Штам дріжджів candida famata imb y-5028 – продуцент флавінмононуклеотиду (5`-фмн)

Штам дріжджів Candida famata ІMB Y-5028 продуцент флавінмононуклеотиду (5'-ФМН). (19) (21) a200900362 (22) 19.01.2009 (24) 25.05.2010 (46) 25.05.2010, Бюл.№ 10, 2010 р. (72) СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ, ЯЦИШИН ВАЛЕНТИНА ЮРІЇВНА, ФЕДОРОВИЧ ДАРІЯ ВАСИЛІВНА, ІЩУК ОЛЕНА ПЕТРІВНА, ВОРОНОВСЬКИЙ АНДРІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ (56) UA U 36164, 10.10.2008. UA C2 87684, 10.08.2009. JP A 2138988, 28.05.1990. Ishuk O.P. et al.:” Construction of the flavinogenic yeast Candida famata strains with high riboflavin 3 у штамах С. famata, здатних до надсинтезу РФ, отримують трансформанти з високою активністю РФ-кінази, здатні до синтезу значних кількостей ФМН. Штам дріжджів С. famata IMB Y-5028 зберігається в депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України. Культурально-морфологічні та фізіологобіохімічні особливості штаму С famata 1MB Y-5028. Вегетативні клітини штаму, вирощені в рідкому пивному суслі концентрацією 7 °Б при 30 °С, мають овальну форму, розміром 2,8-5,3×4,5-10,5 мкм, містяться поодиноко, парами, іноді короткими ланцюжками чи невеликими гронами. Не утворюють псевдоміцелію. На агаризованому середовищі колонії віком 7 діб округлі, діаметром 2-3 мм, профіль припіднятий, поверхня гладка, блискуча, жовтуватого кольору. На скошеному агарі трьохдобовий штрих гладкий, однорідний, блискучий, жовтуватого забарвлення. Клітини штаму асимілюють сахарозу, мальтозу, глюкозу, галактозу, манніт, маннозу, сорбіт, арабінозу, фруктозу, трегалозу, рафінозу, целобіозу, меліцитозу; слабо ростуть на сукцинаті, глутаматі, гліцерині, етанолі, дульциті, ксилозі, сорбозі, проте не використовують метанол, малат, кетоглутарат, рамнозу, рибозу, крохмаль. Крім того, клітини даного штаму слабо ферментують сахарозу та глюкозу, не ферментують мальтозу, галактозу, ксилозу, лактозу, крохмаль, трегалозу, рафінозу, целобіозу та меліцитозу. Як джерело азоту клітини використовують сульфат амонію, диамоній фосфат, сечовину, але не нітрат натрію. Штам С. famata належить до облігатних аеробів. Штам росте при температурі 25-32 °С, оптимум температури – 30 °С, оптимум рН становить 6,5-7,0. Штам зберігають на агаризованому суслоагарі в холодильнику. Клонусться двічі на рік і відсівають 3-4 клони на 4-5 день вирощування, використовуючи маркерну ознаку (резистентність до флеоміцину) і активність штаму щодо синтезу ФМН. Для конструювання штаму С. famata IMB Y5034 використовують такі методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia coli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. coli методом електропорації, описані у [4]. Трансформацію С. famata проводять, як описано в [5]. Виділення сумарної ДНК з трансформантів С famata проводять як для S. cerevisiae [6]. Вміст флавінів у зразках визначають флюорометричним методом за допомогою флюорометра Turner Quantech FM 109510-33). Концентрацію ФМН вимірюють на цьому ж флюорометрі після хроматографічного розділення флавінів в 5 % Na2HPO4. Отримання продуцента ФМН С famata 1MB Y5034 та його характеристика ілюструються графічними матеріалами. На Фіг. 1 зображена лінійна схема плазміни p19L2_ble_RIB1Сf_prTEFl_EMN1Dh (~8 т. п. н.), де 90812 4 фрагмент, що містить pUC19, позначено тонкою лінією; фрагмент, що містить ген RIB1 С famata, позначено товстою смугою з горизонтальними лініями; фрагмент, що містить промотор TEF1 С. famata, позначено товстою смугою з вертикальними лініями; фрагмент, що містить ген ble S. aureus, позначено товстою лінією з косими лініями; фрагмент, що містить ген FMN1 D. hansenii, позначено товстою білою лінією, інтрон цього гену позначено крапками; скорочення сайтів рестрикції: Н, HindIII; Sp, SphI; P, PstI; К, КрnI; RI, ЕсоRI S1, SalI В, ВаmHI; Sm, SmaI; Sc, SacI; Xb, XbaI. На Фіг. 2 зображено зміни вмісту ФМН в культуральній рідині штамом №13 С. famata за умов інкубації великої кількості клітин (5 г/л) протягом 70 годин, де на осі абсцис відкладений час вирощування, а на осі ординат -нагромадження ФМН в культуральній рідині. На Фіг. 3 зображена лінійна схема плазміни pUC57 ІМН3_prTEF1 FMN1Dh (~6,75 т. п. н.), де фрагмент, що містить pUC57, позначено тонкою лінією; фрагмент, що містить ген FMN1 D. hansenii, позначено товстою лінією з вертикальними лініями, інтрон цього гена позначено білим прямокутником; фрагмент, що містить промотор TEF1 С famata, позначено сірим прямокутником; фрагмент, що містить ген ІМН3 D. hansenii, позначено товстою лінією з точками, інтрон цього гена позначено білим прямокутником; скорочення сайтів рестрикції: Sc, SacI; S1, SalI В, ВаmHI; P, PstI. На Фіг. 4 зображено питомі активності РФкінази виділених штамів, що містять додаткові копії гена FMN1 D. hansenii. На Фіг. 5 зображено зміни вмісту ФМН в культуральній рідині при інкубації великої кількості клітин (5 г/л) окремих клонів штаму №IMB Y-5028 С famata, що містить додаткову копію гена FMN1 D. hansenii, де на осі абсцис відкладений час вирощування, а на осі ординат - нагромадження ФМН в культуральній рідині. Штам дріжджів С. famata IMB Y-13-76 - продуцент ФМН отримують у декілька етапів. Етап 1. Конструювання плазміди та отримання рекомбінантних штамів С famata, що містять ген FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 С. famata Для одержання штамів з надекспресованим геном FMN1 використовують конструкцію, що містить ген FMN1 з промотором TEF1 [7], переклоновують її у вектор, який містить ген ble Staphylococcus aureus (забезпечує стійкість до флеоміцину) [8]. Сконструйована плазміда має назву p19L2_ble_RIВ1Сf_prTEF1_FMN1Dh. її лінійна схема представлена на Фіг. 1. Плазмідою p19L2_ble_RIВ1Сf_prTEF1_ FMN1Dh трансформують штам С. famata AF4, продукція РФ у якого не залежить від забезпечення залізом [9]. Трансформанти, резистентні до флеоміцину, відбирають на мінімальному середовищі Беркгольдера, що містить флеоміцин у концентрації 1,8 мг/л. Серед низки трансформантів відбирають стабільні інтегранти, резистентні до флеоміцину. Наявність в геномі трансформантів рекомбінантної послідовності, що містить ген FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 С famata та ген ble, перевіряють за допомогою ПЛР. 5 90812 Етан 2. Перевірка активності РФ-кінази та продукції ФМН рекомбінантними штамами С famata Активність РФ-кінази у відібраних штамів та вміст РФ і ФМН в культуральній рідині визначають після 2,5 діб вирощування трансформантів в середовищі Беркгольдера. Результати представлено в таблиці. Проаналізовані трансформанти виявляють у 19-33 рази вищу активність РФ-кінази в порівнянні 6 зі штамом дикого типу (wt) С. famata та в 5-9 разів порівняно з реципієнтним штамом AF4. На відміну від штаму дикого типу, в культуральній рідині трансформантів нагромаджується ФММ. Продукція ФМН у проаналізованих штамів коливається від 2,67 до 24,89 мг/л. Однак, крім ФМН, культуральна рідина містить РФ. Процентний вміст ФМН коливається від 10 до 43 %, в той час як у реципієнтного штаму AF4 - лише 5 %. Таблиця Активність РФ-кінази та вміст ФМН у культуральній рідині штамів, що містять ген FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 C. Famata Штам wt AF4 2 6 7 11 13 16 19 РФ-кіназа, mU/мг білка 0,12 0,46 3,99 2,92 3,31 3,16 3,99 3,02 2,34 ФМН, мг/л 2,67 5,33 17,78 8,00 5,33 24,89 8,89 2,67 Найвищий вміст ФМН виявлено у штаму 13, який нагромаджує при вирощуванні в простому цукрово-мінеральному середовищі понад 24 мг/л ФМН. Досліджено зміни вмісту ФМН в культуральній рідині упродовж інкубації великої кількості клітин (5 г/л) цього штаму. Максимальна продукція ФМН спостерігалася через 48 годин інкубації (до 200 мг/л). Етап 3. Конструювання плазміди та отримання рекомбінантних штамів С. famata, що містять додаткову копію гена FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 C. famata Для подальшого покращення продуцентів ФМН у геном найкращого з відібраних трансформантів (№13) вводять додаткові копії гена FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 С. famata. Для цього конструкцію, що містить промотор TEF1 з геном FMN1 переклоновують у вектор, який містить ген резистентності до мікофенолової кислоти ІМН3 D. hansenii. Сконструйована плазміда отримала назву pUC57_IMH3_prTEF1_FMN1Dh. її лінійна схема представлена на Фіг. 3. Плазмідою pUC57_IMH3_prTEF1_FMN1Dh. трансформують штам №13, який містить ген FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 C. famata. Трансформанти, резистентні до мікофенолової кислоти, відбирають на мінімальному середовищі Беркгольдера, що містить цю кислоту в концентрації 20 мг/л. Серед низки трансформантів відбирають стабільні інтегранти, резистентні до мікофенолової кислоти. Наявність в геномі трансформантів рекомбінантної послідовності плазміни pUC57_IMH3_prTEF1_FMN1Dh., що містить ген FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 С. famata та ген ІМН3, перевіряють за допомогою ПЛР. Флавіни культуральної рідини РФ, мг/л 1,55 49,20 29,30 32,80 26,77 18,18 32,32 31,31 23,74 ФМН, % 5,15 18,19 35,15 23,00 22,67 43,51 22,11 10,11 Етап 4. Перевірка активності РФ-кінази та продукції ФМН рекомбінантними штамами С famata, що містять додаткову копію гена FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 C. famata Активність РФ-кінази у відібраних штамів та нагромадження ФМН у культуральній рідині визначають після 2,5 діб вирощування трансформантів в середовищі Беркгольдера. Активність РФ-кінази сконструйованих штамів приведена на Фіг. 4. Всі проаналізовані трансформанти виявляють у 2,5 4,5 разів, вищу активність РФ-кінази, ніж реципіентний штам №13. Із штаму з найвищою активністю РФ-кінази №13-76 отримано окремі клони і досліджено їх здатність до нагромадження ФМН при інкубації великої кількості клітин (5 г/л) впродовж 48 год. Окремі клони мало відрізнялися за рівнем нагромадження ФМН в культуральній рідині (Фіг. 5). Максимальна продукція ФМН (до 350 мг/л) спостерігалася на 24 год інкубації. Сконструйований штам С. famata IMB Y-5028, завдяки підвищеній здатності до синтезу ФМН без додавання АТФ або його попередників і рибофлавіну у поживне середовище, може бути використаний у виробництві як ефективний продуцент ФМН. Джерела інформації: 1. Березовский В.М. Химия витаминов. - М.: Пищевая промышленность, 1973. - 632с. 2. Патент України №22568, опубл. 25.04.2007, Бюл. №5. 3. Hagihara et al. - 1995. - Appl Microbiol Biotechnol. - Vol. 42, №5. - P.724-729. 4. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 5. Voronovsky A.A. et al. //FEMS Yeast Research. - 2002. - Vol. 2. - P.381-388. 7 6. Wach A., Pick H., Philipsen P. In: Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach (Johnston, J.R., Ed.), IRL Press, Oxford. - 1994. P.1-16. 7. Іщук О.П. Еенно-інженерне конструювання штамів флавіногенних дріжджів Candida famata з високою активністю рибофлавінкінази //Укр. біохім. журнал. - 2006. - Т.78, №5. - С.63-69. 90812 8 8. Dmytruk K.V. et al. //Curr Genet. - 2006. - Vol. 50, N3. - P.183-191. 9. Патент України №36164, опубл. 10.10.2008, Бюл. №19. 9 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 90812 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601