Спосіб протонного ядерно-магнітного резонансного спектроскопічного визначення індукції диференціювання або апоптозу в популяціях клітин

Спосіб протонного ядерно-магнітного резонансного спектроскопічного визначення індукції диференціювання або апоптозу в популяціях клітин під впливом фармакологічно активних речовин, який відрізняється тим, що за співвідношенням між сигналами СН3 і СН2 резонансів, а саме за зменшенням відношення інтегральних площ сигналів СН2/СН3 визначається наявність процесу диференціювання у популяції клітин. (19) (21) u201013716 (22) 18.11.2010 (24) 10.06.2011 (46) 10.06.2011, Бюл.№ 11, 2011 р. (72) МИХАЙЛЕНКО ВІКТОР МИХАЙЛОВИЧ, ФІЛЬЧЕНКОВ ОЛЕКСІЙ ОЛЕКСІЙОВИЧ, ЗАВЕЛЕВИЧ МИХАЙЛО ПЕТРОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 60065 агентів, що можуть спричинити індукцію апоптозу або диференціювання. Одержаний технічний результат полягає у тому, що за такою ознакою, як співвідношення між сигналами СН3 і СН2 резонансів, що визначається за методом протонної ядерно-магнітнорезонансної спектроскопії, можна судити про наявність процесу диференціювання у популяції клітин. А саме, в разі типового процесу диференціювання відношення інтегральних площ сигналів СН2/СН3 зменшується. Клітини перещеплюваних ліній лейкозів людини культивували в середовищі RPMI-1640 з додаванням 10 % сироватки ембріонів корів. Клітини підтримували у вигляді суспензії та після досягнення максимальної щільності росту розводили свіжим середовищем у співвідношенні 1:2 - 1:3 для подальшого культивування. Клітини в логарифмічній фазі росту обробляли відомими індукторами диференціювання або апоптозу. Зразки клітин суспендували в 0,6 мл PBS-D2O і поміщали на лід. Спектри протонного магнітного резонансу реєстрували на ЯМР-спектрометрі Varian Mercury 300BB ("Varian", США) з робочою частотою 300 МГц при температурі 4 °С. Підсумовували по 128 сигналів спаду вільної індукції при 16 К; спектри накопичували із затримкою релаксації 10 с. За стандарт правив скляний капіляр з 0,1 % розчином триметилсіалопропіонової кислоти в D2O, сигнал якої відповідав 0 м.д. Стандартизовані області резонансів СН3- і СН2-протонів мобільних ліпідних доменів (МЛД), а також протонів холіну інтегрували за допомогою комп'ютерної програми VNMR 1 ("Varian"). Значення інтенсивності сигналів Н-ЯМР виражали в відносних одиницях, нормалізованих за сигналом СН3-протонів. Для оцінки рівня МЛД в клітинах розраховували співвідношення інтеграль 4 них величин метиленового і метилового (СН2/СН3) сигналів. Одержані результати співставляли з результатами морфологічного дослідження препаратів клітин, за якими оцінювали наявність диференціювання або апоптозу в популяції. Приклади практичного застосування корисної моделі Приклад 1. Клітини К-562 хронічної мієлоїдної лейкемії людини інкубували в присутності типового індуктора апоптозу вепезиду. Фіг. 1-2 подає ПМРспектри клітин після такого культивування, а також 1 інтактних клітин. Значення інтегральних площ НЯМР-сигналів в клітинах лінії К-562 при дії зазначеної речовини, яка індукує апоптоз, наведені в таблиці 1. Приклад 2. Клітини К-562 хронічної мієлоїдної лейкемії людини інкубували в присутності типового індуктора еритроїдного диференціювання диметилсульфоксиду (ДМСО). Фіг. 3-4 подає ПМРспектри клітин після такого культивування, а також 1 інтактних клітин. Значення інтегральних площ НЯМР-сигналів в клітинах лінії К-562 при дії зазначеної речовини, яка iндукує диференціювання, наведені в таблиці. Як бачимо, типовий індуктор апоптозу вепезид викликає в клітинах К-562 збільшення вмісту МЛД (за збільшенням співвідношення СН2/СН3) та зменшення рівня холіну. Навпаки, типовий індуктор еритроїдного диференціювання в цій системі, диметилсульфоксид, спричинює зменшення співвідношення СН2/СН3 та збільшення рівня холіну. Результати морфологічного дослідження препаратів клітин, пофарбованих за Папенгеймом, підтверджують наявність диференціювання або апоптозу у пробах, в яких визначали співвідношення СН2/СН3 методом ЯМР. Таблиця 1 Значення інтегральних площ Н-ЯМР-сигналів в клітинах лінії К-562 при дії речовин, які індукують апоптоз або диференціювання 1 Тип впливу Інтактні клітини К-562 + Вепезид (40 мкмоль/л, 18 год.) + ДМСО (2 %, 18 год.) Наведені приклади практичного використання запропонованого способу свідчать про те, що з його допомогою можна визначити наявність диференціювання у популяції клітин, які зазнали впливу фармакологічного препарату, за величиною співвідношення СН2/СН3 в порівнянні з такою в контролі. Таким чином, заявлений спосіб дозволяє за допомогою відомого методу протонної ЯМРспектроскопії визначити ще одну додаткову ознаку диференціювання клітин, яка безпосередньо пов'язана зі змінами стану мембран клітин в процесі диференціювання. Заявлений спосіб розширює можливості методу протонної ЯМР-спектроскопії, дозволяючи поширити сферу його застосування стосовно процесів диференціювання. (СН2)n/СН3 1,64±0,17 3,26±0,46 1,08±0,17 Н-ЯМР сигнали, м.д. Протони холіну, від. од. 0,75±0,11 0,22±0,03 1,82±0,03 Перелік фігур до заявки на корисну модель: Фіг. 1-2. ПМР-спектри клітин лінії К-562 при дії індуктора апоптозу Фіг. 1 - вепезид в дозі 40 мкг/мл, 18 год.; Фіг. 2 - інтактні клітини К-562 Фіг. 3-4. ПМР-спектри клітин лінії К-562 при дії індуктора диференціювання Фіг. 3 - інтактні клітини К-562; Фіг. 4 - 2 % ДМСО, 18 год. Джерела інформації 1. Blankenberg F.G., Katsikis P.D., Storrs R.W. et al. Quantitative analysis of apoptotic cell death using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy // Blood. - 1997. - Vol. 89, N 10. - P. 3778-3785. 2. Hakumaki J.M., Brindle K.M. Techniques: Visualizing apoptosis using nuclear magnetic 5 60065 resonance // Trends Pharmacol. Sci. - 2003. - Vol. 24, No. 3.-P. 146-149. 3. Carpinelli G., Podo G., Di Vito M. et al. Modulations of glycerophosphorylcholine and Комп’ютерна верстка І.Скворцова 6 phosphorylcholine in Friend erythroleukemia cells upon in vitro-induced erythroid differentiation: a 31P NMR study // FEBS Lett. - 1984. - Vol. 176, N1. - P. 88-92. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601