Спосіб визначення сенсибілізації до нейроспецифічних білків (нсб) при нейротрансплантації алогенних прогеніторних нейроклітин фетального мозку

Реферат: Спосіб визначення сенсибілізації до нейроспецифічних білків (НСБ) при нейротрансплантації алогенних прогеніторних нейроклітин фетального мозку шляхом імунологічного дослідження. Через визначений термін після трансплантації (1 місяць) у реципієнтів забирають венозну периферичну кров, отримують сироватку крові, у якій досліджують вміст аутоантитіл до нейроспецифічних білків, а саме основного білка мієліну (ОБМ), білка S-100 та нейронспецифічної енолази (NSE) твердофазним імуноферментним методом за допомогою розробленої тест-системи для проведення імуноферментного аналізу антитіл до НСБ і специфічних антивидових кон'югатів вторинних антитіл. UA 75057 U (12) UA 75057 U UA 75057 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме імунології та трансплантології, і може бути використана у медицині для скринінгу гуморальних аутоімунних реакцій до нейроантигенів у реципієнтів нейротрансплантату алогенних прогеніторних нейроклітин, що необхідно для прогнозування імунообумовлених ускладнень при лікуванні захворювань центральної нервової системи (ЦНС) за допомогою нейротрансплантації алогенних прогеніторних нейроклітин фетального мозку у віддалений термін після трансплантації. Сучасна стратегія трансплантації нейрогенних стовбурових клітин (НСК) та нейрогенних прогеніторних клітин (НКП) для заміщення втрачених або порушених функцій ЦНС потребує тривалого виживання пересаджених клітин та інтеграції з системою реципієнта, а також відсутності несприятливих побічних наслідків. Необхідно враховувати роль імунної системи як безпосередньо в процесі втручання при трансплантації, так і у відповідь на пересаджувані клітини. Можливою здатністю алогенних НСК і НКП викликати імунну активацію у віддаленому періоді після трансплантації не можна нехтувати: НСК людини розпізнаються і викликають імунну відповідь в ало- і ксеногенних системах ex vivo, тобто вони мають імунологічний потенціал, рівень якого є достатнім для активації периферичних лімфоцитів реципієнта [1]. Разом з тим, залишається невирішеною проблема антигенних властивостей НСК та НКП in vivo. Одним з шляхів вирішення проблеми є оцінка нейроспецифічних імунних реакцій при нейротрансплантації алогенних фетальних НКП. У теперішній час запропоновані і використовуються різні способи дослідження нейроспецифічних імунних реакцій. Як правило, ці способи передбачають застосування імуноферментних методів дослідження, загальний принцип яких полягає в тому, що матеріалом для дослідження є біологічні рідини, які тестують на наявність антитіл (антигенів). Принцип твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА) полягає в тому, що антитіла тестованого зразка взаємодіють з іммобілізованим на твердій фазі антигеном, потім фіксують на собі антивидові антитіла (вторинні), кон'юговані з ферментом пероксидазою хріну. Кількість зв'язаного кон'югата виявляється за допомогою хромогенного субстрату, причому інтенсивність забарвлення, що розвивається, пропорційна кількості антитіл у зразках. Прототипом способу, що заявляється, вибрано дослідження Пічкура Л.Д. і Цимбалюка В.І. (2007) [2]. Автори досліджували наявність аутоімунітету до нейробілків у хворих після лікування органічних уражень центральної нервової системи з використанням алогенних ембріональних нейроклітин шляхом ін'єкційного ендолюмбального введення хворому. Для цього хворих до лікування обстежували з метою виявлення ознак аутоімунітету до нейробілків. За наявності таких ознак одноразово внутрішньовенно вводили алогенні ембріональні клітини печінки. Після повторного імунологічного обстеження, у разі відсутності ознак автоімунітету до нейробілків, трансплантували алогенні ембріональні нейроклітини у вигляді клітинної суспензії. Цей спосіб, спрямований на скринінг хворих з органічними ураженнями ЦНС перед запланованим введенням алогенних НКП на наявність аутоімунних реакцій до нейроантигенів, є адекватним, сучасним і доступним. До недоліків цього способу можна віднести наступне: 1) він не враховує можливість розвитку нейроаутоімунних реакцій у віддаленому періоді після трансплантації; 2) він описаний для одного способу введення трансплантованих клітин; 3) він описаний для одного біологічного виду (людини) і обмежує широке застосування цього способу для експериментальних досліджень на тваринах. Задачею запропонованої корисної моделі є визначення гуморальних аутоімунних реакцій до нейроантигенів у реципієнтів нейротрансплантату алогенних прогеніторних нейроклітин фетального мозку, яке б адекватно відображало розвиток гуморальної аутоімунної відповіді, що відбувається при алогенній нейротрансплантації в організмі реципієнта (експериментальних тварин, людини) при різних способах введення трансплантованих клітин, а також відносна економічність, малозатратність і широкодоступність. Поставлена задача вирішується тим, що через визначений термін після трансплантації (1 місяць) у реципієнтів нейротрансплантату алогенних прогеніторних нейроклітин забирають венозну периферичну кров, отримують сироватку крові, у сироватці периферичної крові досліджують вміст аутоантитіл до нейроспецифічних білків, а саме основного білка мієліну (ОБМ), білка S-100 та нейронспецифічної енолази (NSE) твердофазним імуноферментним методом за допомогою розробленої тест-системи для проведення імуноферментного аналізу антитіл до НСБ і специфічних антивидових кон'югатів вторинних антитіл. А саме, у реципієнта нейротрансплантації алогенних прогеніторних нейроклітин через визначений термін після нейротрансплантації (1 місяць) забирають венозну периферичну кров, отримують сироватку крові та проводять імуноферментний аналіз (ІФА) із визначенням вмісту у сироватці крові антитіл до НСБ, а саме основного білка мієліну (ОБМ), білка S-100 та нейронспецифічної енолази (NSE), із використанням розробленої тест-системи для проведення 1 UA 75057 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ІФА антитіл до НСБ і специфічних антивидових кон'югатів вторинних антитіл. Принцип дослідження сенсибілізації до нейроспецифічних білків (НСБ) при нейротрансплантації алогенних прогеніторних нейроклітин (НКП) фетального мозку базується на тому, що алогенні донорські фетальні НКП (Е13-15) після введення реципієнту індукують гуморальну аутоімунну відповідь до нейроспецифічних антигенів [3-6]. Корисна модель, що пропонується, дозволяє удосконалити існуючий прототип. Використання розробленої тест-системи визначення вмісту антитіл до НСБ надає можливість адекватної реєстрації специфічної аутоімунної відповіді до нейроантигенів - ОБМ, S-100, NSE, що є маркерами нейронів та гліальних клітин, та проводити моніторинг динаміки рівня гуморальної аутоімунної відповіді у реципієнтів алогенних прогеніторних нейроклітин у різні терміни після нейротрансплантації. Спосіб дозволяє оцінити вказані показники при різних видах трансплантації (внутрішньомозкове, внутрішньоочеревинне та інші способи введення прогеніторних нейроклітин). Використання специфічних антивидових кон'югатів вторинних антитіл (проти імуноглобулінів класу G щура, миші, кроля, людини) дозволяє провести діагностику аутоімунної відповіді до нейроантигенів та оцінити ризик імунообумовлених ускладнень в експерименті на тваринах та у людей при лікуванні неврологічних захворювань методом нейротрансплантації прогеніторних нейроклітин фетального мозку. Використання сироватки крові як матеріалу для дослідження робить пропонований спосіб відносно економічним і широкодоступним. Спосіб виконується наступним чином. У реципієнта нейротрансплантації алогенних прогеніторних нейроклітин через визначений термін після нейротрансплантації (1 місяць) забирають венозну периферичну кров, отримують сироватку крові та проводять ІФА із визначенням вмісту антитіл до НСБ у сироватці крові. Підготовка планшетів і сорбція антигену (НСБ). Антиген іммобілізують на твердій фазі (планшетах) в концентрації 10 мкг/мл; в кожну лунку планшета вносять по 100 мкл розчину антигену. Сорбція антигена триває 18-20 год. при 4 ºС і проводиться: ОБМ - у цитратно-фосфатному буфері 0,1 М, рН 6,0; S-100 і NSE - у карбонатно-бікарбонатному буфері 0,1 Μ з рН 9,6. Видалення антигену, що не зв'язався, а також розведення всіх реагентів і наступне видалення компонентів, що не зв'язалися, проводять тричі з використанням фосфатного буферу 0,01 М, рН 7,4 з додаванням 0,05 % твіна-20. Для заповнення місць, що не зв'язалися, з метою блокування подальшого неспецифічного зв'язування сайтів, в лунки вносять 1 % БСА. Підготовка дослідних і контрольних сироваток. Досліджувані і контрольні зразки розводять у 100 разів, для чого у комірки допоміжного планшету вносять по 1 мл фосфатного буферу 0,01 М, рН 7,4 і додають по 10 мкл суцільної сироватки, ретельно перемішують. Приготування розчину кон'югату. Кон'югат антивидових імуноглобулінів з пероксидазою розводять фосфатним буфером 0,01 М, рН 7,4 у співвідношенні 1:20. Приготування субстратного розчину. 80 мг аміносаліцилової кислоти розчиняють при 70 °С у 100 мл води. Безпосередньо перед використанням рН розчину доводять до 6,0 1 М розчином їдкого натру NaOH. На кожні 9 мл отриманого розчину додають 1 мл 0,05 % розчину пероксиду водню Η2О2. Проведення ІФА. 1. Досліджувані та контрольні зразки сироватки вносять у розведенні 1:100 по 100 мкл у комірки планшета із сорбованим антигеном. Інкубують 2 год при 37 °С або 24 год при 4 °С. 2. Тричі відмивають фосфатним буфером. 3. Вносять по 100 мкл розчину кон'югату антивидових імуноглобулінів з пероксидазою в робочому розведенні. Кон'югат інкубують протягом 1 год при 37 °С. 4. Тричі відмивають фосфатним буфером. 5. В кожну комірку планшета вносять по 100 мкл ферментного субстрату (0,08 % розчин 5аміносаліцилової кислоти з 0,05 % пероксиду водню). Інкубують 40 хв. при 20 °С. 6. Зупиняють реакцію додаванням 100 мкл стоп-реагенту (1 Μ NaOH). 7. Рівень аутоантитіл визначають методом спектрофотометрії в аналізаторі імуноферментному, вимірюючи оптичну густину при довжині хвилі 450 нм. Оцінка результатів. Розраховують значення оптичної густини в комірках із дослідними і контрольними зразками і виражають в умовних одиницях У.О. (У.О.=оптична густина проби × ступінь розведення досліджуваного зразка). При застосуванні описаного способу визначення рівня аутоантитіл до ОБМ, S-100 та NSE в сироватках крові мишей-реципієнтів C57BL/6 з внутрішньомозковим (n=15) та внутрішньоочеревинним (n=15) введенням алогенних фетальних НКП (Е13-15) мишей-донорів СВА, а також контрольних груп мишей (інтактні C57BL/6 (n=15)) встановлено достовірне 2 UA 75057 U 5 10 15 20 25 30 35 40 підвищення рівня аутоантитіл до нейроантигенів у тварин з внутрішньомозковим алотрансплантатом фетальних НКП (Е13-15), яке досягає найбільшого рівня у віддалений період на 37-у добу після трансплантації, що дозволяє припускати, що поряд з антитілами до алоантигенів в реакціях імунного відторгнення можуть брати участь також аутоантитіла до нейроантигенів, які виявляються в різні терміни після алотрансплантації [3, 4]. Показано, що на відміну від тварин з внутрішньомозковим алотрансплантатом фетальних НКП (Е13-15), у тварин з внутрішньомозковим сингенним трансплантатом фетальних НКП (Е13-15) не зареєстрована гуморальна аутоімунна відповідь до нейроспецифічних антигенів [5]. Запропонованим способом також досліджено рівень аутоантитіл до НСБ після алогенної внутрішньомозкової трансплантації НКП у кролів [6]. Спосіб, що пропонується, має переваги перед прототипом, бо використання пропонованого способу визначення сенсибілізації до нейроспецифічних білків (НСБ) в нейрохірургії дозволить провести діагностику аутоімунної відповіді до нейроантигенів та оцінити ризик імунообумовлених ускладнень у віддалений термін після нейротрансплантації прогеніторних нейроклітин фетального мозку при захворюваннях ЦНС. В порівнянні із прототипом запропонований спосіб має ряд переваг: - дозволяє оцінити можливість розвитку нейроаутоімунних реакцій у віддаленому періоді після трансплантації; - дозволяє проводити скринінг при різних способах введення трансплантованих клітин; - розширює застосування цього способу для експериментальних досліджень на тваринах (щури, миші, кролі). Література: 1. Ubiali F., Nava S., Nessi V. et al. Allorecognition of human neural stem cells by peripheral blood lymphocytes despite low expression of MHC molecules: role of TGF-beta in modulating proliferation. Int.Immunol. 2007; 19(9): 1063-1074. 2. Пічкур Л.Д., Цимбалюк B.I. Спосіб лікування органічних уражень центральної нервової системи з використанням алогенних ембріональних нейроклітин // Патент на корисну модель UA № 22507 U. - 25.04.2007. - Бюл. № 5. 3. Лісяний МЛ., Любич Л.Д. Особливості розвитку імунної відповіді на внутрішньомозкове введення алогенних фетальних нейроклітин в експерименті // Імунологія та алергологія. - 2009. - №4. - С. 99-109. 4. Лісяний М.І., Любич Л.Д. Динаміка імунної відповіді на ало- та тканинні антигени фетальних нейроклітин в експерименті // Імунологія та алергологія. - 2010. - № 3, 4. - С. 104-111. 5. Любич Л.Д. Визначення антитілоутворення до нейроспецифічних білків (НСБ) при внутрішньомозковому введенні сингенних та алогенних фетальних нейроклітин-прекурсорів (НКП) // Імунологія та алергологія. Наукаіпрактика. - 2011. - № 2. - С. 97-102. 6. Лісяний М.І., Любич Л.Д., Черченко А.П., Верхоглядов Ю.П. Дослідження рівня аутоантитіл до нейроспецифічних білків у кролів після алогенної внутрішньомозкової трансплантації ембріональних клітин-попередників нервової системи // Фізіологічний журнал. - 2006. - Т. 52, № 3. - С. 64-69. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб визначення сенсибілізації до нейроспецифічних білків (НСБ) при нейротрансплантації алогенних прогеніторних нейроклітин фетального мозку, що включає імунологічне дослідження, який відрізняється тим, що через визначений термін після трансплантації (1 місяць) у реципієнтів нейротрансплантату алогенних прогеніторних нейроклітин забирають венозну периферичну кров, отримують сироватку крові, у сироватці периферичної крові досліджують вміст аутоантитіл до нейроспецифічних білків, а саме основного білка мієліну (ОБМ), білка S100 та нейронспецифічної енолази (NSE) твердофазним імуноферментним методом за допомогою розробленої тест-системи для проведення імуноферментного аналізу антитіл до НСБ і специфічних антивидових кон'югатів вторинних антитіл. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3