Спосіб отримання поліплоїдних форм світчграсу

Реферат: Спосіб отримання поліплоїдних форм світчграсу включає використання розчину колхіцину та висаджування рослин у ґрунт. При цьому як експлант використовують пагони світчграсу, які отримані у культурі in vitro, їх пересаджують на агаризоване середовище з колхіцином, культивують, для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають БАП, кінетин, цукрозу, а для укорінення - ІОК, НОК та цукрозу. UA 79702 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ПОЛІПЛОЇДНИХ ФОРМ СВІТЧГРАСУ UA 79702 U UA 79702 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, рослинництві, зокрема для створення вихідних матеріалів, розмноження і отримання розсади цінних селекційних матеріалів. Поліплоїдія (від греч. poly - багато, haploos - одинарний, eidos - вид) - збільшення диплоїдного числа хромосом шляхом додавання цілих хромосомних наборів. Статеві клітини мають гаплоїдний набір хромосом (n), а для зигот усіх соматичних клітин характерний диплоїдний набір (2n). У поліплоїдних форм відмічено збільшення числа хромосом, кратне гаплоїдному набору: 3n - триплоїд, 4n - тетраплоїд, 5n - пентанлоїд, 6n - гексаплоїд і т. д. Крім того, ці форми фенотипово відрізняються від диплоїдних, тому що із зміною числа хромосом змінюються і спадкові ознаки. В більшості поліплоїдні форми отримують штучно, використовуючи різні методи в тому числі і біотехнологічні. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є спосіб індукування поліплоїдії у райграсу (Пат. № 2080060. РФ, опубл. 23.05.91. Бюл. 19. А01Н 1/08. Способ индуцирования полиплоидии у рейграса). Згідно з цим способом як вихідний матеріал використовують рослини, які вирощені у польових умовах в фазі переходу конуса наростання в суцвіття (III етап органогенезу). Їх поміщають в спеціальні касети (300×50 мм). У касетах рослини зрізують на 10-20 мм від конуса наростання і занурюють у розчин 0,2 % колхіцину і 0,1 % папаїну. Обробку вегетуючих рослин проводять в термостаті або кліматичній камері за температури 24±2 °C протягом доби. Розчин на другу добу зливають з касет і рослини перевертають вниз та витримують при температурі 24±2 °C ще дві доби. В подальшому рослини висаджують у ґрунт. Вихід поліплоїдних рослин в середньому становить 62,0 %. Відомий і пропонований способи отримання поліплоїдних форм мають спільні ознаки: використання розчину колхіцину, висаджування рослин у ґрунт. Однак, слід відзначити, що за відомого способу отримують поліплоїдні рослини у райграсу за рахунок обробки вегетуючих рослин розчином колхіцину та папаїну, які ростуть у спеціальних касетах, що є токсично-небезпечним, трудомістким та економічно не доцільним. Крім того, додатково включено інкубування у термостаті рослин протягом доби. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб отримання поліплоїдних форм світчграсу, що дозволить забезпечити отримання 85,0 % поліплоїдних форм, удосконалити процес обробки та зменшити затрати, пришвидшити процес поліплоїдизації. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі індукування поліплоїдії у райграсу за експлант беруть рослини у фазі переходу конуса наростання в суцвіття, які вирощують у польових умовах. Їх поміщають в спеціальні касети (300×50 мм) та зрізають на 1020 мм від конуса наростання і занурюють у розчин (0,2 % колхіцину і 0,1 % папаїну) таким чином, щоб вузол кущіння знаходився по краю касети, а коренева система між полосами касет, щоб на неї не попадав розчин. Рослини обробляють в термостаті або кліматичній камері за температури 24±2 °C протягом доби. В подальшому розчин зливають з касет на другу добу і рослини перевертають вниз та витримують при температурі 24±2 °C ще дві доби для інтенсивного наростання, після чого їх висаджують у ґрунт. Вихід поліплоїдних рослин в середньому становить 62,0 %. Запропонований спосіб отримання поліплоїдних форм світчграсу включає використання культуральних пагонів світчграсу, які висаджують на агаризоване середовище за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням колхіцину 0,02 % за експозиції 36 годин, що забезпечує отримання виходу 85,0 % поліплоїдних форм. В подальшому рослини пересаджують на модифіковане живильне середовище (три пасажі). Після проведеної цитологічної оцінки відбирають цінні форми для укорінення. Для укорінення використовують модифіковане живильне середовище (НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрози 30 г/л). Новими відмінними від існуючого найближчого аналога ознаками є: - використання культуральних пагонів міскантусу; - концентрація колхіцину - 0,02 %; - експозиція - 36 годин; - мінеральна основа живильного середовища Мурасіге і Скуга; - для розмноження у середовище додавання БАП - 0,5 мг/л, кінетину - 1,0 мг/л та цукрози 30 г/л; - використання цукрози; - додавання для укорінення рослин НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрози 30 г/л. Відмінні від найближчого аналога ознаки при взаємодії з відомими дозволяють пришвидшити та отримати високий відсоток поліплоїдних форм (85,0 %), удосконалити та здешевити спосіб їх отримання, використовуючи біотехнологічні методи, зменшити додатковий етап інкубування у термостаті та не проводити обробку вегетуючих рослин. 1 UA 79702 U 5 10 15 20 Ефективність нового способу отримання поліплоїдних форм світчграсу вивчали на таких матеріалах: Kanlow, Dacotach, Nebraska, Sunburst, Alamo, Forestburg, Shelter, Cave-in-Rock, Carthage. Результатами досліджень встановлено, що для створення поліплоїдних форм доцільно використовувати біотехнологічні методи, які дозволяють значно пришвидшити процес отримання, завдяки скороченню певних етапів, та зменшити собівартість поліплоїдних рослин. Використання як експлантів культуральних рослин світчграсу дає можливість додавати у живильне середовище розчин колхіцину, що забезпечує зміну набору хромосом. Крім того, не потрібно проводити по вегетуючих рослинах розчином колхіцину трудомістку та токсичнонебезпечну обробку. Як видно із отриманих результатів, найоптимальнішим є використання 0,02 % розчину колхіцину за експозиції 36 годин, що забезпечує отримання 85,0 % поліплоїдних форм, що на 23 % вище, ніж у відомому способі. Спосіб отримання поліплоїдних форм світчграсу здійснюється таким чином: вихідним експлантом слугують культуральні пагони світчграсу. Для поліплоїдизації їх пересаджують на модифіковане агаризоване живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга, у яке додатково додають 0,02 % розчин колхіцину за експозиції 36 годин. Культивування проводять в термальних приміщеннях за температури 24±2 °C, освітленні 3000-4000 лк, відносній вологості 65-70 % та фотоперіоді - 16 годин. Після обробки колхіцином пагони пересаджують для розмноження на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням БАП - 0,5 мг/л, кінетину - 1,0 мг/л, цукрози - 30,0 г/л. В подальшому, для визначення плоїдності матеріалу, проводять цитологічну оцінку та відбирають потрібні форми. Поліплоїдні форми укорінюють на середовищі за прописом Мурасіге і Скуга із додаванням НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрози 30 г/л. Вихід поліплоїдних форм становить 85,0 %. 25 Таблиця Спільні та відмінні показники отримання поліплоїдних форм Показники Експлант Експозиція, години Концентрація, % Речовина для поліплоїдизації Касети, мм БАП мг/л Кінетин, мг/л ІОК мг/л НОК мг/л Цукроза, г/л Температура, °C Інкубування в темноті, доба Вихід поліплоїдних форм, % 30 Відомий спосіб рослини 24 0,2 і 0,1 колхіцин і папаїн 300 × 50 20,0 24±2 1 62,0 Запропонований спосіб культуральні пагони 36 0,02 колхіцин 0,5 1,0 0,6 0,8 30,0 24±2 85,0 Впровадження запропонованої корисної моделі дозволить пришвидшити та отримати високий відсоток поліплоїдних форм (85,0 %), удосконалити та здешевити спосіб їх отримання, використовуючи біотехнологічні методи, зменшити додатковий етап інкубування у термостаті та не проводити обробку вегетуючих рослин. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб отримання поліплоїдних форм світчграсу, що включає використання розчину колхіцину, висаджування рослин у ґрунт, який відрізняється тим, що як експлант використовують пагони світчграсу, які отримані у культурі in vitro, їх пересаджують на агаризоване середовище з колхіцином в концентрації 0,02 % та експозиції 36 годин, культивування проводять при 16годинному фотоперіоді за температури 24±2 °C з інтенсивністю освітлення 3000-4000 лк, відносній вологості 65-70 %, для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають БАП 0,5 г/л, кінетин 1,0 мг/л, цукрозу - 30,0 г/л, для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга додають ІОК і НОК - 0,6 і 0,8 мг/л та 30 г/л цукрози. 2 UA 79702 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3