Спосіб підвищення продукції флавінмононуклеотиду (фмн) штамом-надпродуцентом імв y-5028 candida famata

Спосіб підвищення продукції флавінмононуклеотиду (ФМН), що включає підбір концентрацій компонентів середовища за допомогою методу математичного моделювання експериментів, який відрізняється тим, що для максимального синтезу ФМН штамом-надпродуцентом ІMB Y-5028 Candida famata додатково визначають оптимальні параметри культивування (густина культури, час вирощування, температура, рН). (19) (21) u201110685 (22) 05.09.2011 (24) 10.01.2012 (46) 10.01.2012, Бюл.№ 1, 2012 р. (72) СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ, ЯЦИШИН ВАЛЕНТИНА ЮРІЇВНА, ФЕДОРОВИЧ ДАРІЯ ВАСИЛІВНА (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ 3 66755 рН). Запропонований спосіб забезпечує високу продуктивність синтезу ФМН і скорочує час ферментації. Спосіб підвищення продукції ФМН ілюструється графічним матеріалом, на якому зображено вміст ФМН у культуральній рідині рекомбінантного штаму С. famata ІMB Y-5028 при різному часі культивування. У запропонованому способі використовуються наступні методи: центральний композиційний аналіз [6], програмний пакет Statistica® 6.0 Stat Soft, Inc. Вміст флавінів у культуральній рідині визначають на флюорометрі. Вміст ФМН у культуральній рідині визначають флюорометрично після хроматографічного розділення в 5 % Na2HPO4. Спосіб здійснюють кількома етапами. Етап 1. Визначення густини культури, найбільш сприятливої для синтезу ФМН штамом C. famata ІMB Y-5028. При засіві 0,10 мг/л тривалість культивування, яка забезпечує утворення ФМН, становить 48-60 4 год. Інкубація густої суспензії клітин забезпечує скорочення часу культивування культури для максимального нагромадження ФМН. Густину культури, найбільш сприятливу для синтезу ФМН штамом С. famata ІMB Y-5028, визначають при інкубації клітин у рідкому модифікованому середовищі Беркгольдера наступного складу (г/л): сахароза - 20; сечовина - 1; КН2РО4 – 4,277; MgSO4·7H2O 0,2; СаСl2 2,786; (NH4)6Мо7О24·4Н2О - 0,253; CuSO4·5H2O - 0,0025; дріжджовий екстракт - 3,205; а також біотин - 1 мг/л; мікроелементи у кінцевій концентрації: 0,2 мкМ CuSO4; 4,5 мкМ MnSO4; 2,0 мкМ NaMoO4, 0,75 мкМ Н3ВО3; 17,5 мкМ ZnSO4 [4]. Частота перемішування становить 220 об./хв., температура - 28 °C, час інкубації - 17 год. Біосинтез ФМН за умов такої інкубації помітно залежить від початкової концентрації клітин у середовищі (Табл. 1). Таблиця 1 Вміст флавінів у культуральній рідині рекомбінантного штаму ІМВ Y-5028 С. famata при різній початковій густині клітин Густина клітин, мг/мл 2,0 3,0 5,0 7,5 Сумарний вміст флавінів, мг/л 155,6±0,55 332,5±0,53 328,7±0,98 376,4±1,00 Р < 0,05 Сумарний вміст флавінів зростає відповідно до зростання густини суспензії, однак, вміст ФМН є максимальним при інкубації 3 мг/мл клітин протягом 17 год. у модифікованому СБ. При цьому відсотковий вміст ФМН також є найвищим при інкубації 3 мг/л клітин. Етап 2. Визначення часу культивування для максимального синтезу ФМН штамом C. famata ІMB Y-5028. Час культивування визначають при інкубації 3 мг/мл клітин у рідкому модифікованому середовищі Беркгольдера [4] із частотою перемішування 220 об/хв та температурою 28 °C. Загальній час інкубації клітин штаму ІMB Y5028 С. famata становить 48 год. Як видно на наведеному графіку, синтез ФМН досягає макси ФМН, мг/л 83,9±0,22 195,5±0,41 188,0±0,81 176,9±0,55 %ФМН 53,9±5,03 58,8±2,38 57,2±1,39 47,0±4,73 мального рівня - 218,2±7,73 мг/л на 21 год. інкубації 3 мг/мл клітин. Етап 3. Визначення вплину температури, рН та перемішування на біосинтез ФМН штамом C. famata ІMB Y-5028. Вплив температури та рН на біосинтез ФМН штамом С. famata ІMB Y-5028 визначають при інкубації 3 мг/мл клітин у рідкому модифікованому середовищі Беркгольдера [4] із частотою перемішування 220 об/хв, час інкубації- 21год. (Табл. 2). Температура культивування має суттєвий вплив на рівень синтезу ФМН. Найкращою для продукції ФМН є температура 28 °C. Вплив рН на синтез ФМН не є настільки суттєвим, як вплив температури, оптимальним значенням рН є 5,5. Таблиця 2 Вміст ФМН (мг/л) у культуральній рідині штаму С. famata ІMB Y-5028 за умов інкубації при різних значеннях температури (t, °C) і рН pH \ t, °C 24 28 35 38 42 3,5 101,0±5,22 190,1±7,21 43,0±4,12 19,0±2,11 9,3±2,22 4,0 104,0±9,08 194,0±8,99 44,0±3,55 20,0±3,33 9,9±1,01 4,5 139,0±9,89 205,0±2,11 40,0±3,09 15,5±3,24 11,0±2,10 5,0 146,8±9,89 205,1±7,68 40,0±1,12 13,3±4,05 11,6±8,67 5,5 201,1±5,31 209,0±5,54 33,8±2,11 11,6±2,11 4,4±0,09 6,0 206,0±6,51 196,9±5,76 22,2±3,22 12,2±1,09 2,2±1,09 5 66755 Найвищий рівень синтезу ФМН спостерігається при помірному перемішуванні. Серед дослідженої частоти перемішування (100, 220 та 300 об/хв), найбільше ФМН (205 мг/л ) синтезується при 220 об/хв. Етап 4. Оптимізація концентрації компонентів середовища культивування для максимального нагромадження ФМН штамом С. famata ІMB Y5028. Для з'ясування, які концентрації компонентів середовища є важливими для підвищення рівня синтезу ФМН, застосовують методи математичного моделювання експериментів, зокрема, центральний композиційний аналіз. Цей процес включає наступні етапи: постановка відповідного експерименту, обчислення коефіцієнтів математичної моделі, а також передбачення відповіді та перевірка адекватності моделі. Використовують компоненти середовища, які, як було встановле 6 но [4], мають позитивний вплив на продукцію ФМН. Кожен із досліджуваних компонентів використовують в експериментах у 5 різних концентраціях (Табл. 3), що умовно позначаються «–2», «–1», «0», «1», «2». Схема матриці, експериментальні значення та теоретично розраховані значення відображено у табл. 4. Для статистичних маніпуляцій компоненти закодовані згідно з наступним рівнянням: x  x0 Xi  i , xi де Xі - кодоване значення незалежної змінної хі, хі - дійсне значення незалежної змінної, х0 - дійсне значення незалежної змінної в центральній точці, Δхі - покрокова різниця. Таблиця 3 Позначення та концентрації компонентів середовища для центрального композиційного аналізу з метою оптимізації синтезу ФМН штамом C. famata ІMB Y-5028 Компоненти середовища КН2РО4 СаСl2·6Н2О (NH4)6Mo7O24·4Н2О CuSO4·5H2O Дріжджовий екстракт Позначення Некодовані Кодовані x1 X1 x2 X2 x3 Х3 x4 X4 х5 X5 Вплив кожного компонента, їх взаємодія та статистичний аналіз отриманих передбачуваних значень визначають згідно з рівнянням: Y  0   i Xi   ijXi X j   iiXi2 , де Y - передбачувана відповідь, β0 - компенсаційний коефіцієнт, βi - лінійний вплив, βіі - квадратичний вплив, βij - ефект взаємодії, Xi та Xj - рівні незалежних змінних. Статистичний аналіз моделі здійснюють за допомогою пакета статистики ANOVA. Для цих процедур використовують програмний пакет Statistica® 6.0 Stat Soft, Inc. Матриця для центрального композиційного -1 аналізу представляє 25 план факторного експерименту із дробними репліками, що включає 11 центральних значень та 10 аксіальних значень, де одна варіанта взята в екстремальному зна -2 3,0000 1,5000 0,1500 0,0015 1,500 Концентрація, г/л -1 0 1 4,0000 5,0000 6,0000 2,0000 2,5000 3,0000 0,2000 0,2500 0,3000 0,0020 0,0025 0,0030 2,0000 2,5000 3,0000 2 7,0000 3,5000 0,3500 0,0035 3,5000 ченні (+2 або -2), а інші - у центральних значеннях. Експериментальні дані, наведені у Табл. 4, є поліноміальною моделлю нелінійної регресії другого порядку. Емпіричні взаємодії між відзивом та аналізованими варіантами описуються поліноміальним рівнянням другого порядку: Y  334,448  7,356X1  6,990X 2  4,560X 3  2,315X 4  2 2  15,148X 5  1803X1  3,453X 2  4,690X 3  , 2 2  0,153X 2  1772X 5  14,678X1X 2  7,666X1X 3  , 4  3,541X1X 4  0,034X1X 5  6,566X 2 X 3  0,653X 2 X 4   4,641X 2 X 5  0,722X 3 X 4  0,928X 3 X 5  5.603X 4 X 5 де Y - очікуване значення продукції ФМН (мг/л), а Х1, Х2, Х3, Х4 та Х5 - кодовані значення компонентів (КН2РО4, СаСl2, (NН4)6Мо7О24, CuSO4 та дріжджовий екстракт, відповідно). 7 66755 8 Таблиця 4 Матриця для центрального композиційного аналізу та продукція ФМН штамом C. famata IMB Y-5028 як результат аналізу № п/п 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Концентрації компонентів X1 Х2 X3 Х4 Х5 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 1 1 1 -2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 -2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 -2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 -2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 -2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 о 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ФМН, мг/л Експериментальні значення 309,1 309,6 299,2 322,8 337,1 381,1 375,7 353,7 342,6 351,4 305,8 285,4 330,6 300,9 297,6 328,3 333,3 317,9 321,8 316,3 317,9 310,2 327,3 337,1 293,7 386,1 336,1 336,6 341,5 336,6 333,3 333,3 336,6 341,5 323,4 325,0 336,1 Центральний композиційний аналіз та аналіз «на поверхні відзиву» дали змогу визначити оптимальні для синтезу ФМН концентрації компонентів середовища, а саме: КН2РО4 - 4,999 г/л; СаСl2·6Н2О - 2,600 г/л; (NH4)6Mo7O24·4H2O - 0,240 г/л; СuSO4·5H2O - 0,0013 г/л; дріжджовий екстракт - 2,198 г/л. Прогнозований максимум продукції ФМН згідно з цими значеннями становив 328,25 мг/л. Порівняно зі складом середовища, використаного раніше [4], дане оптимізоване середовище містить на 15 % більше КН2РО4, на 7 % менше СаСl2, на 5 % менше (NH4)6Mo7O24, вдвічі менше CuSO4 та на 31 % менше дріжджового екстракту. Прогнозовані значення 313,3 306,0 298,1 329,8 325,0 377,1 374,1 344,3 342,4 359,3 316,1 288,0 329,9 292,4 291,6 330,5 341,9 312,5 306,7 334,6 324,8 306,6 329,2 338,5 311,2 371,8 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 334.4 334,4 334,4 334,4 334,4 334,4 Для перевірки даних центрального композиційного аналізу 3 мг/мл клітин дріжджів інкубували у 100 мл колбах, що містять 10 мл середовища оптимізованого складу (згідно з прогнозованими даних моделі) (г/л): сахароза 20; сечовина - 1; КН2РО4 - 4,999; MgSO4·7H2O 0,2; СаСl2 - 2,600; (NH4)6Mo7O24·4H2O - 0,240; CuSO4·5H2O - 0,0013; дріжджовий екстракт 2,198; а також біотин - 1 мг/л; мікроелементи у кінцевій концентрації: 0,2 мкМ CuSO4; 4,5 мкМ MnSO4; 2,0 мкМ NaMoO4, 0,75 мкМ Н3ВО3; 17,5 мкМ ZnSO4. Частота перемішування становила 220 об/хв, температура - 28 °C, час інкубації - 21 год, рН 5,5. 9 Результати, отримані у трьох окремих експериментах, були близькими до прогнозованих результатів. Передбачувана продукція ФМН становила 328,25 мг/л, тоді як експериментально отримано 318,2±7,411 мг/л ФМН. Це підтверджує достовірність теоретичної моделі. Джерела інформації: 1. Березовский В. М. Химия витаминов.- М.: Пищевая пром., 1973. - 632 с. 2. Stahmann K. P. et al. Microbiol. and Biotechnol. - 2000. - Vol. 53, N5 - P. 509-516. - 196 p. Комп’ютерна верстка М. Мацело 66755 10 3. Патент України на винахід № 87684 МПК С12Р25/00 а12 N15/00; опублік. 10.08.2009 р., Бюл. № 15. 4. Yatsyshyn V. Y. et al. Metabol. Eng. -2009. Vol. 11, №. 3. -P. 163-167. 5. Yatsyshyn V. Y. et al. Biochem. Eng. J. 2010. - Vol. 49, № 1. - P. 52-60. 6. Montgomery D. C. Design and Analysis of Experiments / D. C. Montgomery. - [4-th edn.]. -NY: Wiley, 1997. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601