Спосіб отримання біомаси бактеріальних клітин сальмонел з використанням наночасток золота і срібла

Реферат: Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології та нанобіотехнології, зокрема до способів підвищення рівня накопичення біомаси бактеріальних клітин сальмонел у порівнянні з загальноприйнятими способами. Даний спосіб може бути використаний при виготовленні будьяких імунобіологічних засобів, що потребує використання при виготовленні вакцинних препаратів для імунопрофілактики сальмонельозів тварин і людей; сальмонельозних антигенів для серологічних і імуноферментних реакцій у діагностичних дослідженнях; протисальмонельозних, гіперімунних і аглютинуючих сироваток тощо. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб отримання біомаси бактеріальних клітин сальмонел на моделі виробничих штамів Salmonella Enteritidis штаму № 34 і штаму М та Salmonella Typhimurium штаму № 16, що включає виготовлення рідкого поживного середовища, культивування бактеріальної маси клітин шляхом додавання у рідке поживне середовище наночасток золота у діапазоні концентрації (0,12-0,97) мкг/мл за металом та наночасток срібла (0,27-2,16) мкг/мл за металом - із середнім розміром ~30 нм, щоб забезпечити ефективність способу. Даний спосіб знайде широке впровадження і використання у біотехнологічній промисловості при виготовленні імунобіологічних засобів, сировиною для яких є якісна біомаса бактеріальних клітин сальмонел, зокрема - при виготовленні вакцинних препаратів проти сальмонельозу тварин і людей; сальмонельозних антигенів для серологічних і імуноферментних реакцій у діагностичних дослідженнях; протисальмонельозних, гіперімунних і аглютинуючих сироваток тощо. UA 72608 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ БІОМАСИ БАКТЕРІАЛЬНИХ КЛІТИН САЛЬМОНЕЛ З ВИКОРИСТАННЯМ НАНОЧАСТОК ЗОЛОТА І СРІБЛА UA 72608 U UA 72608 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології та нанобіотехнології, зокрема до способів підвищення рівня накопичення біомаси бактеріальних клітин сальмонел у порівнянні з загальноприйнятими способами. Даний спосіб може бути використаний при виготовленні будьяких імунобіологічних засобів, що потребує використання при виготовленні вакцинних препаратів для імунопрофілактики сальмонельозів тварин і людей; сальмонельозних антигенів для серологічних і імуноферментних реакцій у діагностичних дослідженнях; протисальмонельозних, гіперімунних і аглютинуючих сироваток тощо. Загальновідомим та широко впровадженим є спосіб отримання біомаси бактеріальних клітин сальмонел шляхом висівання та культивування в рідких живильних середовищах. Існує спосіб накопичення біомаси сальмонел на середовищі СБК (гідролізат сухого білкового концентрату - 4,6 мас. %:, екстракту кормових дріжджів - 0,6 мас. %:, натрію фосфорнокислого двозаміщеного - 0,2 мас. %:, хлориду натрію - 0,45 мас. %:, води дистильованої - до 100 мас. %), готове середовище утримує амінний азот 150,0-210,0 мг% та має рН 7,6-7,8 [Патент РФ № 2124366, А61К39/02 Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и птиц]. Після 20 годин культивування на середовищі СБК . 8 3 накопичується біомаса сальмонел в концентрації 2,3 10 КУО/ см . Також існує спосіб накопичення біомаси сальмонел на середовищі на основі м'ясопептонного бульйону із додаванням сухого екстракту кормових дріжджів (5,0 г/л), калію (8,8 г/л), натрію фосфорнокислого двозаміщеного (1,4 г/л), 0,1 % розчину діамантового зеленого (5,0 мл/л) та 0,01 % розчину кристалічного фіолетового (10 мл/л), рН - 6,6-6,8, утримання амінного азоту 0,8-1,0 % [Панасовец О.П., Нетрусов А.И., Головина СВ., Алешня В.В., Журавлев П.В. Обоснование возможности применения новой жидкой среды накопления для выделения сальмонелл из водных объектов // ЖМЭИ, 2007. - № 4. - С. 54-56]. Культивування впродовж 20 . 8 3 годин дозволяє накопичити біомасу Salmonella Typhimurium в концентрації 4,1 10 КУО/ см . Недоліком наведених вище способів є досить громіздкі та кропіткі методики виготовлення середовищ та недостатньо висока концентрація біомаси сальмонел. Найбільш близьким за технічною суттю до рішення, що заявляється, є спосіб накопичення біомаси сальмонел на переварі Хоттінгера [Патент РФ №2086259, А61К39/116 Ассоциированная инактивированная вакцина против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза мелкого рогатого скота]. За умов застосування цього способу до перевару Хоттінгера додають 40 % розчин глюкози до концентрації 0,1-0,2 %. Культивування впродовж 18-20 годин дозволяє накопичити сальмонели сировару Salmonella Typhimurium в . 3 концентрації 6 1 КУО/ см . За цим способом виготовляють рідке поживне середовище та культивують бактеріальну масу клітин. Недоліком цього рішення є недостатньо висока концентрація біомаси сальмонел. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб отримання біомаси бактеріальних клітин сальмонел на моделі виробничих штамів Salmonella Enteritidis штаму № 34 і штаму М та Salmonella Typhimurium штаму № 16, що включає виготовлення рідкого поживного середовища, культивування бактеріальної маси клітин шляхом додавання у рідке поживне середовище наночасток золота у діапазоні концентрації (0,12-0,97) мкг/мл за металом та наночасток срібла - (0,27-2,16) мкг/мл за металом - із середнім розміром ~30 нм, щоб забезпечити ефективність способу. У порівнянні з прототипом у стандартному поживному середовищі ("контроль") рівень . 8 інтенсивності накопичення біомаси клітин роду Salmonella складає не більш ніж ((6,5-7,5) 10 ) 3 КУО/ см , а за умов додавання до середовища наночасток золота максимальний відсоток приросту біомаси сягає у середньому 27,8 %, а наночасток срібла - 21,4 % відповідно, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Виготовлення поживного середовища з наночастками золота. Як джерело амінного азоту використовують будь-яке рідке поживне середовище, що є стандартним і підходить для культивування та накопичення біомаси бактеріальних клітин сальмонел. До рідкого поживного середовища за умов асептики додають колоїдні дисперсії наночасток золота із середнім розміром ~30 нм у співвідношенні 4:1 у діапазоні концентрацій (0,12-0,24-0,48-0,97-1,93)мкг/мл за металом за температури (37,0±1,0)°С. Середовище у подальшому піддають автоклавуванню за 0,7 атм; з метою перевіряння на стерильність витримують за температури (37,0±1,0)°С впродовж 48 год. При отриманні біомаси бактеріальних клітин з наночастками срібла до рідкого поживного середовища додають колоїдні дисперсії наночасток срібла із середнім розміром ~30 нм у співвідношенні 4:1 у діапазоні концентрацій (0,27-0,54-1,08-2,16-4,32) мкг/мл за металом за 1 UA 72608 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 температури (37,0±1,0)°С. Середовище у подальшому піддають автоклавуванню за 0,7 атм; з метою перевіряння на стерильність витримують за температури (37,0±1,0)°С впродовж 48 год. Як стандартне ("контроль") використовують комерційне стандартизоване рідке середовище м'ясопептонний бульон (МПБ) та бульон Хоттінгера (рН=(7,2-7,6)); амінний азот (100-120) мг %. Після перевірки на стерильність в конічні колби з середовищем, що містить наночастки, та з 3 стандартним середовищем ("контроль") за умов асептики засівають по 1 см суспензії добової культури Salmonella Enteritidis штаму № 34 і штаму М та Salmonella Typhimurium штаму № 16 з відомою концентрацією та залишають для інкубації. Інкубацію бактеріальних культур дослідних штамів проводять за температури (37,0±1,0)°С впродовж 24 год. Бактеріальні клітини Salmonella Enteritidis штаму № 34 і штаму М та Salmonella Typhimurium . 8 3 штаму № 16 накопичуються у середньому до (9,0 10 ) колоній утворюючих одиниць у 1 см 3 (КУО/ см ) в залежності від рідкого поживного середовища, що було вибрано як стандартне ("контроль"). Як "холосту" пробу вважають зразок рідкого поживного середовища з вмістом та без наночасток металів. Приклад 1. Визначення інтенсивності приросту біомаси культур клітин Salmonella виробничих штамів після інкубації у рідкому поживному стандартному середовищі ("контроль"). Після інкубації культур клітин Salmonella Enter itidis штаму № 34 і штаму М та Salmonella Typhimurium штаму № 16 у рідкому поживному стандартному середовищі ("контроль") 3 відбирають по 1 см суспензії біомаси і визначають її оптичну густину через певні проміжки часу: 3, 6, 9, 12 і 24 години проти "холостої" проби спектрофотометричним методом за довжини хвилі 630 нм. Отримані результати виражають графічно кінетичними кривими, що наведені на фіг. 1-8 3 перераховуючи оптичну густину у КУО/см за даними попередньо побудованих калібрувальних кривих. Аналіз отриманих результатів свідчить, що у процесі культивування у стандартному середовищі було отримано біомасу клітин Salmonella дослідних штамів, значення інтенсивності . 8 накопичення якої дорівнювало у середньому для Salmonella Typhimurium - ((6,4-6,6) 10 ) 3 . 8 3 КУО/см та Salmonella Enteritidis - ((7,2-7,4 10 ) КУО/см відповідно (див фіг. 1-8). Приклад 2. Визначення інтенсивності приросту біомаси культур клітин Salmonella виробничих штамів після інкубації у рідкому поживному середовищі з вмістом наночасток золота і срібла у порівнянні зі стандартним середовищем ("контроль"). Після інкубації культур клітин Salmonella Enteritidis штаму № 34 і штаму М та Salmonella Typhimurium штаму № 16 у 3 рідкому поживному середовищі з вмістом наночасток певних металів відбирають по 1 см суспензії біомаси і визначають її оптичну густину через певні проміжки часу: 3, 6, 9, 12 і 24 години проти "холостої" проби спектрофотометричним методом за довжини хвилі 630 нм. Отримані результати виражають графічно кінетичними кривими, що наведені на фіг. 1-8 3 перераховуючи оптичну густину у КУО/см за даними попередньо побудованих калібрувальних кривих. Аналіз отриманих результатів свідчить, що у процесі культивування у рідкому поживному середовищі з вмістом наночасток золота було отримано біомасу клітин Salmonella, значення інтенсивності накопичення якої перевищували такі у "контролі" у середньому для Salmonella Typhimurium та Salmonella Enteritidis дослідних штамів на (25,07±1,13) % і . 8 3 дорівнювали ((8,5-9,6) 10 ) КУО/см (див фіг. 1-4. У процесі культивування у рідкому поживному середовищі з вмістом наночасток срібла було отримано біомасу клітин Salmonella, значення інтенсивності накопичення якої перевищували такі у "контролі" у середньому для Salmonella Typhimurium та Salmonella Enteritidis дослідних штамів на (16,70±0,45) % і дорівнювали ((8,4. 8 3 8,9 10 ) КУО/см (див фіг. 1-8). Даний спосіб знайде широке впровадження і використання у біотехнологічній промисловості при виготовленні імунобіологічних засобів, сировиною для яких є якісна біомаса бактеріальних клітин сальмонел, зокрема - при виготовленні вакцинних препаратів проти сальмонельозу тварин і людей; сальмонельозних антигенів для серологічних і імуноферментних реакцій у діагностичних дослідженнях; протисальмонельозних, гіперімунних і аглютинуючих сироваток тощо. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб отримання біомаси бактеріальних клітин сальмонел з використанням наночасток золота і срібла, що включає виготовлення рідкого поживного середовища, культивування бактеріальної маси клітин сальмонел, який відрізняється тим, що у рідке поживне середовище додають наночастки золота у діапазоні концентрації (0,12-0,97) мкг/мл за металом та наночастки срібла (0,27-2,16) мкг/мл за металом із середнім розміром ~30 нм. 2 UA 72608 U 3 UA 72608 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4