Штам дріжджів candida famata imb y-5034 – продуцент рибофлавіну (вітаміну в2)

Штам дріжджів Candida famata IMB Y-5034 продуцент рибофлавіну. (19) (21) a200804793 (22) 14.04.2008 (24) 25.05.2010 (46) 25.05.2010, Бюл.№ 10, 2010 р. (72) СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ, ДМИТРУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, ФЕДОРОВИЧ ДАРІЯ ВАСИЛІВНА 3 90754 4 скуча, жовтуватого кольору. На скошеному суслоЕтап 1. Селекція штамів і підвищеною флавіагарі 3-х добовий штрих гладкий однорідний блисногенною активністю. кучий, жовтуватого забарвлення. Вихідним штамом для селекції є колекційний Клітини штаму С.famata ІMB Y-5034 асимілюштам з колишньої Всесоюзної (тепер Всеросійсьють сахарозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, целокої) колекції мікроорганізмів ВКМ У-9. Відбір флабіозу, крохмаль, янтарну кислоту, глутамінову кисвіногенного штаму методами класичної селекції лоту, сорбітол, лактозу, лактат, манніт, гліцерин; включає 6 етапів. На першому, третьому, четверслабо ростуть на мальтозі, арабінозі, інозиті, етатому та п'ятому етапах селекції як мутаген викоринолі, маннозі, ксилозі, рамнозі, ксиліті, дульцин, стовують ультрафіолет, на другому - нітрозогуанірафінозі, меліцитозі, трегалозі, сорбозі, проте не дин, а на шостому - етилметансульфонат. Доза використовують яблучну кислоту. мутагену підбирається таким чином, аби забезпеКлітини сконструйованого штаму не ферменчити 10% виживання клітин. тують сахарозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, лакНа першому етапі селекції використовують тозу, крохмаль, трегалозу, рафінозу, целобіозу та структурний аналог РФ - 7-метил-8-трифторметилмеліцитозу. Як джерело азоту штам С.famata ІMB 10(1'-рибітил)-ізоалоксазин (МТРІ). Він гальмує Y-5034 використовує сульфат амонію, диамоній ріст штаму ВКМ У-9 лише за наявності в середофосфат, сечовину, але не нітрат натрію. вищі високих концентрацій йонів сульфату або Штам С.famata 1MB Y-5034 належить до обліфосфату. Тому селекцію резистентних мутантів гатних аеробів. Оптимум температури становить ведуть в середовищі з МТРІ (200мкг/мл) та 0,6М 30°С, оптимум рН становить 6,5-9,0. K2SO4. Найбільш флавіногенний мутант, що наШтам зберігається на агаризованому суслогромаджував у колбах Ерленмейєра об'ємом 50мл агарі в холодильнику. Клонуються двічі на рік, на в середовищі Беркгольдера з оптимальним для 4-5 день вирощування відсівають 3-4 клони з висоросту вмістом заліза до 35мкг РФ/мл (Фіг.1), викокою флавіногенною активністю. ристовують для подальшої селекції. Для конструювання штаму С.famata 1MB YНа другому етапі як селекційний агент викори5034 використовують такі методи: мутагенез за стовують 8-азагуанін. Відбирають мутанти, резисдопомогою УФ-променів, N-метил-N'-нітро-Nтентні до 8-азагуаніну (200мкг/мл) і перевіряють їх нітрозогуанідину або етилметансульфонату [7]. на здатність до надсинтезу РФ в середовищі з опПолімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструютимальним для росту вмістом заліза. Найкращий вання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід штам, що утворював до 78мкг РФ/мл (Фіг.1), викоз Escherichia coli, рестрикційний аналіз, електрористовують для селекції на третьому етапі. У цьофорез в агарозному гелі, трансформація Е.coli му випадку селекційним фактором служив 6методом електропорації, описані в [8]. Трансфоразаурацил (200мкг/мл). Мутант, стійкий до 6мацію С.famata проводять, як описано в [9]. Видіазаурацилу, що нагромаджує до 176мг РФ/мл лення сумарної ДНК з трансформантів С.famata (Фіг.1), використовують як вихідний на четвертому проводять як для S.cerevisiae [10]. Вміст РФ виетапі. Після УФ мутагенезу, відбирають найбільш значають флуориметрично на приладі ЕФ-3М. флавіногенні мутанти, що стійкі до 2-діазо-5-оксоОтримання продуцента РФ С.famata IMB YL-норлейцину (80мкг/мл). Найкращим виявився 5034 та його характеристика ілюструються графічштам, що синтезує до 380мкг РФ/мл (Фіг.1). ними матеріалами. Нами виявлено, що ріст флавіногенних мутанНа Фіг.1 зображено продукцію РФ штамами тів С.famata пригнічується гуанозином. Тому на С.famata, отриманими на різних етапах селекції, п'ятому етапі отримують флавіногенні мутанти, де на осі абсцис позначено номер етапу селекції, а стійкі до інгібуючої дії на ріст гуанозину на осі ординат - вміст РФ у культуральній рідині. (300мкг/мл). В результаті відібрано найкращий Нa Фіг.2 зображена лінійна схема плазміди штам, що синтезує до 450мкг РФ/мл (Фіг.1). рТb (4.0 т.п.н.), де відкриту рамку трансляції гену Останній етап класичної селекції базується на ble Staphylococcus aureus позначено товстою сінашому спостереженні, що флавіногенні мутанти рою лінією; промотор власного гену TEF1 - товсС.famata практично не здатні до надсинтезу РФ тим білим відрізком; бактерійна послідовність при культивуванні в забуференому середовищі pUC57 - тонкою лінією; хвилястою лінією позначепри рН6,8. Оброблені етилметансульфонатом кліно хромосомну ДНК інсерційного штаму, товстою тини флавіногенного мутанта, отриманого на попосмугованою лінією позначено ген SEF1; скоропередньому етапі селекції, висівають на агаризочення сайтів рестрикції: Н, HindIII; Sp, SphI; Р, PstI; ване середовище Беркгольдера, що містить 0,1М S1, SalI; Xb, XbaI; B, BamHI; Sm, SmaI; K, KpnI; Sc, К-фосфатний буфер, рН6,8 й і відбирають найжовSacI; R, EcoRI. тіші колонії. Їх флавіногенну активність перевіряНа Фіг.3 зображено зміни продуктивності флають у незабуференому середовищі Беркгольдера. віногенезу вихідного штаму С.famata AF4, ІMB YНайбільш флавіногенним серед 87 перевірених 5033 та ІMB Y-5034 протягом 3 днів вирощування, (жовтих на забуференому середовищі колоній) де на осі абсцис відкладений час вирощування, а виявився штам AF4, що нагромаджує за 4 доби на осі ординат - продуктивність флавіногенезу культивування на круговій качалці при 200об/хв до (кількість утвореного РФ в перерахунку на мг біо688мг РФ/мл (Фіг.1). маси). Протягом кожного етапу селекції перевіряють Штам дріжджів С.famata ІMB Y-5034 - продуздатність відібраних флавіногенних мутантів до цент РФ з високою стабільністю за ознакою „надросту в середовищі з етанолом як єдиним джересинтез РФ" отримують у декілька етапів. лом вуглецю і енергії і відбирають для подальшого поліпшення лише штами, які здатні утилізувати 5 90754 6 етанол. Це дозволяє уникнути небезпеки реверсії Етап 3. Перевірка стабільності сконструйовафлавіногенних штамів за ознакою здатності рости ного штаму та його здатності до надсинтезу РФ. на етанолі, що корелює у промислового продуценДля перевірки стабільності штами С.famata та РФ, штаму АТСС 20849, з втратою здатності до ІMB Y-5033 (прототип), AF4 та ІMB Y-5034 висіванадпродукції вітаміну В2. ють на чашки з середовищем YPD, через 1 добу Етап 2. Одержання рекомбінантних штамів засівають у 50мл цього ж середовища в колби С.famata і додатковою копією гену SEF1. об'ємом 100мл. Після вирощування протягом 1,5 Для стабілізації отриманого штаму AF4 за доби клітини осаджують центрифугуванням, двічі ознакою „надсинтез РФ" в його геном вводять допромивають стерильною дистильованою водою і даткову копію гену SEF1 D.hansenii. Ген SEF1 ковисівають на синтетичне середовище Беркгольдедує транскрипційний фактор, залучений у регуляра, що містить 1% етанол як джерело вуглецю, в цію біосинтезу РФ у дріжджів [11]. Для ведення в кількості 15х106 клітин на чашку. Через 14 днів геном мутанта AF4 додаткової копії гену SEF1 підраховують кількість колоній на чашці і розрахоD.hansenii його трансформують плазмідою вують частоту реверсії. Як видно з таблиці 1, сконpTDhSEF1 (Фіг.2). Перевіряють здатність до надструйований штам С.famata ІMB Y-5034 характесинтезу РФ в отриманих трансформантів. Найвиризується високою стабільністю: після 14 днів щу флавіногенну активність виявлено у штаму культивування він зовсім не вищеплює нефлавіноС.famata ІMB Y-5034, який нагромаджує при вирогенних клонів, здатних до утворення великих за щуванні в простому цукрово-мінеральному серерозміром колоній при рості на середовищі з етанодовищі більше 1г РФ/л. лом. Частота реверсії для раніше отриманого стаШтам дріжджів С.famata ІMB Y-5034 пройшов більного штаму С.famata ІMB Y-5033 становить лабораторне випробування. 13,8х10-6 [6], а штаму AF4 - 0,4х10-6. Таблиця 1 Частота появи клонів, здатних до росту на етанолі у штамів С.famata AF4, ІMB Y-5033 та ІMB Y-5034 Штам С.famata AF4 С.famata ІMB Y-5033 С.famata ІMB Y-5034 Для перевірки здатності до синтезу РФ штам С.famata 1MB Y-5034 вирощують на чашці Петрі на агаризованому середовищі Беркгольдера із 0,5% дріжджовим екстрактом при 30°С протягом 1 доби. Отриману культуру висівають в колби (300мл) із рідким середовищем Беркгольдера, що Частота реверсії 0,4x10-6 13,8x10-6 містить 0,5% дріжджовий екстракт (50мл в колбі), витримують протягом 1-5 діб на круговій качалці (швидкість обертання 200об./хв) при 28°С, після чого визначають вміст РФ в культуральній рідині. Результати досліджень наведені в табл.2. Таблиця 2 Динаміка продукування РФ штамом С.famata ІMB Y-5034 Час росту, діб 1 2 3 4 5 За даними табл.2 РФ інтенсивно синтезується на 2 добу культивування, максимальний вихід продукту спостерігається на 5 добу. Продуктивність флавіногенезу (кількість утвореного РФ в перерахунку на одиницю біомаси) сконструйованого штаму С.famata ІMB Y-5034 на 3 добу культивування у 3 рази вища, ніж у штаму С.famata AF4 та ІMB Y-5033 (Фіг.2). Вміст РФ, мг/л 20,9±1,9 776,7±67,2 1108,2±5,0 1155,9±99,6 1210,4±105,1 Продукція РФ сконструйованим штамом С.famata ІMB Y-5034 та штамами С.famata AF4 та ІMB Y-5033, вирощеними на середовищах різного складу (середовище Беркгольдера (СБ) і СБ + дріжджовий екстракт (СБ+ДЕ), представлена у табл. 3. 7 90754 8 Таблиця 3 Продукція РФ штамами Candida famataAF4, ІMB Y-5033 та ІMB Y-5034, вирощеними в колбах у середовищах різного складу Штам AF4 ІMB Y-5033 ІMB Y-5034 Вміст РФ (мг/л) в культуральному середовищі СБ СБ+ДЕ 107,7+76,2 528,6±48,1 177,0±12,1 523,5+40,1 277,1±28,2 1210,4±105,1 За даними табл. 3 штам С.famata ІMB Y-5034 відрізняється від штаму AF4 та ІMB Y-5033 більшою флавіногенною активністю на обидвох використаних середовищах. За умов культивування у колбах на круговій качалці (200об./хв) у середовищі, що містило 2% глюкози, 1% пептону та 0,5% дріжджового екстракту протягом 4 діб запропонований штам нагромаджує більше 1,2г РФ/л. Сконструйований штам С.famata ІMB Y-5034, завдяки підвищеній флавіногенній активності та високій стабільності за ознакою „надсинтез РФ", може бути використаний у виробництві як ефективний продуцент РФ (вітамін) В2). Джерела і нформації: 1. Stahmann К.P. et al. Microbiol. and Biotechnol. - 2000. Vol.53, N 5 - P.509-516. 2. Патент США №009822, опубл.15.12.1988. 3. Патент США №811234, опубл.20.12.1985. 4. Патент США №5164303, опубл.17.11. 1992. 5. Патент США №5231007, опубл.27.07.1993. 6. Заявка на патент України №а2008 03778 від 25.03.2008. 7. Adelberg et al. // Biochem. Biophys. Res. Communs. - 1965. - Vol.18. №5. - P.788-795. 8. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 9. Voronovsky A.A. et al. // FEMS Yeast Research. - 2002. - Vol.2. - P.381-388. 10. Wach A., Pick H., Philipsen P. In: Molecular Genetics of Yeast. А Practical Approach (Johnston, J.R., Ed.), IRL Press, Oxford. - 1994. - P.1-16. 11. Dmytruk K.V. et al. // Curr Genet. - 2006. Vol.50, N 3. - P.183-191. 9 90754 10 11 90754 12 В описі до патенту на винахід графічні зображення та текст подаються в редакції заявника Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601