Спосіб підвищення активності інтерферону

Реферат: Спосіб підвищення активності інтерферону включає в себе визначення антивірусної активності інтерферону. При цьому в суспензію інтерферону вносять наночастки діоксиду церію з позитивним зарядом. UA 77914 U (12) UA 77914 U UA 77914 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до одержання нанобіотехнологічних комплексів і може бути використаний в медицині, ветеринарії. Відомо що вірусні хвороби, особливо такі як СНІД, гепатити, грип, герпетичні інфекції та різні види онкологічних новоутворень завдають значної шкоди здоров'ю людини. Боротьба з такими захворюваннями за допомогою специфічних засобів як правило є високозатратною і не завжди високоефективною у випадку швидкої генетичної мінливості збудників. Для успішної терапії таких захворювань необхідне застосування високоефективних препаратів з широким спектром дії. Перспективним в цьому плані є препарати на основі інтерферонів - низькомолекулярних білків, які проявляють противірусну, імуномодулюючу, атипроліферативну та інші активності і до того ж підвищують загальну резистентність організму [1]. Недоліком більшості препаратів інтерферону є їх використання у великих дозах та короткий час (кілька годин) перебування у крові організму, що потребує частого їх внутрішньом'язового введення у високих дозах та підвищує ризик побічних ускладнень [2].Відомо, що при лікуванні вірусних та онкологічних захворювань шкіри та слизових оболонок людини (вірусні кон′юктивіти, герпетичні прояви, злоякісні лімфоми шкіри та інші) застосовують інтерферон місцево (локально) у формі мазі або гелів. Введення біологічно активного інтерферону у мазь або гельову основу дозволяє локально створити концентрації інтерферону у місці ураження [3]. Проте складний набір консервантів, які включаються до складу мазі або гелевої основи та інших допоміжних засобів може викликати у пацієнтів алергічні прояви, що значно обмежує терапевтичні можливості мазі (гелів) з інтерфероном. Відомо також композиції для ректального введення препаратів інтерферону у клізмах або супозиторіях [4].Проте цей засіб є не гігієнічним, незручний та викликає неприязнь, особливо у дітей. Для уникнення всіх вищезгаданих недоліків необхідно розробляти нові підходи до створення композицій інтерферонів нового покоління - за рахунок їх стабілізації та значного підвищення активності. Найбільш близьким до корисної моделі є запропонований нещодавно спосіб одержання модифікованої форми інтерферону з підвищеною активністю та пролонгованою дією [5] на основі мікрочасток водорозчинного хітозану різної молекулярної ваги з високою сорбційною ємністю. Проте у цьому способі одержання нової лікарської форми інтерферону є ряд недоліків, пов'язаних як зі складністю одержання полісахариду хітозану, так і із його стабільністю та розчинністю у воді при формуванні модифікованої форми інтерферону. У цьому напрямку значний інтерес представляють наночастки діоксиду церію, які останнім часом активно вивчаються з метою створення нових ефективних нанофармацевтичних препаратів для медицини. При цьому нанокристалічний діоксид церію в залежності від форми та розміру часток, їх заряду та рН середовища може проявляти антивірусні ефекти, антиоксидантні властивості та має низьку токсичність [6]. Задачею корисної моделі є створення високоефективного комплексу з пролонгованою дією та підвищеною активністю інтерферону на основі наночастинок діоксиду церію та рекомбінантного інтерферону - альфа. Поставлена задача вирішується тим, що використовують золь нанокристалічного діоксиду церію (НДЦ), який характеризується позитивним дзета-потенціалом та наявністю великої поверхні частинок розміром 5-6 нм (без стабілізатора). Такі параметри є сприятливими для специфічної адсорбції на них білкових макромолекул. Як дослідний препарат інтерферону використовували широко застосовуваний в клініці препарат рекомбінантного інтерферону-2в (офіційна назва "Лаферон"). Комплекс НДЦ з інтерферонами одержували шляхом застосування водних розчинів та відповідного золю в рівних пропорціях та з різними концентраціями вихідних речовин. Вивчення антивірусної активності комплексів проводили використовуючи загальноприйняту класичну модель: перещеплювана культура фібробластів, лінія L 929 та вірус індикатор (вірус везикулярного стоматиту шт. Індіана ВВС). До сформованого моношару клітин вносили загальноприйнятим методом різні концентрації інтерферону та НДЦ, через 24 години моношар клітин відмивали від середовища та інфікували його вірус-індикатором у дозі 100 ТЦД50. Облік результату характерної цитопатичної дії вірусу проводили через 24 години при умові 100 % життєздатності інтактних клітин (контроль клітин) та повній деструкції інфікованого вірусом моношару клітин (контроль дії вірусу). Технічним результатом корисної моделі є підвищення антивірусної активності препарату інтерферону шляхом внесення наночастинок діоксиду церію. При цьому в залежності від концентрації НДЦ забезпечується підвищення антивірусної активності інтерферону. 1 UA 77914 U 5 10 15 Приклад 1 Для формування моношару клітин в лунки планшет (96-луночні плати "Costar") вносили по 5 0,1 мл суспензії, яка містила 5 × 10 кл/мл культури фібробластів та інкубували при 37 °C в термостаті в атмосфері з вологістю 98 % та 5 % СO2. Як середовище росту використовували поживне середовище 199 з 5-10 % ембріональної сироватки телят, 25 мМ Hepes, 10 мМ глютаміну та антибіотики. На сформований моношар клітин наносили різні розведення інтерферону та НДЦ (окремо та спільно з інтерфероном). Через 24 години інкубації клітини відмивали від внесених компонентів та інфікували їх 100 ТЦД50 вірусу індикатору. Облік розвитку характерної цитопатичної дії вірусу проводили через 24 години при умові 100 % життєздатності інтактних клітин (контроль клітин) та повній деструкції моношару інфікованого вірусом. Визначення кількості живих клітин здійснювали після їх забарвлення кристалічним фіолетовим. Для цього з лунок видаляли над осад, а до клітин на 15 хв вносили 0,2 % розчин барвника. Потім барвник видаляли, клітини промивали проточною водою та висушували. Оптичну щільність зафарбованих клітин вимірювали загальноприйнятим методом на спектрофотометрі з вертикальним променем (Labsystem multiscan). ЦПД вірусу - індикатору вираховували за відношенням кількості живих клітин в досліді і контролі. Як свідчать результати, представлені в таблиці 1 антивірусна активність інтерферону значно підвищувалась в присутності НДЦ в залежності від його концентрації. Таблиця 1 Вивчення впливу НДЦ на активність інтерферону в культурі клітин L929 № / Препарати 1 2 3 4 5 ІФН МЕ/мл 2 5 × 10 2 5 × 10 2 5 × 10 2 5 × 10 2 5 × 10 НДЦ 0,1 мМ 1,0 мМ 10,0 мМ 50,0 мМ Титр ІФН МЕ/мл 2 5 × 10 3 1 × 10 3 3 × 10 4 2 × 10 4 2 × 10 20 25 Приклад 2 Як і в прикладі 1 використовували всі ті ж умови проведення досліду. В дослід брали культуру, перещеплювану культуру та вірус індикатор. На сформований моношар клітин вносили також розведення НДЦ та інтерферон в 3 концентрації 1 × 10 МЕ/мл. Як свідчать результати проведеного досліду антивірусна активність інтерферону значно підвищується в присутності НДЦ, в залежності від його концентрації. Таблиця 2 Вивчення впливу НДЦ на активність інтерферону в культурі клітин № / Препарати 1 2 3 4 5 30 35 40 ІФН МЕ/мл 3 5 × 10 3 1 × 10 2 1 × 10 3 1 × 10 3 1 × 10 НДЦ 0,1 мМ 1,0 мМ 10,0 мМ 50,0 мМ Титр ІФН МЕ/мл 3 1,5 × 10 3 3 × 10 3 6 × 10 4 3,2 × 10 4 3,0 × 10 Таким чином проведені дослідження свідчать про те що внесення наночастинок діоксиду церію та створення комплексного препарату інтерферону та НДЦ призводить до підвищення антивірусної активності ІФН в умовах in vitro. Джерела інформації: 1. Спивак Н.Я., Назаренко Л.Н, Михайленко О.Н. Интерферон и система мононуклеарных фагоцитов. К.: Фитосоциоцентр, 2002.-164 с. 2. Спивак Н.Я., Белоцкий С.М. Интерферон от молекулы до лекарства Физиол. Журнал 2007, №4. 3. Попов В.Ф. Лекарственные препараты интерферонов М.: 2002.-152 с. 4. Ершов Ф.И. Противовирусные препараты М.: Гиомед, 2006.-184 с. 5. Губайдулина А.А. Получение модифицированных форм интерферона обладающих пролонгированным действием Автореф. Дис. Канд. біолог. Наук 2010, 23 стр. 2 UA 77914 U 6. Щербаков А.Б, Жолобак Н.М., Иванов В.К., Третьяков Ю.Д., Спивак Н.Я. Наноматериалы на основе диокида церит свойства и перспективы использования в биологии и медицине. Биотехнология. - Т. 4. - № 1, 2011. - С. 9-28 5 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб підвищення активності інтерферону(ІФН), що включає в себе визначення антивірусної активності ІФН, який відрізняється тим, що в суспензію інтерферону вносять наночастки діоксиду церію з позитивним зарядом в концентрації 0,1-50,0 мМ, що значно підсилює біологічну активність інтерферону. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3