Спосіб виготовлення гранул або пелет, які містять міцеліальні гриби

1. Спосіб виробництва гранул або пелет, які містять міцеліальні гриби родини Moniliales, який включає стадії: - відбору та вирощування міцеліальних грибів у придатному культуральному середовищі протягом заздалегідь заданого періоду часу, - змішування зазначеного культурального середовища, після зазначеного заздалегідь заданого періоду часу, з желеутворюючим агентом та принаймні одним носієм з одержанням суміші, - желювання зазначеної суміші за допомогою додавання по краплях розчину, що містить сіль кальцію, яке приводить до одержання жельованих пелет або гранул, які містять зазначені міцеліальні гриби, - сушіння зазначених жельованих пелет або гранул до вологості, яка становить 13-18 %. 2. Спосіб за п. 1, у якому зазначену стадію желювання виконують шляхом додавання по краплях зазначеної суміші до зазначеного розчину, який містить сіль кальцію. 3. Спосіб за п. 1 або 2, у якому зазначене культуральне середовище для міцеліальних грибів включає принаймні одне джерело вуглецю, вибране із групи, яка включає мелясу, солодовий екстракт та сахарозу, і принаймні одне джерело органічного азоту, вибране із групи, яка включає дріжджовий екстракт та "рідкий кукурудзяний екстракт". 4. Спосіб за п. 3, у якому зазначене принаймні одне джерело вуглецю становить від 70 до 85 мас. % 2 (19) 1 3 Даний винахід стосується галузі засобів захисту рослин. Зокрема, даний винахід стосується здійснюваному в промисловому масштабі способу виробництва гранул або пелет, які містять міцеліальні гриби, а точніше - гриби-нематофаги. У загальноприйняту практику все більшою мірою входить застосування мікроорганізмів та, зокрема, грибів як засобів захисту рослин. Продукти на основі грибів вже пропонуються на ринку для боротьби з комахами, фітопатогенними грибами та іншими паразитами сільськогосподарських культур. Наприклад, у патенті US 5811092 описані агенти-нематофаги, які призначені для боротьби з нематодами родів Meloidogyne, Hetherodera і Ditylenchus та які містять особливі штами Arthrobotrys conoides Dreschsler, міцеліального гриба. Зазначені нематоди викликають важкі хвороби рослин та грибні хвороби і можуть нанести великий економічний збиток, оскільки вони можуть привести до втрати 50-70% врожаю. Застосування грибів-нематофагів, як альтернативи звичайним протипаразитарним хімікатам (наприклад, метилброміду, трихлорнітрометану, дихлорпропену і т.п.), що вносяться у ґрунт до вирощування рослин, або карбаматам, що вносяться на культурні рослини, дозволяє усунути серйозні недоліки, такі як стерилізація ґрунту, порушення екологічної рівноваги та можлива токсичність для людей і тварин. Тому гриби-нематофаги є особливо придатними для застосування в землеробстві, у якому використовуються тільки органічні добрива, але в даний час існують значні труднощі в їх виробництві в промисловому масштабі з високими виходами та у формі, яка забезпечує їх задовільне зберігання до застосування. Дійсно в попередньому рівні техніки грибинематофаги приготовляють у придатному культуральному середовищі. Потім гриби-нематофаги разом з їх культуральним середовищем або безпосередньо розкидають по оброблюваному ґрунту або до застосування зберігають у культуральному середовищі. Однак за цих умовах зберігання гриби-нематофаги продовжують досить швидко розмножуватися та через нетривалий період часу (1-2 тижні), коли виснажаться джерела поживних речовин, вони гинуть. Завданням даного винаходу була розробка способу виробництва міцеліальних грибів у промисловому масштабі з високими виходами, при низькій вартості й у формі, яка забезпечує їх стабільність та життєздатність протягом тривалих періодів зберігання до внесення на оброблюваний ґрунт. Ідея вирішення такої технічної задачі полягала у включенні міцеліальних грибів у придатні тверді композиції, які забезпечать їх стабільність та життєздатність протягом тривалого періоду часу. У зв'язку із цим показано, що гранульовані композиції або пелети, які містять міцеліальні гриби, є придатними для задач даного винаходу. 89179 4 У світлі викладеного вище технічна задача, яка лежить в основі даного винаходу, вирішена за допомогою способу виробництва гранул або пелет, які містять міцеліальні гриби, що включає стадії: - відбору та вирощування міцеліальних грибів у придатному культуральному середовищі протягом заздалегідь заданого періоду часу, - змішування зазначеного культурального середовища, після зазначеного заздалегідь заданого періоду часу, з желеутворюючим агентом та принаймні одним носієм з одержанням суміші, - желювання зазначеної суміші за допомогою проводжуваної шляхом додавання по краплях взаємодії з розчином, що містить сіль кальцію, яка приводить до одержання жельованих пелет або гранул, які містять зазначені міцеліальні гриби, - сушіння зазначених жельованих пелет або гранул до вологості, що становить 13-18%. Даний винахід буде додатково описано за допомогою ряду типових варіантів здійснення, наведених для ілюстрації, а не для накладення обмежень. До переходу до ілюстративних прикладів може виявитися корисним опис матеріалів, які використовуються при виконанні різних стадій виробничого способу, пропонованого в даному винаході. Міцеліальні гриби, які застосовуються в способі, пропонованому в даному винаході, належать до родини Moniliales, кращі міцеліальні гриби Arthrobotrys conoides Dreschsler. Культуральне середовище для міцеліальних грибів включає принаймні одне джерело вуглецю, вибране із групи, яка включає мелясу, солодовий екстракт та сахарозу, і принаймні одне джерело органічного азоту, вибране із групи, яка включає дріжджовий екстракт та "рідкий кукурудзяний екстракт". Бажано, щоб зазначене вище принаймні одне джерело вуглецю становило від 70 до 85мас.% у перерахунку на суху масу культурального середовища та зазначене вище принаймні одне джерело органічного азоту становило від 15 до 30мас.% у перерахунку на суху масу культурального середовища. Культуральне середовище також може включати джерело неорганічного азоту, яке являє собою нітрати або солі амонію. Зазначене вище джерело неорганічного азоту звичайно поступово додають у культуральне середовище під час вирощування грибів у кількості, яка не перевищує 10мас.% у перерахунку на суху масу культурального середовища, і звичайно від 5 до 8мас.%. Краща композиція культурального середовища містить 75-85% солодового екстракту та 1525% дріжджового екстракту, значення наведені в мас.% у перерахунку на суху масу культурального середовища. Інше краще культуральне середовище містить 60-65% меляси, 10-15% сахарози, 10-15% рідкого кукурудзяного екстракту та 10-15% дріжджового екстракту. Бажано, якщо таке культуральне середовище додатково містить від 5 до 8% джерела неорганічного азоту, краще - вторинного кислого фосфату амонію. 5 89179 6 Ще одне краще культуральне середовище місКращим носієм є Celaton FPM 0,08. Це - кометить 2 джерела вуглецю, тобто солодовий екстрційний продукт на основі оболонок діатомових ракт у кількості, яка становить 25-30%, і мелясу в водоростей (одноклітинних кремнієвих водороскількості, яка становить 40-45%, а також рідкий тей) з розміром частинок близько 0,8мкм. Ця речокукурудзяний екстракт у кількості, яка становить вина може вбирати певну кількість води й тому 25-30%. сприяє наданню необхідного об'єму готовим граСолодовий екстракт одержують шляхом пронулам. рощення зерен злаків (звичайно ячменю). Під час З типів борошна, які можна використовувати пророщення утворюються особливі ферменти як носії в даному винаході, найбільш кращим є (амілази), які забезпечують перетворення крохмакукурудзяне борошно. Воно є натуральним продулю в цукор. Солодовий екстракт містить приблизктом, здатним вбирати кількість води, що набагато но 60% мальтози, вітаміни та різні поживні мікроеперевищує її об'єм, і в даному конкретному випадлементи. ку також сприяє наданню необхідного об'єму готоМеляса є побічним продуктом цукрової промивим гранулам. Крім того, кукурудзяне борошно є словості та надходить у вигляді коричневоважливим джерелом поживних речовин для міцечорнуватої в'язкої рідини, яка містить 10% води, ліальних грибів, диспергованих у гранулах, і при їх 35% сахарози, 20% іншого цукру та 15% зольних зберіганні, і при їх розкиданні по оброблюваному речовин. ґрунту. Дріжджовий екстракт одержують аутолізом Зокрема, застосування кукурудзяного борошна Saccharomyces cerevisiae і він надходить у вигляді як джерела поживних речовин особливо бажано у блідо-жовтого порошку, добре розчинного у воді. випадку використання Arthrobotrys conoides Дріжджовий екстракт містить пептиди, вільні аміDreschsler, оскільки в цьому випадку несподівано нокислоти, пуринові та піримідинові основи, а тавиявилося, що гриби утворюють більшу кількість кож розчинні у воді вітаміни групи В. Дріжджовий пасток для нематод з наступним підвищенням екстракт має загальний вміст азоту, що дорівнює ефективності їх знищення. Цукри ефективно забезпечують життєздат10%, та вміст -амінового азоту, що дорівнює 5%. ність міцеліальних грибів при зберіганні внаслідок Рідкий кукурудзяний екстракт одержують шлястабілізації клітинних мембран. Із числа цукрів, які хом замочування зерен кукурудзи при 50°С протяможна використовувати в способі, пропонованому гом 24-48год у воді, яка містить діоксид сірки. Цей в даному винаході, особливо кращою є сахароза. реагент забезпечує гідроліз білкової структури, яка У даному винаході носії бажано додавати в оточує зерна крохмалю, і має ту перевагу, що закультуральне середовище за допомогою желеутпобігає розмноженню небажаних мікроорганізмів ворюючого агента. На практиці при використанні при замочуванні. Рідкий кукурудзяний екстракт розчину альгінату натрію як желеутворюючого має загальний вміст азоту, що дорівнює 7%, та агента носії краще додавати до зазначеного розвміст -амінового азоту, що дорівнює 1,7%, а тачину альгінату натрію в кількості, яка становить від кож містить 5% цукру, 4% калію, 3% фосфору та 6% до 22мас.% у перерахунку на масу розчину. В 17% інших неорганічних речовин. особливо кращому способі носії додають до розУ способі виробництва, пропонованому у дачину альгінату натрію в кількості, яка становить ному винаході, вирощування міцеліальних грибів у 15мас.% у перерахунку на масу розчину. зазначених вище культуральних середовищах У способі, пропонованому в даному винаході, бажано проводити протягом 5-10 діб при постійній желювання суміші, яка містить міцеліальні гриби температурі, яка дорівнює 23-30°С. та відповідне культуральне середовище, а також Желеутворюючий агент бажано являє собою активатор желювання та носії, краще виконувати розчин, який містить альгінат натрію в концентрашляхом додавання по краплях зазначеної суміші ції, яка дорівнює 1-2%, краще - 1,3мас.% у перерадо розчину солі кальцію. хунку на масу розчину. Такий розчин бажано доСіль кальцію краще вибирати із групи, яка давати в культуральне середовище міцеліальних включає хлорид кальцію та глюконат кальцію. грибів в об'ємному співвідношенні культуральне Концентрація солі кальцію в розчині становить від середовище:розчин альгінату, яке становить від 0,2 до 0,3Μ і у випадку хлориду кальцію переваж40:60 до 60:40. но дорівнює 0,25М. При підвищенні концентрації Як відомо, альгінат натрію може активувати солі кальцію желювання звичайно відбувається желювання рідкої суміші, до якої він доданий, у швидше. випадку взаємодії цієї суміші з розчином, який місЖельовані гранули або пелети, які утворютить солі кальцію. ються при взаємодії крапель зазначеної вище суВажливим моментом є додавання носіїв у куміші із заздалегідь приготовленим розчином солі льтуральне середовище. У даному винаході теркальцію, витримують у зазначеному вище розчині мін "носій" означає і речовину, яка забезпечує стапротягом заздалегідь заданого періоду часу, крабільність і/або яка надає поживні речовини грибам, ще - 2-3хв, щоб завершити желювання. Вилучення диспергованим у гранулах, так щоб вони залишажельованих гранул або пелет з розчину солі кальлися життєздатними при зберіганні й до викорисцію проводять звичайним чином, наприклад, фільтання, і "наповнювач", тобто речовину, яка надає труванням. гранулам необхідної консистенції та об'єму. Сушіння жельованих гранул або пелет можна Бажано, якщо зазначені вище носії вибирають з успіхом провести в стерильному потоці повітря із групи, яка включає діатомову землю, різні типи при температурі, яка дорівнює 25-30°С. Звичайно борошна та цукру. жельовані гранули або пелети, одержані желю 7 89179 8 ванням крапель суміші, доданої до заздалегідь з міцеліальними грибами Arthrobotrys conoides приготовленого розчину солі кальцію, мають волоDreschsler. гість, яка дорівнює 80-90%. Таку вологість зменПриклад 1 шують шляхом сушіння до значення, яке дорівнює Вирощування міцеліальних грибів проводили в 13-18%. При цьому гранули набувають необхідної реакторі об'ємом 2л, який містить 1,2л культураконсистенції та об'єму, чому також сприяють носії, льного середовища. які були раніше додані в культуральне середовиКраще, якщо реактор включає круглодонний ще. резервуар, оснащений лопатевою мішалкою, приБажано, щоб у способі, пропонованому в дастроями нагрівання та охолодження, пристроєм ному винаході, утворювалися гранули або пелети, подачі повітря, а також датчиками рН, О2 і темпеякі мають діаметр, який дорівнює 1-3мм, що заратури. безпечує поліпшений розподіл міцеліальних грибів Середовище містить 20г/л солодового екстрапо оброблюваному ґрунту. кту та 4г/л дріжджового екстракту та перед посівом Спосіб, пропонований у даному винаході, моконідій відповідних грибів його стерилізували. жна з успіхом здійснювати в промисловому масшКультуру інкубували протягом 6 діб після посітабі з використанням устаткування, яке є недорову при температурі, яка дорівнює приблизно 27°С. гим і яке легко спроектувати. Придатне Під час інкубації з культурального середовища устаткування, стисло описане нижче в даному вивідбирали проби для визначення сухої маси (г/л) і наході як необмежуючий приклад, включає реаккількості паростків (КУО/л). Для визначення сухої тор для вирощування необхідних міцеліальних маси 20мл культурального середовища фільтругрибів у придатному культуральному середовищі, вали, а потім сушили в сушильній шафі при 100°С змішувач, у якому желеутворюючий агент і носії протягом 24год. Кількість паростків визначали в змішуються з культуральним середовищем з утвоперерахунку на 1мл культуральних середовищ. ренням суміші, пристрої, придатні для завантаТаким чином, наприкінці інкубаційного періоду 9 ження відмірених кількостей суміші в придатні одержували майже 8г/л грибів, які містять 6×10 перфоровані елементи для формування крапель паростків/л. суміші, які мають заздалегідь заданий об'єм, резеПотім культуральне середовище, яке містить рвуар, який містить водний розчин солі кальцію, гриби, переносили в змішувач і в культуральне для збирання зазначених вище крапель і забезпесередовище додавали 1800мл водного розчину чення їх желювання, і сушильний апарат для суальгінату натрію концентрації 1,3мас.%, до якого шіння жельованих гранул або пелет, вилучених з доданий 6,6% розчин Celaton FPM 0,08 (у мас.% у резервуара, який містить водний розчин солі кальперерахунку на масу розчину). цію. Потім одержану суміш гомогенізували в зміПристрої для завантаження відмірених кількошувачі та після цього через перфоровану трубку стей суміші можуть, наприклад, являти собою пе(діаметр отвору 1,6мм) по краплях додавали в ристальтичну помпу або аналогічні пристрої, у ємність, яка містить 0,25Μ розчин хлориду кальяких перфорованими елементами можуть бути цію. трубки, на дні кожної з яких є отвір заздалегідь У такий спосіб одержували жельовані гранули заданого діаметра, наприклад, 1-4мм. зазначеної вище суміші, які витримували в розчині Важливо, щоб зазначене вище устаткування хлориду кальцію протягом 3хв. експлуатувалося в стерильних умовах, щоб виПо закінченні періоду витримування жельовані ключити забруднення мікроорганізмами, зокрема гранули відокремлювали декантацією та сушили шкідливими для використовуваних міцеліальних на конвеєрній стрічці до вологості, яка становить грибів. Речовини, які використовуються для здійс17%. Середній діаметр сухих гранул дорівнював нення способу, пропонованого в даному винаході, 2,2мм. зокрема речовини, які додаються у культуральне Середня кількість паростків у сухих гранулах, середовище в суміші, перед використанням також визначена відразу ж після їх формування, залиповинні бути належним чином стерилізовані. шалося практично такою ж, як і наприкінці інкубації Гранули або пелети, одержані способом, проміцеліальних грибів, що показувало, що після пропонованим у даному винаході, готові для застосуведення грануляції, пропонованої в даному винавання, і їх перевагою є те, що міцеліальні гриби, ході, зазначені вище паростки повністю зберегли які містяться в них, залишаються стабільними та життєздатність. життєздатними протягом тривалого періоду часу. Зазначені вище сухі гранули зберігали протяТаким чином, зазначені вище гранули або пелети гом 3 місяців при кімнатній температурі. По закінсамі забезпечують свій захист або збереження ченні періоду зберігання середня кількість життєпротягом тривалого періоду часу до використання здатних паростків становила 50% від кількості, й потім міцеліальні гриби зберігають життєздатвиявленої після формування гранул. ність, цілком задовільну для застосування, для Приклад 2 якого вони призначені. У прикладі 2 дослідження проводили за тією ж Тривалість зберігання гранул або пелет, прометодикою й при тих же експериментальних умопонованих у даному винаході, до їх використання вах, що й у прикладі 1, з тією відмінністю, що в становить більше 8 тижнів і звичайно становить культуральне середовище додавали 1800мл водвід 4 до 6 місяців. ного розчину альгінату натрію концентрації Наведені нижче приклади здійснення способу, 1,3мас.%, до якого доданий 6,6% розчин Celaton пропонованого в даному винаході, виконані з міFPM 0,08 та 3,3% кукурудзяного борошна (у мас.% целіальними грибами родини Moniliales та краще у перерахунку на масу розчину). 9 89179 10 Середній діаметр сухих гранул дорівнював FPM 0,08 та 3,3% кукурудзяного борошна і 5% 2,5мм і їх вологість становила 17%. сахарози (у мас.% у перерахунку на масу розчину). Середня кількість паростків у сухих гранулах, Середній діаметр сухих гранул дорівнював визначена відразу ж після їх формування, зали2,9мм і їх вологість становила 17%. шалося практично такою ж, як і наприкінці інкубації Середня кількість паростків у сухих гранулах, міцеліальних грибів, що показувало, що після провизначена відразу ж після їх формування, заливедення грануляції, пропонованої в даному винашалася практично такою ж, як і наприкінці інкубації ході, зазначені вище паростки повністю зберегли міцеліальних грибів, що показувало, що після прожиттєздатність. ведення грануляції, пропонованої в даному винаЗазначені вище сухі гранули зберігали протяході, зазначені вище паростки повністю зберегли гом 3 місяців при кімнатній температурі. По закінжиттєздатність. ченні періоду зберігання середня кількість життєЗазначені вище сухі гранули зберігали протяздатних паростків становила 90% від кількості, гом 3 місяців при кімнатній температурі. По закінвиявленої після формування гранул, що дозволяє ченні періоду зберігання середня кількість життєефективно застосовувати сухі гранули на ґрунті як здатних паростків становила 100% від кількості, засоби захисту рослин. виявленої після формування гранул, що дозволяє Приклад 3 ефективно застосовувати сухі гранули на ґрунті як У прикладі 2 дослідження проводили за тією ж засоби захисту рослин. методикою й за тих же експериментальних умоКрім того, у випадку застосування зазначених вах, що й у прикладі 1, з тією відмінністю, що в вище гранул гриби більш ефективно знищують культуральне середовище додавали 1800мл воднематоди внаслідок того, що гриби формують біного розчину альгінату натрію концентрації льшу кількість пасток для цих нематод. 1,3мас.%, до якого доданий 6,6% розчин Celaton Комп’ютерна верстка О. Рябко Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601