квітки ромашки різних вітчизняних виробників. Зокрема, були проаналізовані наступні препарати ромашки лікарської: 4 квітки ромашки в упаковці по 40 г (Виробники: ЗАТ "Ліктрави" (серії: 550810, 640910) та КП "Фармація" (серія 3631)); квітки ромашки в пачках по 75 г (Виробник: "Мудрий травник" (серія 10N)); квітки ромашки в фільтр-пакетах по 1,5 г (Виробники: ЗАТ "Ліктрави" (серія 281010) та ЗАТ ФФ "Віола" (серія 231110)). Вміст апігеніну та лютеоліну в квітках ромашки лікарської різних вітчизняних виробників представлено в табл.1. Таблиця 1 Вміст апігеніну та лютеоліну в досліджуваних препаратах квіток ромашки лікарської № п/п 1 2 3 4 5 6 Препарат квіток ромашки Квітки ромашки в упаковці по 40 г Квітки ромашки в пачках по 75 г Квітки ромашки в пачках по 40 г Квітки ромашки в пачках по 40 г Квітки ромашки в фільтр-пакетах по 1,5 г Квітки ромашки в фільтр-пакетах по 1,5 г Виробник, № серії КП "Фармація", серія 3631 "Мудрий травник" серія 10N ЗАТ "Ліктрави", серія 550810 ЗАТ "Ліктрави", серія 640910 Вміст лютеоліну (в %) в Вміст апігеніну (в %) в перерахунку на висушену перерахунку на висушесировину ну сировину 0,0134±0,0010 0,0481±0,0032 0,0140±0,0011 0,0479±0,0045 0,0113±0,0011 0,0230±0,0016 0,0114±0,0010 0,0257±0,0021 ЗАТ "Ліктрави", серія 281010 0,0087±0,0008 0,0149±0,0010 ЗАТ ФФ "Віола", серія 231110 0,0086±0,0005 0,0157±0,0014 Згідно з даними, представленими в таблиці, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено флавоноїди апігенін та лютеолін. Вміст зазначених флавоноїдів в досліджуваній сировині лежить в межах від 0,0086±0,0005 % до 0,0140+0,0011 % в перерахунку на висушену сировину для лютеоліну і від 0,0149±0,0010 % до 0,0481±0,0032 % для апігеніну. Процес ідентифікації та кількісного визначення апігеніну та лютеоліну як компонентів сировини квіток ромашки в багатокомпонентних рослинних сумішах полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення апігеніну та лютеоліну як компонентів ромашки лікарської та біологічно активних речовин інших рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити ідентифікацію сировини квіток ромашки в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності апігеніну та лютеоліну і визначення їх вмісту. Таким чином забезпечується можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина квіток ромашки лікарської. Поставлена задача вирішується тим, що запропонована ідентифікація та кількісне визначення апігеніну та лютеоліну як компонентів квіток ромашки за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водно ацетонітрильної рухомої фази, застосування якої дозволяє добитися розділення піків апігеніну та лютеоліну ромашки лікарської та біологічно активних речовин інших рослин. Приклад 1: Приготування досліджуваного розчину: 5 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: квіток ромашки лікарської - 1 г, плодів глоду колючого - 1 г, листя кропиви дводомної - 1 г, коренів цикорію дикого - 1 г, трави споришу - 1 г, кори дуба - 1 г, квіток нагідок лікарських - 1 г, плодів шипшини - 1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, трави звіробою 1 г, насіння льону - 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 25 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18SPE Tubes2ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25% етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. 5 По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину стандартів апігеніну та лютеоліну поперемінно хроматографують в наступних умовах: колонка С18 Х-Теrrа, розміром 150 мм  4,6 мм, розмір часток 5 мкм; рухома фаза: 0-10 хв.: ізократичне елюювання 80 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та 20 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); 10-16 хв.: градієнтне елюювання від 80 % до 74 % суміші ацетонітрил 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та від 20 % до 26 % суміші ацетонітрил 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); 16-30 хв.: ізократичне елюювання 74 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та 26 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 30-35 хв.: градієнтне елюювання від 74 % до 10 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та від 26 % до 90 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); 35-40 хв.: ізократичне елюювання 10 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та 90 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); 40-55 хв.: ізократичне елюювання 80 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та 20 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); температура колонки 34 °C; довжина хвилі детектування 350 нм; швидкість потоку рухомої фази 1мл/хв. Вміст апігеніну та лютеоліну в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: A пр  Сст  100  100  100 ; X А ст  mпр  100  W  де А пр - площина піку апігеніну або лютеоліну на хроматограмі досліджуваного розчину; А ст - площина піку апігеніну або лютеоліну на хроматограмі стандартного розчину апігеніну; Сст - концентрація апігеніну або лютеоліну в стандартному розчині, г/мл; mпр - наважка досліджуваної суміші, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування стандартного розчину: по 0,005 г (точна наважка) достовірного стандарту апігеніну та лютеоліну вміщують в мірну колбу місткістю 25 мл, розчиняють в 15 мл метанолу, доводять метанолом до мітки та перемішують. 1 мл отриманого розчину вміщують в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять до мітки метанолом та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинні бути присутні піки, час виходу яких відповідає часу виходу піків апігеніну та лютеоліну на хроматограмі стандартного розчину. На підставі експериментальних даних для сировини квіток ромашки нами рекомендовано наступні граничні вмісти: для апігеніну - не менше 0,012 %, для лютеоліну - не менше 0,007 %, у перерахунку на висушену сировину. 64788 6 За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Модельна суміш без вмісту квіток ромашки. 5 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: плодів глоду колючого - 1 г, листя кропиви дводомної - 1 г, коренів цикорію дикого - 1 г, трави споришу - 1 г, кори дуба - 1 г, квіток нагідок лікарських - 1 г, плодів шипшини - 1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, трави звіробою 1 г, насіння льону - 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 25 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Екстракт квіток ромашки. 1 г (точна наважка) подрібненої сировини квіток ромашки вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 25 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Хроматограми стандартного розчину, екстракту квіток ромашки, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту квіток ромашки представлені на Фіг.1, Фіг.2, Фіг.3 та Фіг.4 відповідно. За даних умов аналізу пік апігеніну має час виходу біля 27,0 хвилин, пік лютеоліну - 18,4 хвилин (Фіг.1). На хроматограмах екстракту квіток ромашки та досліджуваного розчину присутні піки апігеніну та лютеоліну (Фіг.2 та Фіг.3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту квіток ромашки (Фіг.4) - дані піки відсутні. 7 64788 На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять квітки ромашки лікарської, плоди глоду колючого, листя кропиви дводомної, корені цикорію дикого, трава споришу, квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, корені кульбаби лікарської, кора дуба, трава звіробою та насіння льону, присутність та вміст квіток ромашки можна визначати за наявністю та кількісним вмістом флавоноїдів апігеніну та лютеоліну. Спосіб дає можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини квіток ромашки 8 в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять квітки ромашки лікарської, плоди глоду колючого, листя кропиви дводомної, корені цикорію дикого, трава споришу, квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, корені кульбаби лікарської, кора дуба, трава звіробою та насіння льону за наявністю та вмістом апігеніну та лютеоліну як фізіологічно активних компонентів, що присутні в квітках ромашки лікарської. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та корисній моделі наведено в таблиці 2. Таблиця 2 Характеристика способів стандартизації квіток ромашки лікарської № п/п Об'єкт 1 Найближчий аналог 2 Корисна модель Компонент Об'єкти дослідження Апігенін-7Моносировина квіток ромашки аптечної глюкозид Апігенін, лютеолін Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: квітки ромашки лікарської, плоди глоду колючого, листя кропиви дводомної, корені цикорію дикого, трава споришу, квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, корені кульбаби лікарської, кора дуба, трава звіробою та насіння льону Джерела інформації: 1. McKay D., Blumberg J. A review of the bioactivity and potential health benefits of chamomile tea (Matricaria recutita L.) // Phytother Res. - 2006. Vol. 20(7). P. 519-530. 2. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейство Asteraceae (Compositae). СПб.: Наука, 1993, - 351 с. 3. Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 1. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1128 с. 4. Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 2. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1126 с. 5. Shukla S., Gupta S. Apigenin: a promising molecule for cancer prevention // Pharm Res. - 2010. - Vol. 27(6). - P. 962-978. Метод визначення Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації моносировини квіток ромашки лікарської Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації сировини та багатокомпонентних рослинних сумішей квіток ромашки лікарської 6. Carneiro C., Amorim J., Cadena S., Noleto G., Di Mascio P., Rocha M., Martinez G. Effect of flavonoids on 2'-deoxyguanosine and DNA oxidation caused by singlet molecular oxygen // Food Chem Toxicol. - 2010. - Vol. 48. - P. 2380-2387. 7. Said A., Tundis R., Hawas U.W., El-Kousy S.M., Rashed K., Menichini F., Bonesi M., Huefner A., Loizzo M.R., Menichinib F. In vitro antioxidant and antiproliferative activities of flavonoids from Ailanthus excelsa (Roxb.) (Simaroubaceae) leaves // Z. Naturforsch. С - 2010. - Vol. 65. P. 180-186. 8. Державна Фармакопея України / ДП "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид. Доповнення 3. - X.: ДП "Науково-експертний фармакопейний центр", 2009. - 280 с. 9. Stakilas S. Extraction, separation and detection methods for phenolic acids and flavonoids // J. Sep. Sci. - 2007. - Vol. 30(18). - P. 3268-3295. 9 Комп’ютерна верстка А. Рябко 64788 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601